Name: חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: חקור חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בספירואידים תלת-ממדיים מקווי תאים סרטניים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי Seahorse. פרוטוקול זה מספק מודל פיזיולוגי עדיף לניסויים במונושכבות תאים ומאפשר מדידות רגישות ברמת ספירואיד בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.J.C נתמך על ידי פרס מקרה BBSRC MIBTP עם Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

ממצאים ותפוקות עיקריים מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של ספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות סדרה של קווי תאים שמקורם בסרטן עם מנתח XFe96 XF. שיטה מפותחת ומתוארת לטיפוח מהיר של A549, HepG2/C3A, MCF7 ו-SK-OV-3 כדוריים תאיים באמצעות טכנולוגיות דוחות תאים לצבירה כפויה. פרוטוקול זה נותן מענה לשיקולים רבים של בדיקת חילוף החומרים של הספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF, כולל (1) אופטימיזציה של פרוטוקולי תרביות ספרואידים וטיפול והעברה של ספרואידים למיקרו-לוחות בדיקה ספר...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

ההתקדמות במודלים חוץ גופיים במחקר הביולוגי התקדמה במהירות במהלך 20 השנים האחרונות. מודלים כאלה כוללים כיום אופנות של איברים על שבב, אורגנואידים וספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה, שכולם הפכו למוקד נפוץ לשיפור התרגום בין מחקרי in vitro ו-in vivo. השימוש במודלים מתקדמים במבחנה, במיוחד ספרואידים, משתרע על פני מספר תחומי מחקר, כולל הנדסת רקמות, מחקר בתאי גזע, סרטן וביולוגיה של מחלות 1,2,3,4,5,6,7, ובדיקות בטיחות, כולל טוקסיקולוגיה גנטית 8,9,10, טוקסיקולוגיה של ננו-חומרים11, 12,13,14, ובדיקות בטיחות ויעילות של תרופות 8,15,16,17,18,19.
מורפולוגיה תקינה של תאים היא קריטית לפנוטיפ ולפעילות ביולוגית. גידול תאים לכדי ספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה מאפשר לתאים לאמץ מורפולוגיה, פונקציה פנוטיפית וארכיטקטורה, הדומים יותר לאלה שנצפו in vivo אך קשים ללכידה באמצעות טכניקות קלאסיות של תרביות תאים חד-שכבתיות יותר. הן in vivo והן in vitro, תפקוד התאים מושפע ישירות מהמיקרו-סביבה התאית, שאינה מוגבלת לתקשורת תאית ותכנות (למשל, תצורות צומת תאים-תאים, הזדמנויות ליצור נישות תאים); חשיפת תאים להורמונים ולגורמי גדילה בסביבות המיידיות (למשל, חשיפה לציטוקין תאי כחלק מתגובה דלקתית); הרכב של מטריצות פיזיקליות וכימיות (למשל, האם תאים גדלים בפלסטיק בתרבית רקמה נוקשה או בסביבת רקמה אלסטית); והכי חשוב, כיצד חילוף החומרים התאי מושפע מתזונה וגישה לחמצן, כמו גם מעיבוד של תוצרי פסולת מטבולית כגון חומצה לקטית.
ניתוח שטף מטבולי הוא דרך רבת עוצמה לבחון את חילוף החומרים התאי בתוך מערכות מוגדרות במבחנה . באופן ספציפי, טכנולוגיית XF מאפשרת ניתוח של שינויים חיים בזמן אמת בביו-אנרגיה תאית של תאים ורקמות שלמים. בהתחשב בכך שאירועים מטבוליים תוך-תאיים רבים מתרחשים בסדר גודל של שניות עד דקות, גישות תפקודיות בזמן אמת הן בעלות חשיבות עליונה להבנת שינויים בזמן אמת בשטף המטבולי התאי בתאים שלמים וברקמות במבחנה.
מאמר זה מספק פרוטוקולים לטיפוח קווי תאים שמקורם בסרטן A549 (אדנוקרצינומה של הריאות), HepG2/C3A (קרצינומה הפטוצלולרית), MCF-7 (אדנוקרצינומה של השד) ו-SK-OV-3 (אדנוקרצינומה שחלתית) כמו במודלים ספרואידיים תלת-ממדיים במבחנה תוך שימוש בגישות של צבירה כפויה (איור 1). הוא גם (i) מתאר בפירוט כיצד לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות תלת-ממדיות בודדות באמצעות מנתח Agilent XFe96 XF, (ii) מדגיש דרכים לייעל את מבחני ה-XF באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים בודדים, ו-(iii) דן בשיקולים חשובים ובמגבלות של בדיקת חילוף החומרים הספרואידי התלת-ממדי באמצעות גישה זו. והכי חשוב, מאמר זה מתאר כיצד נאספים מערכי נתונים המאפשרים חישוב של קצב צריכת החמצן (OCR) כדי לקבוע זרחון חמצוני ובכך את תפקוד המיטוכונדריה בספרואידים תאיים. למרות שלא נותח עבור פרוטוקול זה, קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) הוא פרמטר נוסף הנמדד לצד נתוני OCR בניסויי XF. עם זאת, ECAR מתפרש לעתים קרובות בצורה גרועה או שגויה ממערכי נתונים של XF. אנו מספקים פרשנות לגבי המגבלות של חישוב ECAR בעקבות גישות בסיסיות של יצרן הטכנולוגיה.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>קו תאי קרצינומה של ריאות</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>XF מדיום בדיקה עם 1 מ"מ HEPES, ללא פנול אדום, נתרן ביקרבונט, גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>מכשיר למדידת שיעורי ספיגת חמצן ספרואידים בספרואידים בודדים</td></tr><tr><td>אנטימיצין A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>מעכב קומפלקס נשימה מיטוכונדריאלי III</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>מפרק פרוטנופור מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>מיקרו-פלייט שחור דופן</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655076</td><td>לבדיקות</td></tr> <tr><td>מבוססות פלואורסצנטיותמשטח דוחה תאים של CELLSTAR 96 מיקרו-לוחות באר U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>מיקרו-פלטות ליצירת ספרואידים</td></tr><tr><td>בדיקת כדאיות תאים תלת מימדית CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>לקביעת כדאיות התאים בספרואידים מיקרו-רקמות תלת מימדיים</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems מותג ביוטכנולוגיה</td><td>3439-100-01</td><td>דבק תאים מולקולרי לציפוי מיקרו-לוחות כדוריים XFe96 כדי להקל על הצמדת ספרואידים</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>תוסף לצמיחת תרבית תאים ומדיום בדיקת XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s מדיום נשר שונה (DMEM)</td> <td>מדיום תרבית 11885084 Gibco</td><td></td><td>עבור ספרואידים HepG2/C3A</td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ליבה EVOS XL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>מיקרוסקופ הדמיה ניגודיות</td></tr><tr><td>פאזה ערכת בדיקת מיקופלזמה</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>20-700-20</td><td>הקרנת מיקופלזמה בתרביות תאים</td></tr><tr><td>FIJI Is Just Image J</td><td></td><td></td><td>ניתוח תמונות שנאספו</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>תוסף למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>קו תאי קרצינומה בכבד, נגזרת משובטת של קו תאי האב HepG2</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>בדיקה למדידת לקטט בתוך מדיום תרבית ספאוריד</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (תמיסה של 200 מ"מ)Merk</td> <td>Life Sciences</td><td>תוסף G7513</td><td>לגידול תרבית תאים ובדיקת XF בינוני</td></tr><tr><td>M50 מיקרוסקופ סטריאו מיקרוסקופ</td><td>Leica LEICAM50</td><td></td><td>מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו; משמש לטיפול בספיורידים</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>קו תאי אדנוקרצינומה בשד</td></tr><tr><td>אוליגומיצין מ-Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>ATP מעכב סינתאז</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>אנטיביוטיקה נוספה למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>ניתוח של dsDNA בספרואידים</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>מעכב קומפלקס נשימה מיטוכונדריאלי I</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>מדיום תרבית 21875091 Gibco</td><td></td><td>עבור A549, MCF7 ו-SK-OV-3 ספרואידים</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>בנה 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>כל סוסון ים XFe96 Spheroid FluxPak מכיל: 6 לוחות מיקרו-ספרואידים של סוסון ים XFe96 (102978-100), 6 מחסניות חיישן XFe96 ובקבוק אחד של תמיסת קליברנט Seahorse XF 500 מ"ל (100840-000)</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית: 5, 10 ו-25 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>חומרים מתכלים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#HTB-77</td><td>קו</td></tr> <tr><td>תאי אדנוקרצינומה בשחלותנתרן פירובט (תמיסה של 100 מ"מ)Merck</td> <td>Life Science</td><td>S8636</td><td>תוסף לגידול תרבית תאים ובדיקת XF בינוני</td></tr><tr><td>T75 ס"מ2 בקבוק תרבית תאים</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>658175</td><td>תרבית רקמות צלוחיות מטופלות לתחזוקת תרביות תאים</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>מגיב דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>תוכנת בקר גל</td><td>Agilent Technologies בע"מ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>קצה פתח רחב</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>קצות פיפטה עם פתח רחב לטיפול בכדורים</td></tr></tbody></table>

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

אגרגטים תאיים תלת-ממדיים (3D), המכונים ספרואידים, הפכו בשנים האחרונות לחזית תרבית התאים במבחנה . בניגוד לתאי התרבות כחד-שכבתיים דו-ממדיים חד-תאיים (תרבית דו-ממדית), תרבית תאים כדורית מקדמת, מווסתת ותומכת בארכיטקטורה תאית פיזיולוגית ובמאפיינים הקיימים ב-vivo, כולל ביטוי של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, איתות תאים, ביטוי גנים, ייצור חלבונים, התמיינות והתפשטות. חשיבותה של תרבית תלת-ממדית הוכרה בתחומי מחקר רבים, כולל אונקולוגיה, סוכרת, ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות. בעשור האחרון פותחו שיטות משופרות לייצור ספרואידים ולהערכת תפקודם המטבולי וגורלם.
מנתחי שטף חוץ-תאי (XF) שימשו כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה במיקרוטיסים תלת-ממדיים כגון ספרואידים באמצעות צלחת לכידת איים XF24 או מיקרו-פלטה ספרואידית XFe96. עם זאת, פרוטוקולים ברורים ואופטימיזציה של בדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF לא תוארו בפירוט. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות מיקרו-פלטות ספרואידיות עם מנתח XF XFe96. באמצעות קווי תאים סרטניים שונים, טכנולוגיית XF מוכחת כמי שמסוגלת להבחין בין נשימה תאית בספרואידים תלת-ממדיים בגדלים שונים לא רק בגדלים שונים, אלא גם בנפחים שונים, מספרי תאים, תכולת DNA וסוגים שונים.
ריכוזי התרכובת האופטימליים של אוליגומיצין, BAM15, רוטנון ואנטימיצין A משמשים לבדיקת פרמטרים ספציפיים של חילוף חומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים. מאמר זה דן גם בשיטות לנרמול נתונים המתקבלים מספרואידים ומתייחס לשיקולים רבים שיש לקחת בחשבון בעת חקירת חילוף החומרים של הספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF. פרוטוקול זה יסייע להניע מחקר במודלים מתקדמים של ספרואידים במבחנה .

כדי להשיג ספרואידים קומפקטיים מעוצבים היטב, כל קו תאים הותאם בנפרד לצפיפות הזריעה ולמשך הטיפוח (איור 3). קווי תאים A549, HepG2/C3A ו-SK-OV-3 יצרו בתחילה אגרגטים רופפים שלא התקדמו לכדורואידים עגולים עם היקפים מוגדרים בבירור עד לאחר 7 ימים בתרבית. לעומת זאת, תאי MCF-7 יכולים ליצור ספרואידים תוך 3 ימים. היה מתאם ברור בין צפיפות הזריעה הראשונית של התאים לבין נפח הספרואידים לאחר תקופת התרבית עבור כל המודלים הספרואידיים. גודל הספרואידים והמורפולוגיה הותאמו לצפיפות הזריעה. המורפולוגיה והמחזוריות הח...

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לחקור את חילוף החומרים של האנרגיה המיטוכונדרית ואת הספרואידים החלקים כדי לאפשר השוואות בין מספר קווי תאים שונים, מספרי תאים ופנוטיפים שונים, כמו גם טיפולים תרופתיים בגילוי תרופות שדה ובחקר הסרטן. העבודה שלנו מציגה פרוטוקול מפורט לחקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים המספקים את המודל הפיזיולוגי המעולה בהשוואה לניסויים חד-שכבתיים בתאים. תצפיות ביולוגיות עשויות להיות אקסטרפולציה של כדוריות זגוגיות לגידולי in vivo ולזהות מסלולים שעשויים לכוון לחילוף החומרים של הגידול הספרואידי.לדוגמה, תועלת פחמימות במהלך צמיחת ספרואידים. כל הנתונים סוסון ים חוץ תאי שטף 96 מכשיר הוא רגיש מאוד. מיקום בספרואידים במבחנה בתוך לוחית הבדיקה הוא בעל חשיבות עליונה לקבלת נתונים מדויקים ברמת הספרואיד הבודד.בדוק את הכדאיות הספרואידית באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך עם ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 4 כדי להבטיח מבנה ספרואידי שלם, מורפולוגיה ואחידות כוללת בין הדגימות. כדי לייבש את מחסנית החיישן, aliquot כ 20 מיליליטר של calibrant לתוך צינור חרוטי. מניחים את הצינור החרוטי המכיל את הקליפרנט באינקובטור שאינו פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.הוציאו את תכולת ערכת הבדיקה. הניחו את מחסנית החיישן במהופך ליד לוחית השירות. פיפטה 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים סטריליים לתוך כל באר של לוח השירות באמצעות פיפטה P300 רב ערוצית.הניחו את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות. בדקו אם מפלס המים בכל באר גבוה מספיק כדי להטביע את בדיקות החיישן. מעבירים את מחסנית החיישן המורכבת לחממה שאינה פחמן דו-חמצני 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותה למשך הלילה.כדי לצפות את המיקרו-פלטה של בדיקת הספרואידים, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת 0.1 מיליגרם סטרילית למיליליטר Poly-D-Lysine לכל באר של מיקרו-פלטה כדורית בטכניקת ספיגה. שאפו את התמיסה מכל באר של המיקרו-פלטה הספרואידית, הפכו את הצלחת והקשו אותה בחוזקה על נייר טישו כדי להסיר כל תמיסה שיורית. לשטוף כל באר של הצלחת עם 200 microliters של מים סטריליים מזוקקים כפולים.לאחר הכביסה הסופית, הפכו את המיקרו-פלטה והקשו אותה בחוזקה על נייר טישו כדי להסיר את שאריות המים. אפשרו לצלחת להתייבש באוויר במשך 30 דקות לפני השימוש העתידי. הכן מדיום XF RPMI כמתואר בכתב היד.לפני המלחמה את מבחן ה-XF RPMI המוסף בינוני ל-37 מעלות צלזיוס שעה לפני הבדיקה. ולבשר מראש את המיקרו-לוחית הבדיקה הספרואידית המצופה בחממת 37 מעלות צלזיוס שאינה פחמן דו-חמצני. הוציאו את הצינור החרוטי המכיל את הקליברנט ואת מחסנית החיישן מחממת האוויר.הסר את מחסנית החיישן מלוח השירות והנח אותה במהופך על משטח העבודה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית P300, שאפו את המים מלוח השירות והשליכו אותם. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של הקליברנט המתוכנן מראש לכל באר של צלחת השירות.הניחו את מחסנית החיישן על לוחית השירות כדי לוודא שהחיישנים שקועים היטב בקליברנט. העבר את מחסנית החיישן המורכבת לחממת ההזרקה שאינה פחמן דו-חמצני, 37 מעלות צלזיוס, עד שתהיה מוכנה לטעינת פתרונות הזרקת היציאה. הוציאו את צלחת התרבית הספרואידית מהאינקובטור והתבוננו בספרואידים שמתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את שלמותם לפני צעדי העברת הספרואידים.טען 180 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה לפני המלחמה לתוך כל באר של הלוח הספרואידי כולל כל בארות תיקון רקע. ממלאים חלקית צלחת פטרי של שבעה סנטימטרים בשלושה מיליליטרים של מדיום הבדיקה. העבירו את הספרואידים מלוח התרבית של 96 הבאר לצלחת פטרי, באמצעות פיפטה רב-ערוצית עמוסה בקצות פיפטה רחבים, ונפח מוגדר ל-10 עד 50 מיקרוליטרים.הגדר את הנפח של פיפטטור ערוץ יחיד המצויד בקצה פיפטה רחב ל-20 מיקרוליטרים ושאף בזהירות ספרואיד יחיד. מניחים את הקצה ישירות במרכז כל באר של מיקרו-לוחית בדיקה ספרואידית זו ומאפשרים לפעולה נימית כדי למשוך את הספרואיד מקצה הפיפטה. אשרו את האבולוציה תחת המיקרוסקופ על ידי החזרת תכולת הפיפטטור לתוך צלחת פטרי.לאחר שכל הספרואידים הללו הועברו למיקרו-לוחית הבדיקה של הספרואידים, העבירו את הצלחת לחממה שאינה פחמן דו-חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. הכן את ריכוזי מלאי העבודה של כל תרכובת כמתואר בכתב היד, תוך שימוש במדיום בדיקת XF RPMI שהושלם במלואו לפני המלחמה. חילק 20 מיקרוליטרים של תמיסת העבודה של כל תרכובת לכל היציאות המתאימות באמצעות פיפטה רב-ערוצית מכוילת P100.הכן את המנתח לטעינת מחסנית החיישן. כדי להשיג ספרואידים קומפקטיים שנוצרו היטב, כל קו תאים הותאם בנפרד לצפיפות הזריעה ולמשך הטיפוח. באסטרטגיות זריעה אופטימליות, נפח הספרואידים עבור SK-OV-3 היה בסביבות 5.46 x 10 לשבעת המיקרומטרים שקובצו, ועבור A549, הוא היה 1.45 x 10 עד שמונה מיקרומטרים.לכל סוגי הספרואידים היה מתאם ליניארי בין צפיפות הזריעה הראשונית לבין נפח הספרואידים. לסימטריה ספרואידית מושלמת הייתה מעגליות של 1.0 וסטייה מ-1.0 הצביעה על אובדן מעגליות. עבור כל סוגי הספרואידים, קצב צריכת החמצן עלה עם גודל הספרואידים והיה בקורלציה ליניארית לנפח הספרואידים עם הגבוה ביותר בספרואידים MCF-7 והנמוך ביותר בספרואידים SK-OV-3.כדורי MCF-7 לא הגיבו לבקרת הרכב לאורך כל הניסוי. שיעור צריכת החמצן בספרואידים MCF-7 הופחת עם אוליגומיצין לאחר חמישה מחזורי מדידה לאחר הזריקה הראשונה של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. בתגובה ל-BAM15, קצב צריכת החמצן הוגדל לפני הזריקה השנייה.ואילו השילוב של רוטנונה פלוס אנטימיצין A הוריד אותו. פרוטוקול לבדיקה מדויקת של הנשימה המיטוכונדרית הבסיסית. נשימת זרחון ADP, נשימת דליפה, יעילות צימוד, יכולת נשימה מקסימלית ויכולת נשימה רזרבית פותחו באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים שמקורם בסרטן.כל תרכובות הנשימה הניבו את פרופילי קצב צריכת החמצן הקינטי הצפוי עבור התרכובות הנבחרות, וחשפו קצב נשימה בסיסי קבוע ממוצע של 20 עד 30 פיקומולות של חמצן לדקה, לכל באר. מיקום הספרואידים בתוך המיקרו-לוחית ומספר מחזור המדידה לאחר הזרקת התרכובת כדי להבטיח שקצבי הנשימה יציבים בין תוספות התרכובת. כאשר בוחנים את יכולת הנשימה המיטוכונדרית עם uncouplers, לא רק את מפתח הריכוז, אלא גם את היכולת שלה לפתוח נשימה בנוכחות אוליגומיצין, אשר בדרך כלל מתווסף לפני uncoupler בניסויים לחקור מטבוליזם אנרגיה מיטוכונדריאלית.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה לביצוע בדיקת שטף חוץ-תאי על ספרואידים תלת-ממדיים שנוצרו מתרבית משותפת של תאי סרטן הלבלב (Patu8902) ופיברובלסטים פעילים של הלבלב (PS1) כדי למדוד את שני המסלולים העיקריים לייצור אנרגיה, גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית.

בדיקת שטף חוץ-תאי בספרואידים תלת-ממדיים: שיטה למדידת הפעילות המטבולית של ספרואידים של גידולי לבלב

כאן, שיטה מתוארת עבור הכנת ספרואיד תלת-ממדי (3D) תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts, ואחריו מדידה של פונקציות מטבוליות באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

המטרה של פרוטוקול זה נועד להמחיש כיצד להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן של הלב.

קצב צריכת החמצן וניתוח Cardiomyocytes Neonatal העכבר בתרבית הראשי באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.

מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

כאן, אנו מקימים פלטפורמת פרופיל מטבולי המשלבת ספרואידים גליומה תלת מימדיים (תלת מימדיים) ונורמליזציה מבוססת הדמיה באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי. גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של התגובות המטבוליות של הגידול לטיפולים תרופתיים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני עמידות פוטנציאליים.

התקדמות בפרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים של גידולי מוח לבדיקת תרופות

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

חקור חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בספירואידים תלת-ממדיים מקווי תאים סרטניים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי Seahorse. פרוטוקול זה מספק מודל פיזיולוגי עדיף לניסויים במונושכבות תאים ומאפשר מדידות רגישות ברמת ספירואיד בודד.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

גלה סרטונים נוספים