חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לחקור את חילוף החומרים של האנרגיה המיטוכונדרית ואת הספרואידים החלקים כדי לאפשר השוואות בין מספר קווי תאים שונים, מספרי תאים ופנוטיפים שונים, כמו גם טיפולים תרופתיים בגילוי תרופות שדה ובחקר הסרטן. העבודה שלנו מציגה פרוטוקול מפורט לחקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים המספקים את המודל הפיזיולוגי המעולה בהשוואה לניסויים חד-שכבתיים בתאים. תצפיות ביולוגיות עשויות להיות אקסטרפולציה של כדוריות זגוגיות לגידולי in vivo ולזהות מסלולים שעשויים לכוון לחילוף החומרים של הגידול הספרואידי.

לדוגמה, תועלת פחמימות במהלך צמיחת ספרואידים. כל הנתונים סוסון ים חוץ תאי שטף 96 מכשיר הוא רגיש מאוד. מיקום בספרואידים במבחנה בתוך לוחית הבדיקה הוא בעל חשיבות עליונה לקבלת נתונים מדויקים ברמת הספרואיד הבודד.

בדוק את הכדאיות הספרואידית באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך עם ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 4 כדי להבטיח מבנה ספרואידי שלם, מורפולוגיה ואחידות כוללת בין הדגימות. כדי לייבש את מחסנית החיישן, aliquot כ 20 מיליליטר של calibrant לתוך צינור חרוטי. מניחים את הצינור החרוטי המכיל את הקליפרנט באינקובטור שאינו פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הוציאו את תכולת ערכת הבדיקה. הניחו את מחסנית החיישן במהופך ליד לוחית השירות. פיפטה 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים סטריליים לתוך כל באר של לוח השירות באמצעות פיפטה P300 רב ערוצית.

הניחו את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות. בדקו אם מפלס המים בכל באר גבוה מספיק כדי להטביע את בדיקות החיישן. מעבירים את מחסנית החיישן המורכבת לחממה שאינה פחמן דו-חמצני 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותה למשך הלילה.

כדי לצפות את המיקרו-פלטה של בדיקת הספרואידים, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת 0.1 מיליגרם סטרילית למיליליטר Poly-D-Lysine לכל באר של מיקרו-פלטה כדורית בטכניקת ספיגה. שאפו את התמיסה מכל באר של המיקרו-פלטה הספרואידית, הפכו את הצלחת והקשו אותה בחוזקה על נייר טישו כדי להסיר כל תמיסה שיורית. לשטוף כל באר של הצלחת עם 200 microliters של מים סטריליים מזוקקים כפולים.

לאחר הכביסה הסופית, הפכו את המיקרו-פלטה והקשו אותה בחוזקה על נייר טישו כדי להסיר את שאריות המים. אפשרו לצלחת להתייבש באוויר במשך 30 דקות לפני השימוש העתידי. הכן מדיום XF RPMI כמתואר בכתב היד.

לפני המלחמה את מבחן ה-XF RPMI המוסף בינוני ל-37 מעלות צלזיוס שעה לפני הבדיקה. ולבשר מראש את המיקרו-לוחית הבדיקה הספרואידית המצופה בחממת 37 מעלות צלזיוס שאינה פחמן דו-חמצני. הוציאו את הצינור החרוטי המכיל את הקליברנט ואת מחסנית החיישן מחממת האוויר.

הסר את מחסנית החיישן מלוח השירות והנח אותה במהופך על משטח העבודה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית P300, שאפו את המים מלוח השירות והשליכו אותם. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של הקליברנט המתוכנן מראש לכל באר של צלחת השירות.

הניחו את מחסנית החיישן על לוחית השירות כדי לוודא שהחיישנים שקועים היטב בקליברנט. העבר את מחסנית החיישן המורכבת לחממת ההזרקה שאינה פחמן דו-חמצני, 37 מעלות צלזיוס, עד שתהיה מוכנה לטעינת פתרונות הזרקת היציאה. הוציאו את צלחת התרבית הספרואידית מהאינקובטור והתבוננו בספרואידים שמתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את שלמותם לפני צעדי העברת הספרואידים.

טען 180 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה לפני המלחמה לתוך כל באר של הלוח הספרואידי כולל כל בארות תיקון רקע. ממלאים חלקית צלחת פטרי של שבעה סנטימטרים בשלושה מיליליטרים של מדיום הבדיקה. העבירו את הספרואידים מלוח התרבית של 96 הבאר לצלחת פטרי, באמצעות פיפטה רב-ערוצית עמוסה בקצות פיפטה רחבים, ונפח מוגדר ל-10 עד 50 מיקרוליטרים.

הגדר את הנפח של פיפטטור ערוץ יחיד המצויד בקצה פיפטה רחב ל-20 מיקרוליטרים ושאף בזהירות ספרואיד יחיד. מניחים את הקצה ישירות במרכז כל באר של מיקרו-לוחית בדיקה ספרואידית זו ומאפשרים לפעולה נימית כדי למשוך את הספרואיד מקצה הפיפטה. אשרו את האבולוציה תחת המיקרוסקופ על ידי החזרת תכולת הפיפטטור לתוך צלחת פטרי.

לאחר שכל הספרואידים הללו הועברו למיקרו-לוחית הבדיקה של הספרואידים, העבירו את הצלחת לחממה שאינה פחמן דו-חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. הכן את ריכוזי מלאי העבודה של כל תרכובת כמתואר בכתב היד, תוך שימוש במדיום בדיקת XF RPMI שהושלם במלואו לפני המלחמה. חילק 20 מיקרוליטרים של תמיסת העבודה של כל תרכובת לכל היציאות המתאימות באמצעות פיפטה רב-ערוצית מכוילת P100.

הכן את המנתח לטעינת מחסנית החיישן. כדי להשיג ספרואידים קומפקטיים שנוצרו היטב, כל קו תאים הותאם בנפרד לצפיפות הזריעה ולמשך הטיפוח. באסטרטגיות זריעה אופטימליות, נפח הספרואידים עבור SK-OV-3 היה בסביבות 5.46 x 10 לשבעת המיקרומטרים שקובצו, ועבור A549, הוא היה 1.45 x 10 עד שמונה מיקרומטרים.

לכל סוגי הספרואידים היה מתאם ליניארי בין צפיפות הזריעה הראשונית לבין נפח הספרואידים. לסימטריה ספרואידית מושלמת הייתה מעגליות של 1.0 וסטייה מ-1.0 הצביעה על אובדן מעגליות. עבור כל סוגי הספרואידים, קצב צריכת החמצן עלה עם גודל הספרואידים והיה בקורלציה ליניארית לנפח הספרואידים עם הגבוה ביותר בספרואידים MCF-7 והנמוך ביותר בספרואידים SK-OV-3.

כדורי MCF-7 לא הגיבו לבקרת הרכב לאורך כל הניסוי. שיעור צריכת החמצן בספרואידים MCF-7 הופחת עם אוליגומיצין לאחר חמישה מחזורי מדידה לאחר הזריקה הראשונה של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. בתגובה ל-BAM15, קצב צריכת החמצן הוגדל לפני הזריקה השנייה.

ואילו השילוב של רוטנונה פלוס אנטימיצין A הוריד אותו. פרוטוקול לבדיקה מדויקת של הנשימה המיטוכונדרית הבסיסית. נשימת זרחון ADP, נשימת דליפה, יעילות צימוד, יכולת נשימה מקסימלית ויכולת נשימה רזרבית פותחו באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים שמקורם בסרטן.

כל תרכובות הנשימה הניבו את פרופילי קצב צריכת החמצן הקינטי הצפוי עבור התרכובות הנבחרות, וחשפו קצב נשימה בסיסי קבוע ממוצע של 20 עד 30 פיקומולות של חמצן לדקה, לכל באר. מיקום הספרואידים בתוך המיקרו-לוחית ומספר מחזור המדידה לאחר הזרקת התרכובת כדי להבטיח שקצבי הנשימה יציבים בין תוספות התרכובת. כאשר בוחנים את יכולת הנשימה המיטוכונדרית עם uncouplers, לא רק את מפתח הריכוז, אלא גם את היכולת שלה לפתוח נשימה בנוכחות אוליגומיצין, אשר בדרך כלל מתווסף לפני uncoupler בניסויים לחקור מטבוליזם אנרגיה מיטוכונדריאלית.