בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין
29 באוגוסט 2022
תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) יכולים להיות מקור פוטנציאלי של MSCs המתמיינים לתאים המייצרים אינסולין (IPCs). בפרוטוקול זה, אנו מספקים שלבים מפורטים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs אפידידימליים של חולדות, ולאחר מכן פרוטוקול פשוט וקצר ליצירת IPCs מאותם Ad-MSCs של חולדה.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבודד ולאפיין רקמת שומן אדומה, תאי גזע מזנכימליים מיובשים ולהבדיל אותם לעבר תאים המייצרים אינסולין בשיטות פשוטות. תאי גזע מזנכימליים מצאו את הדרכים בתחום הגנטיקה. ניתן לבודד אותם ממקורות שונים כגון מח עצם, רקמת שומן ורקמה פרינטלית.
הם מקבלים מאפיינים תרבותיים מצוינים. הם רב עוצמה ויכולים לטפל במחלות שונות. רקמת השומן מספקת מקור עשיר לתאי גזע מזנכימליים.
ניתן לבודד את השומן MSCs האלה מליפו-שואפים בקלות עם תפוקה גבוהה בהשוואה למקורות אחרים כמו מח עצם. והם יכולים לספק מקור טוב הן להשתלה אוטולוגית והן להשתלה אלוגנית. בסרטון זה מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים בשומן משומן אפידידימלי של חולדה.
הליך זה הוא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לבידוד. לאחר הבידוד, נסבול את ההתמיינות של תאי גזע מזנכימליים אלה בשומן לתאים המייצרים אינסולין באמצעות פרוטוקול פשוט וקצר יחסית. נתחיל בבידוד של תאי גזע מזנכימליים בשומן על ידי עיכול קולגן של שומן אפידידימלי כדי להשיג שבר כלי דם חזק יותר.
לאחר מכן תאי גזע מזנכימליים יתאפיינו בהיצמדות הפלסטית שלהם, כמו גם בביטוי של סמני CD והתמיינות לשושלות מזודרמליות מרובות. להרדים את החיה, ולאחר מכן להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם. מרססים בכל הגוף עם 70% אתנול ומתחילים בכריתה של העור והשרירים בחלק התחתון של הבטן.
לאחר מכן חשוף את האשכים עם השומן האפידידימלי. חותכים בעדינות את השומן האפידידימלי. היזהרו לא לחתוך את כלי הדם עם השומנים.
בארון בטיחות ביולוגי, חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים ואזמל. העבר את רקמת השומן לצינור צנטריפוגה המכיל 10 מיליליטרים PBS סטריליים. התחילו לשטוף על ידי הטיית צינור הפלקון למשך 45 שניות.
לאחר מכן שמור את הצינור עומד במשך חמש דקות כדי להפריד לשתי שכבות. הסר את ה- PBS האינפראנאטי באמצעות מזרק 10 מיליליטר. חזור על שלבי שטיפה אלה ארבע עד חמש פעמים עד ש- PBS יהיה ברור.
לאחר שטיפה, להשעות מחדש את רקמת השומן בתמיסה קולגן, ולאחר מכן לדגירה באמבט מים רועדים עד שהרקמה כמעט הומוגנית. לאחר מכן, מערבלים את תערובת הקולגן של הרקמה במשך 15 שניות, ואז צנטריפוגה לאחר מכן במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, יהיו לך שלוש שכבות.
יש להשליך בזהירות את ה-supernatant מעל שבר כלי הדם הסטרומי. תחילה השליכו את שכבת השמן בחלקה העליון בזהירות, ולאחר מכן את שכבת ההדים מבלי להפריע לכדור שבר כלי הדם הסטרומי. להשעות מחדש את שבר כלי הדם הסטרומיים ב- BSA סטרילי ולצנטריפוגה מחדש למשך חמש דקות.
צנטריפוגה שלמה, מקם את המדיה המלאה של DMEM F-12 בבקבוקון מרובע של 25 סנטימטרים. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת כלי הדם הסטרומיים במדיית DMEM F-12 מלאה. ולהעביר לבקבוקון התרבות.
מקום בחממת פחמן דו חמצני 37 מעלות 5%. למחרת, הסר תאים לא מחוברים והחלף את המדיה במדיה טרייה. החל מיום הבידוד הבא, התאים דמויי הפיברובלסט יתחילו להופיע.
ואז בהדרגה ככל שיעבור הזמן הם יגדלו במספרם ובגודלם. על ידי מעבר, התאים יהפכו להומוגניים יותר. תאים אלה מציגים את כל הקריטריונים לאפיון תאי גזע מזנכימליים.
תאים אלה התמינו לעבר תאים המייצרים אינסולין באמצעות פרוטוקול פשוט זה המכיל ניקוטין-אמיד בטא מרקפטואתנול ואקסנדין-4. לאורך שלבי ההתמיינות, התאים מתחילים לאבד את הצורה הפיברובלסטית שלהם ולדעתי אשכול כמו מורפולוגיה. כאשר משתמשים בתאים המייצרים אינסולין, הם מראים צביעה חיובית של דיסיתון אדום ארגמן, ולאחר מכן משתמשים בתאים המייצרים אינסולין ומבטאים סמנים שונים של תאי בטא כמו Pdx-1, mafA ואינסולין.
בנוסף, תאים המושרים המייצרים אינסולין מפרישים רמות גבוהות יותר של אינסולין בסופרנטנט כאשר הם מאותגרים עם ריכוז גלוקוז גבוה יותר. סיפקנו פרוטוקול מפורט וצעדי לבידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים בשומן. אנו גם מספקים כאן פרוטוקול קצר, פשוט ויעיל יחסית להתמיינות של תאי גזע מזנכימליים בשומן לתאים המייצרים אינסולין.
זה מספק שער לחוקר להיכנס לתחום תאי הגזע המזנכימליים ולחקור את התמיינותם לתאים המייצרים אינסולין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד ואפיון תאי גזע מזנכימליים המופקים מרקמת שומן (Ad-MSCs) מרקמת האפידידימיס של חולדה, ולאחר מכן את בידולם לתאים מפרישי אינסולין (IPCs). השיטות המוצגות הן פשוטות ותוכננו ליישום קל בסביבת מעבדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- ניתן להפיק תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מרקמות שונות, כולל רקמה שומנית.
- רקמה שומנית היא מקור עשיר ל-MSCs בעלי מאפייני תרבית נוחים.
- ל-MSCs יש פוטנציאל להבדיל סוגי תאים שונים, כולל תאים מייצרי אינסולין.
- הבנת תהליך הבידול יכולה לסייע בפיתוח טיפולים לסוכרת.
מטרת המחקר
- בידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים מהאפידידימיס של חולדה (Ad-MSCs).
- פיתוח פרוטוקול לגילוי ובידול של תאים אלו לתאי קדם-פרוסטאטיים (IPCs).
- אספקת שיטה מהימנה למחקרים עתידיים ברפואה רגנרטיבית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד של MSCs המופקים מרקמת שומן מהשומן האפידידימלי של חולדה.
- אפיון של ה-MSCs המבודדים באמצעות סמנים סטנדרטיים.
- השראת גבייה (דיפרנציאציה) לתאים מייצרי אינסולין.
- הערכת התפקוד של IPC לאחר הדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של Ad-MSCs עם סממנים שטח אופייניים.
- הדגמה של דיפרנציאציה של Ad-MSCs לתאי IPCs.
- הערכה תפקודית הראתה כי IPCs מסוגלים להפריש אינסולין.
- הפרוטוקול מספק שיטה ניתנת לשחזור ליצירת IPCs מתוך Ad-MSCs.
מסקנות
- Ad-MSCs מהווים מקור בר-קיימא ליצירת תאים מפרישי אינסולין.
- הפרוטוקול עשוי לסייע למחקרים נוספים בטיפול בסוכרת.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון את הפוטנציאל הטיפולי של IPCs אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תאי גזע מזנכימליים המופקים מרקמה שומנית (Ad-MSCs) מהווים מקור מתחדש שאינו מעורר מחלוקת אתית ליצירת תאים מפרישי אינסולין (IPCs) במחקר על סוכרת. הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לבידוד ואפיון של Ad-MSCs משומן האפידידימיס של חולדה, ולאחר מכן גזירה שלהם לתאי IPCs באמצעות אותות ביוכימיים מוגדרים. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי טיפולי למחלות מטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של הרב-פוטנציאליות (multipotency) של MSC ומחויבותם לשושלת תאי בטא לבלב.
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של Ad-MSCs עם ביטוי מאושר של CD90, CD73 ו-CD105 לצורך ניסויים הניתנים לשחזור.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף תפקודי של IPCs באמצעות הפרשת אינסולין המעוררת גלוקוז (GSIS) וצביעת dithizone, המאשרות תפקוד דמוי-תאי בטא.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור של IPCs המבטאים פקטורי שעתוק מרכזיים של תאי בטא (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) לשימוש במבחני סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור בר-הרחבה של IPCs מ-Ad-MSCs להערכה בתוספת של תפוקה גבוהה של דינמיקת הפרשת אינסולין.
- ערך מדעי: מקל על סטנדרטיזציה של המבחן באמצעות פרוטוקולי גזירה עקביים המשתמשים ב-HG-DMEM, β-mercaptoethanol, nicotinamide ו-exendin-4.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים רלוונטיות טרנסלציונית על ידי ייצור IPCs המגיבים לאתגרי גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין מוגברת.
- ערך תפעולי: תומך ברציפות פרה-קלינית על ידי אספקת מקור תאים מתחדש לבדיקות של תגובה למינון ויעילות במודלים של סוכרת.
- ערך מדעי: מפחית סיכונים ביולוגיים על ידי אישור מולטיפוטנציאליות באמצעות דיפרנציאציה אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית לפני השראת IPC.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף יעדים מוקדם, דרך זיהוי תרכובות מובילות ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור טיפולים בסוכרת המכוונים להחלפה או לשיקום תפקוד של תאי בטא.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי פלסטיות של MSC וספציפיקציה של שושלת תאים באמצעות רמזי בידול מוגדרים.
- סריקה: מאפשר ייצור של IPC המוכן לבדיקה עם תוצרים מדידים כגון רמות הפרשת אינסולין וביטוי סמנים.
- אנליטיקה: מספק נקודות קצה מדידות הכוללות GSIS, צביעת dithizone ו-qPCR לסמני תאי בטא לצורך השוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין יצירת IPC in vitro לתיקוף פרה-קליני באמצעות בדיקות תפקודיות של שחרור אינסולין.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר ליצירת IPC ממקורות של רקמת שומן במגוון פרויקטים וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי ביצירת IPC באמצעות אפיון רב-שושלתי ותיקוף פונקציונלי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור של בידוד ודיפרנציאציה של Ad-MSC בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) בפיתוח טיפולים מוקדמים לסוכרת, באמצעות תיקוף של מודלים תאיים לתפקוד תאי בטא.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של גישות מבוססות תאי גזע להתערבויות במחלות מטבוליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי גזע, בטכניקות דיפרנציאציה ובציטומטריה של זרימה לצורך אימונופנוטיפיקציה.
- נדרשת גישה לצנטריפוגות, למCבטות בטיחות ביולוגית, לאינקובטורים ולציוד לבדיקות הפרשת אינסולין המעוררת גלוקוז.
- נדרש סטנדרטיזציה של נהלי העיכול, השטיפה והזריעה כדי להבטיח תנובאת עקבית של הפרק הסטרומלי-וסקולרי (stromal vascular fraction).
- נדרשת התאמה של תזמון הדיפרנציאציה וריכוזי הרכיבים בעת היישום על מאגרי שומן או מינים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בתאים ממעברים (passages) 3-5 כדי להבטיח הומוגניות ומולטיפוטנטיות לפני השראת הדיפרנציאציה.
