Name: טכניקה שונה לשימוש בלבבות מורין יילודים בהכנת לנגנדורף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד שיטת הלבדה רטרוגרדית בלבבות עכברים נאונטליים לחקר פיתוח לבבי ותגובות פיזיולוגיות. שיטה זו מאפשרת חקר בגיל 10 ימים לאחר הלידה ומאפשרת בידוד קרדיומיוציטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

האישורים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה התקבלו עבור כל השיטות שתוארו. סוג פראי C57Bl/6 זכר לאחר הלידה 10 עכברים שימשו למחקר.
1. הכנת מנגנון לנגנדורף
<ol><li>כדי למזער את המורכבות, השתמש בפרפוסאט מחומצן שאינו משחזר בתוך מנגנון לנגנדורף (ראו טבלת חומרים) באמצעות זרימה קבועה או לחץ קבוע.<ol>
<li>השתמש במאגר Krebs-Henseleit (KHB), המכיל 120 mmol/L של NaCl, 4.7 mmol/L של KCl, 1.2 mmol/L של MgSO4, 1.2 mmol/L של KH2PO4, 1.25 mmol/L של CaCl2, 25 mmol/L של NaHCO3, ו-11 mmol/L של גלוקוז ב-pH 7.4 (ראו טבלת חומרים), שיווי המשקל עם 95% מ-O2 ו-5% מה-CO2 במנגנון לנגנדורף ושמור על 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור גישת הזרימה הקבועה, שמור על קצב זרימה רציף של ~2.5 מ"ל∙min-1. הערה: קצב זרימה זה יעריך זרימה כלילית של ~75-80 מ"ל/גרם∙min, בהתחשב בכך שהמשקל הממוצע של לב עכבר בן 10 ימים (P10) הוא ~ 30 מ"ג17,18.</li>
</ol>2. ייצור צינורית אבי העורקים
<ol><li>צרו את צינורית אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד ממחט נירוסטה 26 גרם (ראו טבלת חומרים). באמצעות מספריים חדים, חתכו את קצה המחט כדי להקהות את הקצה. היזהרו שלא לכווץ או להגביל את קוטר לומן המחט. החליקו את קצה החתך והסירו את כל הבורות על ידי גירוד עדין של הקצה הקהה על ספסל המעבדה באמצעות תנועה הלוך ושוב. הערה: יש להסיר פיתולים מיקרוסקופיים וקצוות חדים מכיוון שהם עלולים לקרוע את אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד ולפגוע במסתם אבי העורקים. לחלופין, השתמשו בנייר זכוכית עם חצץ עדין.</li>
	<li>חברו את הצינורית המפוברקת למנגנון לנגנדורף והעריכו את הזרימה וההתנגדות. מדידת קצבי הזרימה דרך הצינורית על ידי איסוף ומדידה של כמות המאגר לאורך פרק זמן ידוע. ודא שהזרימה בפועל שווה לקצב הזרימה הקבוע של 2.5 מ"ל min-1.</li>
	<li>לכמת את הפרש הלחץ על פני הצינורית עם KHB זורם על ידי ביצוע השלבים הבאים.<ol>
<li>מדידת לחץ במערכת עם ובלי הצינורית המפוברקת המחוברת.</li>
		<li>מחלקים את הפרשי הלחץ על פני צינורית לפי קצב הזרימה כדי לקבל התנגדות צינורית לפי חוק אוהם15.</li>
		<li>ודא שהתנגודת המפוברקת בפני צינורית כוללת כ-16.0 ± 1.9 מ"מ כספית∙דקות∙mL-1 מתוך ההתנגדות הכוללת6. התנגדות מוגזמת מרמזת על לומן צינורית שעלולה להיפגע. הערה: חישוב לדוגמה: Pעם צינורית - P ללא צינורית = ΔP. אם Pעם = 48 ו- Pללא = 8 אז ΔP = 40. בקצב זרימה (Q) של 2.5 מ"ל min-1 ו- ΔP של 40 התנגדות צינורית שווה 16 מ"מ כספית∙min∙min∙mL-1 באמצעות R = ΔP/Q = 40 / 2.5 = 16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את צינורית 26 G והצמד את הצינורות בלחץ גבוה (ראה טבלת חומרים) לאתר התותח במנגנון לנגנדורף. חברו את צינורית אבי העורקים לקצה הדיסטלי של הצינורות. יש לשחרר את האוויר מהצינורות ואת הצינורית עם חיץ מחומצן, מה שמבטיח שכל הבועות יוסרו. הערה: השימוש בצינורות בלחץ גבוה באופן זה מאפשר להרחיב את הצינורית למצב מרוחק יותר. זה הכרחי כדי לאפשר תותח אבי העורקים עם מיקרוסקופ ניתוח הסמוך להגדרה (איור 1).</li>
</ol>3. קצירת איברים
<ol><li>עכברים נוגדי חמצון באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של הפרין (10 kU/kg) (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע היווצרות של מיקרותרומבי כלילי באמצעות מחט 26 G על מזרק 1 מ"ל. אפשר כמה דקות עבור הפרין להסתובב לפני שתמשיך עם הזרקה של כל הרדמה.</li>
	<li>מרדימים את החיה בהזרקת IP באמצעות מחט 26 גרם על מזרק 1 מ"ל. הערה: חיוני לעקוב בקפידה אחר החיה לאחר הזרקת הרדמה כדי למנוע דום נשימה והיפוקסיה שלאחר מכן. פנטוברביטל (70 מ"ג/ק"ג) הוא בחירה אמינה של הרדמה, שכן הוא מאפשר התפרצות מהירה של הרגעה מבלי לגרום לדום נשימה19,20. ניתן להשתמש בחומרי הרדמה אחרים, בתנאי שהמינונים המשמשים אינם גורמים לדום נשימה21. החוקרים צריכים לשקול את ההשפעות של תרופות הרגעה-היפנוזה חלופיות על תפקוד הלב22,23. נקע צוואר הרחם כמצב עיקרי של המתת חסד עלול להאריך היפוקסיה טרום-קנולציה ואיסכמיה.</li>
	<li>מניחים את העכבר במצב שכיבה ומאבטחים את הגפיים מיד עם אובדן ההכרה. השתמש במחטים היפודרמיות קטנות כדי לאבטח כל איבר. התחילו לקצור ברגע שהחיה לא מגיבה לצביטת הבוהן; החיה צריכה לנשום באופן ספונטני במהלך הנתיחה הראשונית.</li>
	<li>בצעו חתך תת-אקסיפואידי רוחבי לרוחב החיה כדי לחשוף את חלל הבטן באמצעות מספריים חותכים ישרים (ראו טבלת חומרים). הערה: טכניקה סטרילית אינה הכרחית בהתחשב בכך שההליך מייצג ניתוח שאינו סחיר.<ol>
<li>זהה את הסרעפת בצורה מעולה והתעלה לחלוטין את החלק הקדמי. חותכים את הצלעות באופן דו-צדדי לאורך קו אמצע בית השחי בכיוון של צפאלאד. בקשו מעוזר לתפוס את התהליך ה-xiphoid עם מלקחיים ולשקף את עצם החזה והצלעות באופן קרניאלי כדי לחשוף את איברי בית החזה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זהה את הווריד הנבוב התחתון התת-דיאפרמטי (IVC) מעל הכבד. בצעו את ה-IVC עם מספריים קשתית מעוגלים תוך שמירה על מתח קדמי וצפאלאד קל על המקטע הפרוקסימלי עם מלקחיים קשתיים (ראו טבלת חומרים).<ol>
<li>חותכים אחורית לאורך המשטח הקדמי של עמוד השדרה באמצעות מספריים קשתיים מעוקלים תוך משיכת ה-IVC למעלה והחוצה מחלל בית החזה. כאשר הלב מגויס, זווית את המספריים קדימה ולנתק את כלי הדם הגדולים בצורה מעולה כדי להסיר לחלוטין את הלב והריאות. הערה: שיטה זו מאפשרת התפשטות מהירה של הלב והריאות בגוש.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיד להטביע את הדגימה ב- KHB קר כקרח או מלוחים. הלב צריך להפסיק לפעום תוך שניות.</li>
</ol>4. תותח
<ol><li>חותכים פיסת מגבת נייר ומניחים אותה בתחתית צלחת פטרי רדודה כדי לספק חיכוך לייצוב הלב במהלך התותח. לחים עם KHB קר כקרח כדי למנוע מהלב לדבוק בו.<ol>
<li>הניחו את צלחת הפטרי המוכנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח והתאימו את המיקוד. מניחים את צינורית אבי העורקים המחוברת לצינורות ההרחבה בלחץ גבוה מתחת למיקרוסקופ הניתוח יחד עם תפר משי 5-0 שנקשר באופן רופף סביב רכזתו (ראו טבלת חומרים). הערה: יש לנקוט בזהירות כדי להגביל את כמות הנוזלים בצלחת פטרי מכיוון שהריאות מלאות האוויר יכולות לצוף ולגרום לאיברים שנכרתו לזוז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את איברי החזה הנכורים בצלחת הפטרי. תחת המיקרוסקופ, זהה את התימוס על ידי הברק הלבן שלו ושתי אונות וכיוון את הדגימה כך שהתימוס יהיה קדמי ועליון24. זה יבטיח אוריינטציה נכונה של הלב.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מפרידים באופן בוטה את האונות של התימוס כדי לחשוף את הכלים הגדולים. זהה את אבי העורקים על ידי איתור תכונות הסתעפות מבדילות של קשת אבי העורקים. הערה: גוון סגול כהה תוחם לעתים קרובות את החדר הימני ואת עורק הריאה. אבי העורקים העולה ממוקם בין עורק הריאה הראשי לאטריום הימני.</li>
	<li>טרנסקט את אבי העורקים עם מספריים חדים עדינים (ראו טבלת חומרים) רק קרובים להמראה של העורק התת-קלבי. הערה: אם אבי העורקים מועבר קרוב מדי למסתם אבי העורקים, לא תהיה מספיק רקמת אבי העורקים כדי לאפשר את אבטחת הצינורית. לחלופין, אם אבי העורקים עובר טרנסקטציה גבוהה מדי, פרפוסאט יכול לדלוף מתוך ענף אבי העורקים אחד או יותר (כגון העורק התת-קלבי).</li>
	<li>יש לאחוז בעדינות באבי העורקים המחולק באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים בסגנון צורף (ראו טבלת חומרים). בזהירות cannulate אבי העורקים עם מחט קהה 26 G, תוך הקפדה לא לפגוע בשסתום אבי העורקים. החזק במקומו על ידי אחיזת אבי העורקים עם המלקחיים המעוקלים העדינים סביב הצינורית. לאחר קביעת השליטה באבי העורקים, יש ליזום פרפוזיה מדרדרת כדי להגביל את הזמן האיסכמי. הערה: הלב צריך להתחיל לפעום ויהיה חיוור כאשר הדם מתרוקן מבשר הלב ו- KHB מנקב את העורקים הכליליים. כישלון לפעום באופן ספונטני, נוכחות של גודש חדרי, או חוסר שינוי צבע של הלב מצביעים על צינורית מפולפלת.</li>
	<li>בקשו מהעוזר לתפוס את קצות התפר הקשור באופן רופף ולעטוף בזהירות את אבי העורקים סביב הצינורית. יש לדחוס את התפר מעל או מתחת למלקחיים העדינים המעוקלים (המחזיקים את הצינורית במקומה), בהתאם לכמות רקמת אבי העורקים והשיקולים האנטומיים. להדק את התפר ולאשר את הלימות הזרימה הכלילית.</li>
	<li>נתקו את הצינורות בלחץ גבוה ממנגנון לנגנדורף. תפסו את רכזת הצינורית ונתקו את המחט הבוטה מצינורות ההרחבה בלחץ גבוה. חבר במהירות את רכזת הצינורית למנגנון. הערה: יש להקפיד שלא לנתק את הלב או להכניס אוויר לתוך הצינורית.</li>
	<li>ברגע שהלב נתלה על מנגנון לנגנדורף בתנוחה הרגילה, ומאושרת זלוף הולם, לקצץ בזהירות את הריאות, התימוס והרקמות העודפות. תנסה את האטריום הנכון כדי לאפשר לשפכי סינוסים כליליים לטפטף בחופשיות.</li>
</ol>5. מדידה פונקציונלית
<ol><li>צור קשר קטן בקצה תפר משי 5-0 (מחובר למחט מעוקלת). חודרים חתיכה קטנה של סרט פרפין (2-3 מ"מ x 2-3 מ"מ) עם המחט ומחליקים את הפרפין לקצה הקשר. מעבירים בזהירות את המחט דרך פסגת החדר ומושכים את התפר דרך הלב עד שסרט הפרפין נצמד אל הקיר הצדדי של החדר. הערה: סרט הפרפין עוזר למנוע מהקשר לקרוע את הלב ולמשוך דרך החדר.</li>
	<li>מעבירים את המחט דרך פתח מעיל החימום מלא המים של מנגנון לנגנדורף. כעת ניתן לעטוף את הלב ולחמם אותו.</li>
	<li>חברו את המחט למתמר הכוח (ראו טבלת חומרים) באופן שימנע את טפטוף הסינוסים הכליליים. התאם את התפר כדי להחיל 1-2 גרם של מתח בסיסי, כפי שמעיד המתח הדיאסטולי או השפל במעקב אחר מתח. הערה: הימנעו ממשיכת הלב מהצינורית או מפיתול אבי העורקים, ובכך התפשרו על זלוף כלילית.</li>
	<li>הניחו אלקטרודות פני שטח על הקטבים העליונים והנחותים של הלב כדי לתעד את האלקטרוקרדיוגרמה. הערה: השתמש בחוט קצב אפיקרדיאלי זמני לילדים עם הסרת המחט עבור אלקטרודת פני שטח גמישה המחוברת ל- Bio Amp (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>דגימת שפכים של סינוסים כליליים לניתוח באמצעות קטטר 24 G IV (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הפחת את עמידות הצינורית מההתנגדות הכוללת של המערכת כדי לקבל עמידות כלילית לפי חוק קירכהוף25.</li>
</ol>

<ol><li>Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szeląg, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff-still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+models%3A+Cardiovascular+system+studies+and+technological+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Biological+Engineering+and+Computing%22%5BJournal%5D)">Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances.</a> Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).</li>
<li>Döring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+heart+according+to+Langendorff+technique--function--application%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Bohemoslovaca%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused heart according to Langendorff technique--function--application.</a> Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B., Lim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+New+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).</li>
<li>Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retrograde-perfused+newborn+mouse+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation.</a> MethodsX. 7, 101058(2020).</li>
<li>De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+heart%3A+A+model+for+studying+myocardial+hypoxia+or+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia.</a> Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).</li>
<li>Liaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+shifts+in+ischemic+tolerance+and+cell+survival+signaling+in+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).</li>
<li>Chaudhary, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+soluble+epoxide+hydrolase+inhibition+and+CYP2J2+overexpression+on+postischemic+cardiac+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+and+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice.</a> Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sciences. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Onay-Besikci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiac+energy+metabolism+in+newborn%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiac energy metabolism in newborn.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+Advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiology+in+mice%3A+A+matter+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345(2012).</li>
<li>Tan, C., Lewandowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transitional+heart%3A+From+early+embryonic+and+fetal+development+to+neonatal+life%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).</li>
<li>Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+lipopolysaccharide+exposure+gender-dependently+increases+heart+susceptibility+to+ischemia%2Freperfusion+injury+in+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats.</a> International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163(2017).</li>
<li>Ziyatdinova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+If+Current+Blockade+on+Newborn+Rat+Heart+Isolated+According+to+Langendorff%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).</li>
<li>Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+coronary+flow+and+cardiac+function+after+bolus+adenosine+injection+in+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reports%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice.</a> Physiological reports. 4 (11), 12818(2016).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+cardiomyopathy+in+mice+lacking+transferrin+receptor+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart.</a> Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blümel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+%28pentobarbitone%2C+ketamine-xylazine%2C+carfentanyl-etomidate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate).</a> Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).</li>
<li>Janssen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anesthetics+on+systemic+hemodynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).</li>
<li>Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+anesthetic+regimen+for+surgery+in+mice+through+minimization+of+hemodynamic%2C+metabolic%2C+and+inflammatory+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).</li>
<li>Hard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymectomy+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Thymectomy in the neonatal rat.</a> Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).</li>
<li>Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Logic+computing+with+stateful+neural+networks+of+resistive+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Logic computing with stateful neural networks of resistive switches.</a> Advanced Materials. 30 (38), 1802554(2018).</li>
<li>Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapolating+brain+development+from+experimental+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Extrapolating brain development from experimental species to humans.</a> Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).</li>
<li>Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+effects+of+postnatal+thimerosal+are+mouse+strain+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent.</a> Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).</li>
<li>Edlund, A., Wennmalm, Å <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+in+rabbit+Langendorff+hearts+perfused+with+a+saline+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).</li>
<li>Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+demand+of+perfused+heart+preparations%3A+How+electromechanical+function+and+inadequate+oxygenation+affect+physiology+and+optical+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements.</a> Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).</li>
<li>Wiesmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+cardiac+function+and+mass+assessed+with+MRI+in+neonatal%2C+juvenile%2C+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).</li>
<li>Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+left+ventricular+pressure+in+late+embryonic+and+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice.</a> Journal of visualized experiments. (60), e3756(2012).</li>
<li>Bednarczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+dynamic+assessment+of+fluid+responsiveness+into+goal-directed+therapy%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis.</a> Critical Care Medicine. 45 (9), 1538(2017).</li>
<li>Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., Foo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langendorff-free+isolation+and+propagation+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+N-acetylcysteine+on+neonatal+cardiomyocyte+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury.</a> Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).</li>
<li>Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+mechanical+function+in+the+neonatal+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).</li>
<li>Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langendorff+and+ischemia+in+immature+and+neonatal+myocardia%3A+Two+essential+key-words+in+Today%27s+cardiothoracic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Austriaca%22%5BJournal%5D)">Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today's cardiothoracic research.</a> Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).</li>
<li>Popescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+an+early+start+in+understanding+perinatal+asphyxia+impact+on+the+cardiovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system.</a> Frontiers in Pediatrics. 8, 68(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

העבודה הנוכחית מתארת תותח אבי העורקים מוצלח וזלוף מדרדר בלב העכבר המבודד. חשוב מכך, הוא מאפשר לחוקרים להתגבר על המחסומים שגיל מורין הצעיר וגודל הלב הקטן הציגו בעבר8. הגישה אמנם אינה מורכבת בעיצובה, אך דורשת מידה משמעותית של מיומנות טכנית. צעדים מרכזיים שבהכרח יאתגרו אפילו את החוקרים המיומנים ביותר מבחינה טכנית יהיו שימורים של אבי העורקים ואבטחת הצינורית במקום. הקושי עם תותח יילודים אינו נובע אך ורק מגודלו הקטן של לומן אבי העורקים. האורך הקצר יחסית של אבי העורקים העולה (רקמת אבי העורקים בין המסתם א...

תכשירי לב Ex-vivo היו מרכיב עיקרי במחקרים פיזיולוגיים, פתופיזיולוגיים ופרמקולוגיים במשך למעלה ממאה שנה. בעקבות עבודתו של אליאס סיון בשנות ה-60 של המאה ה-19, אוסקר לנגנדורף התאים את מודל הצפרדע המבודדת לפרפוזיה מדרדרת, תוך הפעלת לחץ על שורש אבי העורקים כדי לספק זרימה כלילית עם פרפוזטמחומצן 1. באמצעות ההסתגלות שלו, לנגנדורף הצליח להדגים מתאם בין מחזור כלילי לתפקוד מכני2. הלב המנוקד ex-vivo retrograde, שלימים כונה טכניקת לנגנדורף, נותר אבן פינה בחקירה הפיזיולוגית, תוך מינוף פשטותו כדי לחקור בעוצמה את הלב המבודד בהיעדר קונפונדרים פוטנציאליים. הכנת לנגנדורף שונתה עוד יותר כדי לאפשר ללב לפלוט (מה שמכונה "הלב העובד") ולאפשר לפרפוסאט לחזורעל עצמו 3. עם זאת, נקודות הקצה הפיזיולוגיות העיקריות של העניין נותרו ללא שינוי. נקודות קצה כאלה כוללות מדדים של תפקוד התכווצות, הולכה חשמלית, חילוף חומרים לבבי ועמידות כלילית4.
כדי להעריך את תפקוד הלב בהכנת לב הצפרדע המקורית שלו, לנגנדורף מדד את המתח שנוצר על ידי התכווצות חדרית בציר האורך באמצעות תפר המחובר בין פסגת הלב לבין מתמר כוח. 5 התכווצות איזומטרית כומתה באופן זה עם מתח בסיסי המופעל על הלב בהיעדר מילוי חדרי. חידוד הגישה הוביל לבלונים מלאים בנוזלים שהוכנסו לחדר השמאלי דרך האטריום השמאלי כדי להעריך את ביצועי שריר הלב במהלך התכווצות איזובולומית6. כדי להעריך את קצב הלב ואת קצב הלב, ניתן להניח מוליכים על פני השטח על הקטבים של הלב כדי לאפשר לחוקרים להקליט את האלקטרוקרדיוגרמה. עם זאת, ניתן לצפות לברדיקרדיה יחסית, בהתחשב בניתוק העצבים המחייב. קצב חיצוני עשוי לשמש להתגברות על כך ולבטל את השתנות הדופק בין ניסויים1. מדד תוצאה נוסף, חילוף החומרים של שריר הלב, ניתן להעריך על ידי מדידת תכולת החמצן והמצע המטבולי בפרפוזט ובשפכים הכליליים וחישוב ההפרש ביניהם7. כימות לקטט בשפכים הכליליים יכול לסייע באפיון תקופות של חילוף חומרים אנאירובי כפי שניתן לראות עם היפוקסיה, היפופרפוזיה, איסכמיה-רפרפוזיה או הפרעות מטבוליות7.
עבודתו המקורית של לנגנדורף אפשרה את חקר לב היונקים לשעבר, תוך שימוש בחתולים כנושא העיקרי5. הערכת לב החולדה המבודדת צברה פופולריות באמצע המאה ה-20 עם הווארד מורגן, שפירט את מודל החולדה "לב עובד" בשנת 19675. השימוש בעכברים החל רק לפני 25 שנה בשל המורכבות הטכנית, שבריריות הרקמות וגודל הלב הקטן יחסית של מורין. למרות האתגרים הכרוכים בחקר עכברים, העלויות הנמוכות יותר והקלות של מניפולציה גנטית הגבירו את המשיכה והביקוש של תכשירי murine ex-vivo כאלה. למרבה הצער, היישום של הטכניקה הוגבל לבעלי חיים בוגרים, כאשר עכברים צעירים בני 4 שבועות הם הנבדקים הצעירים ביותר ששימשו למחקר ex-vivo עד לאחרונה 8,9. בעוד שעכברים צעירים הם "לא בוגרים יחסית" בהשוואה למבוגרים, התועלת שלהם כנבדקים למחקרי ביולוגיה התפתחותית מוגבלת מכיוון שהם נגמלו, על פי רוב, מסכר הלידה שלהם ובקרוב יתחילו אתגיל ההתבגרות 10. גיל ההתבגרות מתרחש הרבה מעבר למעבר לאחר הלידה בניצול מצע שריר הלב מגלוקוז ולקטאט לחומצות שומן11. לפיכך, רוב המידע על השינויים המטבוליים בלב היילודים נבע באופן היסטורי מעבודת ex-vivo במינים גדולים יותר כגון ארנבות וחזירי ים11.
ואכן, קיימות גישות חלופיות להכנת לנגנדורף. אלה כוללים ניסויים במבחנה, אשר חסרים את כל הנתונים הפונקציונליים של האיבר ואת ההקשר, או מחקרי in vivo. זה יכול להיות מאתגר ומסובך מבחינה טכנית על ידי משתנים מבלבלים כגון ההשפעות הקרדיווסקולריות והנשימה של חומר הרדמה נדרש, ההשפעה של קלט נוירוהומורלי, ההשלכות של טמפרטורת הליבה, המצב התזונתי של החיה וזמינות המצע12,13. מכיוון שגישת לנגנדורף מאפשרת לחקור את הלב המבודד-מחורר באופן אקס-ויוו באופן מבוקר יותר בהיעדר מבלבלים כאלה, היא הייתה וממשיכה להיחשב ככלי מחקרי רב עוצמה. לכן, הטכניקה המוצגת כאן מעניקה לחוקרים גישה ניסיונית למחקר ex-vivo של לב מורין שזה עתה נולד ומגבילה את הזמן לרפרפוזיה.
חקר הלב בתקופות של התפתחות הוא שיקול חשוב בהתחשב במעברים הביוכימיים, הפיזיולוגיים והאנטומיים הנרחבים המתרחשים במהלך התבגרות שריר הלב. מעברים מחילוף חומרים אנאירובי לזרחון חמצוני, שינויים בניצול המצע והתקדמות מהתפשטות תאים להיפרטרופיה הם תהליכים דינמיים המתרחשים באופן ייחודי בלב הלא בוגר11,14. היבט קריטי נוסף של הלב המתפתח הוא שגורמי לחץ שנתקלים בהם בתקופות הכרחיות עשויים לייצר תגובות מוגברות בלב התינוק ולשנות את הרגישות העתידית לעלבונות בבגרות15. אף על פי שעבודה קודמת השתמשה בחולדות, כבשים וארנבות שזה עתה נולדו כדי לחקור את לב היילודים הנוקשה בלנגנדורף, יש צורך בהתקדמות המתירה שימוש בעכברים בהתחשב בחשיבותו של מין זה למחקר הביולוגיה ההתפתחותית16. כדי לענות על הצורך הזה, מודל הלב הנולד הראשון של מורין לנגנדורף באמצעות בעלי חיים בני 10 ימים הוקם לאחרונה6. מוצגת כאן שיטה המאפשרת שימורים מוצלחים של אבי העורקים ומבססת זלוף מדרדר של לב המורין המבודד שזה עתה נולד. גישה זו עשויה לשמש לפרמקולוגיה, איסכמיה-רפרפוזיה או מחקרי חילוף חומרים המתמקדים בתפקוד איברים שלמים או שניתן להתאים אותה לבידוד של קרדיומיוציטים.

<table><tbody><tr><td>מכרסם לנגנדורף מנגנון</td><td>Radnoti</td><td>130102EZ</td><td></td></tr><tr><td>24 גרם קטטר</td><td>BD</td><td>381511</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם מחט על 1 מ"ל מזרק משולב</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם מחט פלדה</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>5-0 תפר משי</td><td>Ethicon</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>ביו אמפר</td><td>ADInstruments</td><td>FE135</td><td></td></tr><tr><td>ביו כבל</td><td>ADInstruments</td><td>MLA1515</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr> מי <tr><td>חימום במחזור אמבט</td><td>Haake</td><td>DC10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים קשתית</td><td>Medline</td><td>MDS10033Z</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>למצוא מספריים קפיצים</td><td>קנט</td><td></td><td>מתמר</td></tr><tr><td>כוח</td> INS600127 <td>ADinstruments</td><td>MLT1030/D</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>400-01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בלחץ גבוה</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>50P184</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים להלבשת קשתית</td><td>קנט</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>מעוקל בסגנון תכשיטן מלקחיים עדינים</td><td>Miltex</td><td>17-307-MLTX</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>משאבת רולר</td><td>גילסון</td><td>מיניפולס 3</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים לניתוח</td><td>קנט</td><td>INS600393-G</td><td></td></tr><tr><td>חוט קוצב לב זמני</td><td>Ethicon</td><td>TPW30</td><td></td></tr><tr><td>מתמר כוח בטווח רחב</td><td>ADIתנאים</td><td>MLT1030/A</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקה שונה לשימוש בלבבות מורין יילודים בהכנת לנגנדורף

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

השימוש ב-ex-vivo retrograde perfused heart הוא כבר מזמן אבן פינה בחקר איסכמיה-רפרפוזיה מאז פיתוחו על ידי אוסקר לנגנדורף לפני למעלה ממאה שנה. למרות שטכניקה זו יושמה על עכברים במהלך 25 השנים האחרונות, השימוש בה במין זה הוגבל לבעלי חיים בוגרים. פיתוח שיטה מוצלחת לשימור עקבי של אבי העורקים של מורין ילודים יאפשר מחקר שיטתי של הלב המבודד במשך תקופה קריטית של התפתחות לבבית הניתנת למהנדס גנטית ובעלות נמוכה. שינוי הכנת הלנגנדורף מאפשר תותח והקמת רפרפוזיה בלב המורין היילודי תוך מזעור הזמן האיסכמי. אופטימיזציה דורשת טכניקה של שני אנשים כדי לאפשר שימורים מוצלחים של אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומחט זמינה מסחרית שונה. השימוש בגישה זו יקבע באופן אמין פרפוזיה מדרדרת תוך 3 דקות. מכיוון שהשבריריות של לב העכבר היילוד וגודל החלל בחדר מונעת מדידה ישירה של לחץ תוך חדרי שנוצר באמצעות בלון, יש צורך בשימוש במתמר כוח המחובר על ידי תפר לפסגת החדר השמאלי כדי לכמת את מתח התכווצות האורך. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבסס בהצלחה הכנה ללב מורין של מורין שזה עתה נולד בזרימה קבועה מבודדת, ומאפשרת לחקור ביולוגיה התפתחותית של הלב באופן אקס-ויוו . חשוב לציין שמודל זה יהיה כלי רב עוצמה לחקור את התגובות הפיזיולוגיות והפרמקולוגיות לאיסכמיה-רפרפוזיה בלב היילודים.

עכברי P10 שימשו כדי לדגום נקודת זמן בינקות אנושית 26,27. 15 לבבות עכברים מבודדים מדגם C57Bl/6 נקטפו ונלקחו בהצלחה. לבבות היו חדורים עם זרימה רציפה של 2.5 מ"ל min-1 של KHB מחומצן מחומם. נמדדו פרמטרים מטבוליים, כולל מיצוי גלוקוז, צריכת חמצן, ייצור לקטט ופרמטרים פיזיולוגיים כגון קצב לב, לחץ פרפוזיה ועמידות כלילית. אלקטרודות פני השטח שימשו לתיעוד אלקטרוקרדיוגרמה רציפה, שאיפשרה לקבוע את הקצב והקצב הפנימיים (איור 2). כוח התכווצו...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תותח אבי העורקים וזליפה מדרדרת של לב מורין ילודים לשעבר . אסטרטגיה של שני אנשים, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומחט מד קטנה קהה, מאפשרת תותח אמין. כימות מתח התכווצות אורכי מושג באמצעות מתמר כוח המחובר לפסגת החדר השמאלי.

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

גישה זו מבססת באופן אמין זלוף מדרדר של לב עכבר ה-ex vivo היילודי תוך פחות משלוש דקות. ובכך להפחית את גיל המחקר הצעיר ביותר האפשרי מכמה שבועות ל -10 ימים לאחר הלידה. מודל מדרדר מבודד זה מאפשר לחקור את לב היילודים בתקופה קריטית של התפתחות לב במין הניתן למהנדס גנטית ובעלות נמוכה.בעוד שמודל זה מתאים את עצמו לחקר התגובות הפיזיולוגיות והפרמקולוגיות לאישמיה-רפרפוזיה בלב היילודים. זה יכול לשמש גם לבידוד קרדיומיוציטים. כדי לייצר את צינורית אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד, השתמשו במספריים חדים כדי לחתוך את הקצה ולהקהות את קצהה של מחט נירוסטה בעלת 26 מדים, תוך הקפדה שלא לחתוך או להגביל את קוטר לומן המחט.לאחר מכן החליקו את קצה החתך כדי להסיר את כל הבורות על ידי גירוד עדין של הקצה הקהה בחלק העליון של ספסל המעבדה באמצעות תנועה הלוך ושוב. לאחר מכן, חברו את הצינורית המפוברקת למנגנון לנגנדורף והעריכו זרימה והתנגדות. מדידת קצבי הזרימה דרך הצינורית על ידי איסוף ומדידה של כמות המאגר במרווח של דקה אחת.כדי לכמת את הפרש הלחץ על פני הצינורית בזמן שחיץ קרבס-הנסלייט זורם, מדוד את הלחץ במערכת עם ובלי הצינורית המחוברת. לאחר מכן חשב את התנגדות הצינורית באמצעות הנוסחה הבאה. לאחר מכן, הסר את צינורית 26 המדים ממנגנון לנגנדורף והצמד צינור בלחץ גבוה לאתר התצפית במנגנון.לאחר מכן חברו את צינורית אבי העורקים לקצה הדיסטלי של הצינורות והורידו את האוויר מהצינוריות ואת הצינורית עם חיץ מחומצן, מה שמבטיח שכל הבועות יוסרו. כדי למנוע היווצרות של מיקרותרומבי כלילי, תן זריקה תוך-צפקית של הפרין לגור עכבר בן 10 ימים באמצעות מחט של 26 מדים על מזרק מיליליטר אחד. אפשר מספר דקות עבור הפרין להסתובב לפני שתמשיך עם הזרקה של כל הרדמה.לאחר מכן, הניחו את העכבר המרדים בתנוחת השכיבה ואבטחו את הגפיים מיד עם אובדן ההכרה. התחילו לקצור ברגע שהחיה לא מגיבה לצביטת הבוהן בזמן שהחיה נושמת באופן ספונטני במהלך הנתיחה הראשונית. שימוש במספריים ניתוח ישרים גורם לחתך תת-אקסיפידי רוחבי על פני רוחב החיות וחושף את חלל הבטן.בקשו מעוזר לתפוס את התהליך ה-xiphoid עם מלקחיים, ואז חתכו את הצלעות באופן דו-צדדי לאורך קו בית השחי האמצעי בכיוון הצפל ושחזרו את עצם החזה והצלעות באופן קרניאלי כדי לחשוף את איברי בית החזה. לאחר זיהוי הסרעפת בצורה מעולה, להפוך את החלק הקדמי לחלוטין. זהה את הווריד הנבוב התחתון האינפרא-דיאפרגמטי הנבוב מעל הכבד והעביר אותו עם מספריים איריס מעוקל תוך שמירה על פנים קל במתח צפאלאד על הקטע הפרוקסימלי עם מלקחיים של איריס.לאחר מכן, חותכים אחורית לאורך המשטח הפנימי של עמוד השדרה באמצעות מספריים מעוקלים של איריס תוך משיכת הווריד הנבוב התחתון למעלה והחוצה מחלל בית החזה. כאשר הלב מגויס, זווית את המספריים קדימה ולנתק את כלי הדם הגדולים בצורה מעולה כדי להסיר לחלוטין את הלב והריאות. מיד להטביע את הדגימה בחיץ קר כקרח Krebs-Henseleit או מלוחים.הלב צריך להפסיק לפעום תוך שניות. מניחים פיסת מגבת נייר בתחתית צלחת פטרי רדודה כדי לספק חיכוך לייצוב הלב במהלך התותח. הרטיבו את מגבת הנייר עם חיץ Krebs-Henseleit קר כקרח כדי למנוע מהלב להיצמד אליה.הניחו את צלחת הפטרי המוכנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח והתאימו את המיקוד. כעת, הניחו את צינורית אבי העורקים המחוברת לצינורות הארכת הלחץ הגבוה מתחת למיקרוסקופ הניתוח, יחד עם תפר משי 5-0 הקשור באופן רופף סביב מרכזו. לאחר הצבת איברי בית החזה שנכרתו בצלחת פטרי, זהה את התימוס על ידי הברק הלבן שלו ושתי האונות וכיוון את הדגימה כך שהתימוס יהיה קדמי ונעלה.לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מפרידים באופן בוטה את האונות של התימוס וחושפים את הכלים הגדולים. לאחר מכן זהה את אבי העורקים על ידי איתור תכונות הסתעפות מובחנות של קשת אבי העורקים והעתק אותה רק פרוקסימלית להמראה של העורק התת-קלבי באמצעות מספריים חדים עדינים. כעת תפסו בעדינות את אבי העורקים הטרנסקטציה באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים בסגנון תכשיטן, ופתחו בזהירות את אבי העורקים עם מחט קהה באורך 26 מדים, תוך הקפדה שלא לפגוע במסתם אבי העורקים.באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים, תפסו את אבי העורקים סביב הצינורית ויזמו זלוף מדרדר כדי להגביל את הזמן האיסכמי. בקשו מהעוזר לתפוס את קצות התפר הקשור באופן רופף ולעטוף בזהירות את אבי העורקים סביב הצינורית. תפר את התפר מעל או מתחת למלקחיים המעוקלים העדינים ואז הידקו את התפר ואישרו את הלימות הזרימה הכלילית.נתקו את צינורות הלחץ הגבוה ממנגנון לנגנדורף, תפסו את רכזת הצינורית ונתקו את המחט הבוטה מצינורות הארכת הלחץ הגבוה. לאחר מכן חבר במהירות את רכזת הצינורית למנגנון. ברגע שהלב תלוי על מנגנון לנגנדורף במצב הרגיל, זלוף הולם מאושר.יש לקצץ בזהירות את הריאה, את התימוס ואת הרקמה העודפת. לאחר מכן סובבו את האטריום הנכון כדי לאפשר לפלוחי הסינוסים הכליליים לטפטף בחופשיות. צור קשר קטן בסוף תפר משי 5-0, ואז חודר חתיכה קטנה של סרט פרפין עם המחט ומחליק את הפרפין לקצה הקשור.מעבירים בזהירות את המחט דרך פסגת החדר ומושכים את התפר דרך הלב עד שסרט הפרפין נצמד אל הקיר הצדדי של החדר. מעבירים את המחט דרך פתח מעיל החימום מלא המים של מנגנון הלנגנדורף, כך שניתן יהיה לעטוף את הלב ולחמם אותו. לאחר מכן חברו את המחט למתמר הכוח תוך הימנעות מטפטוף הסינוסים הכליליים.התאימו את התפר כך שיפעילו 1 ל-2 גרם של מתח בסיסי כפי שמצוין על ידי המתח הדיאסטולי או מעקב אחר כוונות השפל. לאחר מכן הניחו אלקטרודות פני שטח על הקטבים העליונים והנחותים של הלב כדי לרשום את האלקטרוקרדיוגרמה. לבסוף, דגימת שפכים סינוסים כליליים לניתוח באמצעות קטטר תוך ורידי 24 מד.אלקטרודות פני השטח שימשו להקלטת אלקטרוקרדיוגרמה רציפה, שאיפשרה לקבוע את הקצב והקצב הפנימיים. כל הלבבות הפגועים כראוי פועמים באופן ספונטני בקצב הסינוסים. אסטרטגיית זלוף זו ענתה על הצרכים המטבוליים של לב העכבר שזה עתה נולד, בהתחשב בייצור לקטט זניח ובמיצוי חמצן באחוזים נמוכים וצריכת גלוקוז.משתנה פיזיולוגי פירושו, כמו קצב הלב הפנימי הממוצע המנוטר ולחצי הזלוף הממוצעים שנצפו באבי העורקים, נרשמו וחושבו גם הם. יש לקחת בחשבון כמה קריטריונים מחריגים כגון הזמן הנדרש כדי ליזום רפרפוזיה, משך הפרעת קצב ולחץ פרפוזיה של אבי העורקים כדי להבטיח עקביות של הכנת היילודים. לאחר הקמת זלוף, התערבות כגון אספקת תרופות, אינדוקציה של פציעת איסכמיה-רפרפוזיה, שינויים של מטבוליטים או מסירה של סוכנים אנזימטיים לבידוד קרדיומיוציטים עלולה להתרחש.

modified-technique-for-use-neonatal-murine-hearts-langendorff

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

בסרטון זה אנו מבצעים זילוח מדרדר לנגנדורף של לב עכבר מבודד. במהלך ההליך, הפעילות הלבבית של הלב נשמרת על ידי ניקוב אותו לאחור עם פתרון זילוח דרך העורקים הכליליים באמצעות צינורית המוחדרת לתוך אבי העורקים העולה. המודל משמש לחקר הפתופיזיולוגיה הלבבית של הלב.

זילוח לב מדרדר לנגנדורף: טכניקת Ex Vivo לניקוב לב עכבר מבודד

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

פרוטוקול זה מתאר מודל הניתן לשחזור של התחדשות הלב על ידי אינדוקציה כירורגית של אוטם שריר הלב בחדר השמאלי של עכברי יום 1 לאחר הלידה. השיטה כוללת אינדוקציה של הרדמה היפותרמית וקשירה של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.

אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

אנו מספקים פרוטוקול להפרדת מקרופאג ' לב יילודים והשתלה ללב עכבר מבוגר, אשר יכול להיות דרך מבטיחה לקדם תיקון לב.

השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

מוצג כאן פרוטוקול לכימות אמין של תפקוד החדר הימני והשמאלי של לבבות תורמים לאחר שימור קר באמצעות מערכת זילוח ex vivo .

הערכה של תפקוד דו-חדרי Ex Vivo Murine במודל לנגנדורף

למד שיטת הלבדה רטרוגרדית בלבבות עכברים נאונטליים לחקר פיתוח לבבי ותגובות פיזיולוגיות. שיטה זו מאפשרת חקר בגיל 10 ימים לאחר הלידה ומאפשרת בידוד קרדיומיוציטים.

טכניקה שונה לשימוש בלבבות מורין יילודים בהכנת לנגנדורף

גלה סרטונים נוספים