Name: ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למד שיטה לייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים ממסותליומה פלאורלית. פרוטוקול זה מספק מערכת מודל אינ ויטרו להערכת ההשפעה של הגידול על התגובה החיסונית ומאפשר מחקר מעמיק של פונקציית תאי הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לראקל לאזה-בריוויסקה על תרומתה להתחלת פרוטוקול זה ולד"ר בוריס ספסי, רזא מהרן ודיוויד רייס על שיתוף הפעולה באיסוף רקמות. אין מימון נוסף הקשור לעבודה זו.

<ol><li>Guzman-Casta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+progression-free+and+overall+survival+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma.</a> Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).</li>
<li>Baas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+nivolumab+plus+ipilimumab+in+unresectable+malignant+pleural+mesothelioma+%28CheckMate+743%29%3A+a+multicentre%2C+randomised%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).</li>
<li>Testa, J. R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of malignant mesothelioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 101(2020).</li>
<li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li>
<li>Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+three+novel+human+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines%3A+morphological+and+cytogenetical+studies+and+EGFR+mutation+status%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status.</a> Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).</li>
<li>Chernova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+reveals+primary+mesothelioma+cell+lines+recapitulate+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Han, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+N-cadherin+in+pleural+mesotheliomas+and+E-cadherin+in+lung+adenocarcinomas+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).</li>
<li>Tachibana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin-mediated+aggregate+formation%3B+cell+detachment+by+Trypsin-EDTA+loses+N-cadherin+and+delays+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).</li>
<li>Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+most+proteins+in+the+cell+surface+proteome+is+unaffected+by+trypsin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment.</a> Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).</li>
<li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pancreatic+cancer+cells+from+a+patient-derived+xenograft+model+allows+for+practical+expansion+and+preserved+heterogeneity+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture.</a> American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).</li>
<li>Derycke, L. D., Bracke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+in+the+spotlight+of+cell-cell+adhesion%2C+differentiation%2C+embryogenesis%2C+invasion+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling.</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).</li>
</ol>

CH היא חברה ב- SAB עבור Briacell Therapeutics ובקרן המחקר היישומי של מזותליומה. לכל שאר המחברים אין מה לחשוף.

בעוד שפרוטוקול זה הוא פשוט, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לעקוב אחריהם מקרוב. ההקפאה של המעבר המוקדם חשובה כדי לשמר את היכולת לחזור על תהליך העשרת תאי הגידול אם בתחילה לא הצליח. היכולת להעריך זיהום פיברובלסטי בעין כדי להחליט על טכניקת הפיצול והרעב התקשורתי הנכונה היא חיונית למניעת צמיחת יתר של פיברובלסטים בתרבית. בנוסף, שיטת הטריפסיניזציה הדיפרנציאלית דורשת תצפית זהירה על התאים במהלך הדגירה. התאים עשויים להרים את צלחת הפלסטיק בקצבים שונים, וזה ישתנה מקו התא לקו התא. תוך כדי לימוד תהליך זה ועידון שלב קבלת ההחלטות הזה, ניתן ל...

מזותליומה ממאירה (MPM) היא גידול נדיר הקשור מאוד לחשיפה לאסבסט. למרות שגישות מבוססות אימונותרפיה הראו תוצאות מעודדות, יש מחסור באפשרויות הטיפול הזמינות לחולים המפתחים מחלה זו, ושיעור ההישרדות הכולל ל-5 שנים נמוךב-1,2. במוסדות רבים נעשים מאמצים להבין טוב יותר את המחלה ולזהות מטרות טיפוליות חדשניות שעשויות לשפר את תוצאות המטופלים. בעוד ישנם מודלים מרובים של עכברי מזותליומה, הגישה לתאי גידול מזותליומה ראשוניים מוגבלת יותר3. הרחבה במבחנה של תאי גידול ראשוניים של מזותליומה תספק מערכת מודל רבת ערך שניתן להשתמש בה כדי לחקור את תאי הגידול ישירות ואת האינטראקציה שלהם עם תאי חיסון אוטולוגיים כגון לימפוציטים המסתננים לגידול. אמנם היו דיווחים על התרחבות של קווי תאים סרטניים ראשוניים של מזותליומה, אך אלה מעטים ואינם מספקים הליך פעולה סטנדרטי מפורט (SOP). יתר על כן, מעט שורות תאים זמינות ממקורות מסחריים כגון אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC). בעוד שהזמינות של קווי הגידול הראשוניים מוגבלת, הוכח כי ניתן להרחיב את תאי הגידול מהתפרצויות pleural ישירות מרקמת הגידול 4,5. בנוסף, הודגם כי קווי תאים מורחבים של הגידול משמרים את הפרופיל המולקולרי של הגידול המקורי 4,5,6.
המעבדה שלנו חוקרת את המיקרו-סביבה החיסונית-גידולית של MPM ופיתחה שיטה להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים של MPM ממקרים שעברו כריתה כירורגית. שיטה זו מותאמת מניסיוננו בהקמת קווי תאים ראשוניים של גידול מלנומה גרורתית. מטרת עבודה זו היא לספק גישה מפורטת ומעשית להרחבת קו הגידול הראשוני של מזותליומה באמצעות מערכת מודל דו-ממדית ופרופיל פנוטיפי לאחר מכן. בהתחשב בהצלחה האחרונה של אסטרטגיות חסימת מחסום המכוונות נגד CTLA4 ו- PD-1 בהגדרת קו ראשון2, היכולת ליצור קווי גידול ראשוניים רבים יכולה לקדם את ההבנה של שני מנגנוני ההתנגדות הפנימיים של הגידול, כמו גם לספק מערכת מודל חשובה להערכת זיהוי תאי T, ובכך להעמיק את הבנתנו את התגובה החיסונית ב- MPM.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שכל גידול מכיל מיקרו-סביבה שונה, ויש רמה גבוהה של שונות של הצלחת ההתרחבות. בנוסף, שיטה זו בוחרת עבור תאים סרטניים שיכולים להתרחב במערכת תרבית דו-ממדית. שיטות אחרות הכוללות ייצור של תרבית ספרואידית או אורגנואידית תלת-ממדית יכולות לספק גישה חלופית שעשויה לאפשר שיעור הצלחה גבוה יותר של התפשטות או לגרום ליכולת להפיק קווי תאים שאינם מסוגלים להתרחב במערכת דו-ממדית מסורתית. תרביות תלת מימד כאלה הוכחו כמועילות ליצירת סוגי גידולים שקשה להרחיב, למשל, סרטן הלבלב7.

<table><tbody><tr><td>פיפטות סרולוגיות 10 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל פיפטות שאיבה</td><td>BD Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלטות 6 בארות, תרבית רקמות קורנינג</td><td></td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>תערובת פרוטאז-קולגנאז הנחשבת ליעילה יותר בשימור אפיטופים לזרימה ציטומטרית.</td></tr><tr><td>אנטי-CD325 (N-Cadherin) PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-3259-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD90 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>561558</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-מזותלין APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-118-096</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר 30%</td> <td>Sigma</td><td>A8577-1L</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דיסוציאציה של תאים, ללא אנזימים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cell מסננת (70 ומיקרו; מ)</td> צנטריפוגה <td>Greiner Bio-One</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>עם מתאמי</td><td></td><td></td><td></td>15 מ"ל ו-50 מ"ל</tr><tr><td>קולגנאז סוג 1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-0130</td><td>ממיסים 1.5 גרם של קולגנאז מסוג I ל-100 מ"ל של DMEM סטרילי ו-aliquot בנפחים של 5 מ"ל. סמן היטב ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תא הקפאה בקצב מבוקר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>CulturPlate-96</td><td>Packard Instrument Company</td><td>6005680</td><td>לבן, אטום 96 בארות מיקרופלייט.</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (מלבלב בקר)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4527</td><td>Aliquot ב-50 &mu; L, סמן היטב ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לשמור על 4 מעלות; C עד חודש.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 200 הוכחה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>FACS צינורות מסנן עליון</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo-dissociator עם מכשיר חימום</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td>כולל שרוולי מכשירי חימום מיוחדים המשמשים להפעלת חום על צינורות C במהלך הפירוק.</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Aliquot ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק, 500 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>היאלורונידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3506</td><td>ממיסים 0.15 גרם של היאלורונידאז לתוך 100 מ"ל DMEM סטרילי של Lof ומחלקים ל-1.0 מ"ל מ"ל. סמן היטב ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>פאזה הפוכה</tr><tr><td>קולט אדים</td><td></td><td></td><td></td>זרימה למינרית</tr><tr><td>צבע צהוב חי/מת Life</td><td>Technologies</td><td>L-34968</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטור, 20 ומיקרו; L</td><td>ART</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטור 0.5-20 ומיקרו; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycoalert בקרת בדיקת סט</td><td>Lonza</td><td>LT07-518</td><td>Aliquot בקרות חיוביות ואחסן ב-20 &deg;C.</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה Mycoalert Plus</td><td>Lonza</td><td>LT07-710</td><td>מגיב ומצע Aliquot ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס. שמור את המאגר והאליקוט הנותרים לבקרה שלילית ואחסן ב-20&0 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>הכן מלאי על ידי סינון דרך מסנן מזרק PVDF (Millex cat. no. SLVV033RS) ו-aliquot מתחת למכסה אדים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין 10,000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות סיוע</td><td></td><td></td><td></td>פיפט</tr><tr><td>עם יכולות זוהרות</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>כל קורא צלחות עם מפרטים אלה ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה</td><td>קורנינג</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>אנדווין</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום סטרילית Stericup Quick Release-GP, 0.22 ומיקרו; m PES Express PLUS, 500 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>מסנן Steriflip-GP, 0.22 ומיקרו; m PES Express PLUS, 50 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות T25, צלוחיות</td><td>קורנינג</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 מטופלות בתרבית רקמות,</td><td>קורנינג</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפן 0.4%</td> <td>ג'יבקו</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 0.05% </td><td>קורנינג</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain תמיסת תפוז/פרופידיום יודיד (AO/PI)</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-5ML</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של pleural

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

חסרות מתודולוגיות עדכניות להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים מסוגי גידולים נדירים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להרחבת תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural (MPM) שעברה כריתה כירורגית וממאירה על ידי מתן סקירה מלאה של התהליך מעיכול להעשרה, הרחבה, שימור בהקפאה ואפיון פנוטיפי. בנוסף, פרוטוקול זה מציג מושגים ליצירת גידולים שעשויים להיות שימושיים עבור סוגי גידולים מרובים כגון טריפסיניזציה דיפרנציאלית והשפעת שיטות הדיסוציאציה על זיהוי סמני פני השטח של התא לאפיון פנוטיפי. המגבלה העיקרית של מחקר זה היא בחירת תאי הגידול שיתרחבו במערכת תרביות דו-ממדית (דו-ממדית). וריאציות לפרוטוקול זה, כולל מערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות), תוספי מדיה, ציפוי צלחת לשיפור ההידבקות ושיטות פירוק חלופיות, יכולות לשפר טכניקה זו ואת שיעור ההצלחה הכולל של הקמת קו גידול. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק שיטת בסיס לביסוס ואפיון תאי גידול מגידול נדיר זה.

כדי לקבוע זיהום פיברובלסטים של תרביות מעבר מוקדם, התאים נבחנים באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך כדי לזהות את התדירות של פיברובלסטים ביחס לתאים הדבקים האחרים הקיימים. איור 1 מראה דוגמאות לעלייה בזיהום פיברובלסטים של 80% (איור 1A), 50% (איור 1B) ו-30% (איור 1C), בהשוואה לתרבית ללא זיהום פיברובלסט (איור 1D). בהתבסס על הערכה חזותית זו, נעשות התאמות לתנאי ההרחבה כמתואר לעיל. ברגע שנו...

מטרת מאמר שיטה זה היא להדגים מתודולוגיה חזקה וניתנת לשחזור להעשרה, יצירה והרחבה של קווי תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural שנכרתה בניתוח.

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

פרוטוקול זה מספק בסיס להרחבת תאי הגידול, אשר בתורו מאפשר מחקר מעמיק של תפקוד תאי הגידול ומצבים גנומיים. בנוסף, הוא מספק מערכת מודל במבחנה כדי להעריך את ההשפעה של הגידול על התגובה החיסונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת פרוטוקול מבוסס להקמת קווי גידול מזותל מרקמת המטופל.אין כיום פרוטוקול סטנדרטי עבור מערכת מודל זו. ההיבט הקשה ביותר של טכניקה זו הוא נוכחות של זיהום פיברובלסטים בתרביות מעבר מוקדמות. זה קריטי שתהיה הבנה מוצקה של פיברובלסטים לעומת מורפולוגיה של תאי הגידול כדי לקבוע אם ניסיונות הרעב של פיברובלסטים עובדים.התחילו בהעברת 10 מיליליטרים של קוקטייל אנזימטי לעיכול גידול לצינור דיסוציאציה. מעבירים את פיסת רקמת הגידול למכסה סטרילי בעל שש בארות באמצעות אזמל סטרילי. הסר את כל הרקמות הנמקיות השומניות וקרישי הדם באמצעות אזמל סטרילי חדש ומלקחיים.חותכים את כל רקמת הגידול לרסיסים קטנים של מילימטר מעוקב אחד. כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת המלח המאוזנת של האנק הסטרילי, או HBSS, לרקמת הגידול. העברת שברי הגידול לצינור הדיסוציאציה המכיל 10 מיליליטרים של קוקטייל אנזימטי לעיכול גידול.סגור את הצינור בחוזקה. מניחים אותו בצד על דיסוציאטור הרקמה ומספקים חום לדיסוציאטור. בחר את ההגדרה המתוכנתת מראש על הדיסוציאטור לערכת הדיסוציאציה של גידול אנושי של 37 מעלות צלזיוס שנקבעה 1 ובדוק את המצב לאחר 10 דקות כדי לוודא שאין שגיאת סתימה מסומנת על ידי האור האדום המהבהב.לאחר שעה, הסר את צינור הדיסוציאציה והנח אותו במכסה זרימה למינרי. סנן את הגידול המעוכל על ידי הנחת מסננת של 70 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר וצנרת הגידול המעוכל באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר על המסנן. אם המסנן נתקע, עבור למסנן חדש.יש לשטוף את צינור הדיסוציאציה ב-10 מיליליטרים של אמצעי עיכול טריים של הגידול ולשטוף את המסנן. הסר את המסנן והשלך אותו. הביאו את הנפח הכולל ל -40 מיליליטרים עם מדיום העיכול של הגידול.צנטריפוגה ב 500 x g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר המחוברת למקור ואקום, שואפים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור ומחזירים את התאים באמצעות 10 מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי. ואז, שוב, צנטריפוגה על הצינורות ושואפים את הסופרנאטנט כפי שהודגם.לאחר מכן, יש להחיות את התאים בשלושה מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי ולהעביר את תרחיף התא לבאר אחת של צלחת סטרילית בעלת שש בארות. שמור את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, מעבירים את המדיום המשומש מהגידול המעוכל בבאר אחת לבאר חדשה באותה צלחת של שש בארות, ואז מוסיפים שלושה מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי לבאר אחת.באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך, לקבוע את אחוז הזיהום של פיברובלסטים בתרבית המעבר המוקדמת. אם זיהום הפיברובלסטים גדול מ-20% מהתאים בתרבית המעבר המוקדמת, המשיכו להתרבות לאחר החלפת מדיום הגידול במדיום הסרום המופחת. אם אוכלוסיית הפיברובלסטים אינה מצטמצמת ל-10% או פחות, יש לשטוף בעדינות את הבאר עם PBS כדי להסיר את הסרום המכיל את המדיום המכיל.מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לבאר בצלחת של שש בארות. מניחים את הצלחת או הבקבוקון של ששת הבארים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסר את הצלחת או הבקבוק מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.כאשר התאים מתרוממים או צפים באופן חלקי, הסר בעדינות את התאים המרחפים וטריפסין בלבד. מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם. חזור על טריפסיניזציה עד שיוסרו שלושה עד ארבעה שברים.צנטריפוגה של כל השברים העצמאיים ברזולוציה של 500 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר המחוברת למקור ואקום, שאפו את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור. החייאת התאים באמצעות חמישה מיליליטרים של מדיום סרום מופחת סטרילי.צלחת את התאים בבקבוק T-25 עבור כל שבר ומניחים את הצלוחיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לצורך שימור בהקפאה של תאי מעבר מוקדמים, הפשרו שפופרת אחת של מדיום הקפאה אליקוטית. אסוף את התאים על ידי טריפסיניזציה על ידי שטיפת הצלחת תחילה עם PBS והוספת טריפסין כפי שהודגם בעבר.מניחים את הבקבוקון באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. הסר את הבקבוקון מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מתרוממים או צפים, הסר בעדינות את התאים המרחפים ואת טריפסין.מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צנרת בעדינות. הסר 20 מיקרוליטרים של תרחיף התא לצורך ספירה.לאחר מכן צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 500 x g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר התאים מסתובבים, ספרו באמצעות פרוטוקול ספירה ספציפי למעבדה, כגון טריפאן כחול או אקריפין כתום/פרופידיום יודיד. בצעו שימוש חוזר בתאים לאחר צנטריפוגה במדיום הקפאה עם מינימום של 5 x 10 עד התאים השישיים למיליליטר של מדיום הקפאה והעבירו מיליליטר אחד של תרחיף תא זה ל-1.5 מיליליטר של קריוביאלים מסומנים מראש.מניחים את הקריוביציאלים בתא הקפאת קצב מבוקר ומעבירים אותם מיד למינוס 80 מעלות צלזיוס. הנתון מראה זיהום מוגבר של 80%50% ו-30% בהשוואה לתרבית ללא זיהום פיברובלסטים. נתון זה מראה צביעת משטח ציטומטריה מייצגת של זרימה של ארבעה קווי גידול מזותליומה ראשוניים, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H וקו גידול מלנומה, MEL526 כבקרה שלילית.קווי תאים אלה יכולים לבטא הן מזותלין והן N-cadherin. החשיבות של בדיקת ההשפעה של ניתוק אנזימטי על ביטוי סמני חלבון על פני השטח מוצגת גם מכיוון שגם טריפסין וגם תערובת הפרוטאז קולגן גרמו לאובדן ביטוי פני השטח של N-cadherin, בעוד ש-CD90 לא הושפע. שלבים חשובים כוללים עיבוד נכון של הגידול כולל הסרת דם ושומן לפני העיכול, זיהוי זיהום פיברובלסט וקביעה כיצד להגביל צמיחת יתר של פיברובלסטים היא חיונית.שיטה חשובה בעקבות הליך זה כוללת מבחני לימפוציטים ציטוטוקסיים לבדיקת יכולתם של תאי T אוטולוגיים לזהות תאי גידול שמקורם בחולה. טכניקה זו תזהה קולטנים חדשים נגד תאי T ספציפיים לגידול שיכולים להיות בעלי חשיבות טיפולית. בנוסף, זה יאפשר לנו לחקור את האינטראקציה בין גידול לבין גידול מזווג מסתנן לימפוציטים ותפקוד לקוי של מערכת החיסון.

generation-expansion-primary-malignant-pleural-mesothelioma-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל עכבר של הפצה פלאורלית על ידי הזרקת תרחיף תאי סרטן ריאות לחלל החזה של עכבר מדוכא חיסוני.

הקמת מודל עכברי של סרטן ריאות מפושט פלאורלי

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

פרוטוקול הבאים מתמקד הקמת תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה (STS). מודל זה יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את רקע מולקולרי ופרופיל תרופתי של ממאירות נדירים אלה, שעשוי לייצג נקודת התחלה עבור מחקרי המשך שמטרתם לשפר את ניהול STS.

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות כדי ליצור מודלים של מטופלים שנגזר על המטופל (PDX) ושורות של תאים סרטניים העיקרי מדגימות סרטן הקיבה כירורגית. השיטות מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

מאמר זה מתאר את הדור של מודל העכבר אורתוטופית של מזותליומה האנושית על ידי השרשה של H2052/484 מזותליומה תאים לתוך חלל הצפק של עכברים החיסוני החיסונית. ניטור האורך של הפיתוח של גידולים הפנים הוערך על ידי לא פולשני ובלה מורכבת ודאלי [18F] -2-fluoro-2-deoxy-D-גלוקוז פליטת פוזיטרון טומוגרפיה ודימות טומוגרפיה ממוחשבת.

השרשה וניטור על ידי PET/CT של מודל אורתוטופית של מזותליומה של האדם בעכברים האטורי

למד שיטה לייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים ממסותליומה פלאורלית. פרוטוקול זה מספק מערכת מודל אינ ויטרו להערכת ההשפעה של הגידול על התגובה החיסונית ומאפשר מחקר מעמיק של פונקציית תאי הגידול.

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

גלה סרטונים נוספים