Name: יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: חקור שיטות RNAi להשתקת גנים במקק אמריקאי (Periplaneta americana). פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללמוד על מנגנונים מולקולריים של התנהגות, התפתחות ורגנרציה בחרקים שאינם מתאימים לעריכת גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ' 32070500, 31620103917, 31330072, ו - 31572325 ל- C.R., Sh.L.), על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס '2021B1515020044 ו 2020A1515011267 ל- C.R.), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז גואנגדונג (גרנט מס '2019B09005003 ו 2019A0102006), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה בגואנגג'ואו (גרנט מס '202102020110), על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס '. KQTD20180411143628272 לש.ל.

הקו של P. americana סופק בתחילה על ידי ד"ר Huiling האו. מין זה נשמר עם הכלאה במשך 30 שנים9.
1. בקיעה והאכלה של פ. אמריקנה
<ol><li>לאסוף oothecae טרי (מיד לאחר הטלת ביצה) של P. americana ו דגירה באינקובטור הכהה ב 25 °C (60 °F) ו 60% לחות במשך ~ 25 ימים. לאחר מכן להגדיל את הטמפרטורה והלחות ל 30 °C (50 °F) ו 75% 3 ימים לפני הבקיעה.</li>
	<li>השתמש מסננת עם צמצם 4 מ"מ כדי להפריד את הנימפות בקעו מן oothecae.</li>
	<li>שמור את הנימפות במיכלים גליליים (12 ס"מ קוטר ו 10 ס"מ גובה) בחושך ב 28 °C (60 °F), 70% לחות. מברישים את הקצה הפנימי של המיכלים עם וזלין כדי למנוע מקקים לברוח. ספק מזון חולדות, מים ומחסה (מגשי ביצים). שימו לב לפעילות הנימפות ולנקות באופן קבוע את הצואה והפסולת.</li>
</ol>2. בחירת הנימפות בכוכב אינסטאר מתאים
<ol><li>השתמש בצינור זכוכית כדי לבחור את P. americana מותך טרי (לבן בצבע הגוף). שמור אותם במיכלים חדשים ולחכות לשלב הנכון לטיפול. הערה: לאחר ~ 19 ימים בתנאי האכלה לעיל, הנימפות ב 3אינסטארס rd יהיה זמין להזרקה. צבעם של המקקים המותכים הטריים הוא לבן, והכוכבים מובהרים על ידי זמנים מותכים.</li>
</ol>3. הכנת קטע היעד עם מקדמי T7
<ol><li>באמצעות cDNA של P. americana כתבנית, עיצוב פריימרים מזווגים לביצוע PCR כדי להשיג שבר DNA 300-800 bp של גן היעד9. לאחר מכן שכפל את קטע ה- PCR לווקטור pTOPO (ראה טבלת חומרים) לרצף.</li>
	<li>באמצעות DNA קטע היעד כתבנית, לסנתז זוג חדש אחד של פריימרים עם רצף מקדם T7 (5'-GGATCCTACGACTCACTATAGG-3 ') במסופי 5 'ולבצע סיבוב נוסף של PCR כדי להשיג את שבר היעד עם מקדמי T7 בכל צד9.9'.</li>
</ol>4. שעתוק וסינתזה של dsRNA במבחנה
<ol><li>הוסף 10 μL של T7 2X Buffer, 2 μL של תערובת אנזימים, T7 Express (ראה טבלת חומרים), ו 2 מיקרוגרם של מוצר PCR (המתקבל בשלב 3.2) במערכת התגובה והוספת הנפח הכולל ל 20 μL עם ddH2O. בעדינות לערבב הפוך באופן ידני ודוגר ב 37 °C (30 °C במשך 30 דקות ו 70 °C ( 10 °C במשך 10 דקות, ואז להתקרר לאט לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מדלל פתרון RNase A (4 מיקרוגרם / μL) עם ddH2O ביחס של 1:200. לאחר מכן להוסיף 1 μL של RQ1 RNase ללא RNase (1 U / μL) ו 1 μL של RNase מדולל פתרון A למערכת (ראה טבלת חומרים). הערה: עכשיו, הנפח של מערכת אחת הוא 22 μL.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 10% של נפח הכולל (בעת ביצוע תגובות N בו זמנית, הנפח הכולל הוא N x 22 μL) של נתרן אצטט ושלושה כרכים של הנפח הכולל של איזופרופנול.</li>
	<li>מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני, מניחים על קרח במשך 5 דקות, וצנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F).</li>
	<li>הסר את supernatant עם פיפטה, לשטוף את השאריות עם 75% אתנול (עם 25% דיאתיל pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).</li>
	<li>הסר supernatant שוב. מייבשים את הכדור באוויר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש ~ 100 μL של מי DEPC כדי להמיס dsRNA, ולאחר מכן לדלל את dsRNA הסופי 2 מיקרוגרם / μL. הערה: ניתן לאחסן את ה- dsRNA בטמפרטורה של -80 °C (6 חודשים).</li>
</ol>5. טעינת פתרון dsRNA למזרק
<ol><li>הגדר את התוכנית במשאבת הזרקת מיקרו (ראה טבלת חומרים) מראש כדי להבטיח כי הנפח של כל זריקה הוא עקבי. לפני השימוש במזרק, לנקות את המזרק על ידי מילויו עם מים DEPC 8-10 פעמים.</li>
	<li>התקן את מזרק 10 μL על משאבת הזרקת מיקרו, להפעיל את המשאבה, ולמלא את המזרק עם 10 μL של פתרון dsRNA (מוכן בשלב 4.6). הזרקו 1 μL של dsRNA לתוך נימפהrd (ראה שלב 2) ולוודא כי זה לא דולף החוצה לגוף.</li>
</ol>6. הזרקת dsRNA ל - P. americana
<ol><li>מרדים את המקקים עם ריכוז מוגבר של CO2 במיכל עד המקקים לא זזים יותר, ולאחר מכן להמשיך מיד עם הזריקה.</li>
	<li>הרימו בעדינות את הג'וק עם פינצטה, והעבירו את המקק לכיוון המחט ביד. לאחר מכן, הכנס את המחט דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקית נגד האפידרמיס. על עומק הכנס, רדוד יותר, טוב יותר.</li>
	<li>לאחר מכן, להזריק את פתרון dsRNA לתוך המקק. לבסוף, לשלוף את קצה המחט. ודא כי קצה המחט הוא קרוב ככל האפשר לאפידרמיס כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים. הערה: ההזרקה צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ ביתור.</li>
	<li>שים את המקקים המוזרקים לתוך מיכלי bioassay נקיים. המתן כ 10-20 דקות כדי לאפשר להם להתאושש אפקטים CO2 . סמן את המיכלים עם תאריך ההזרקה, סוג ומינון של dsRNA, וגיל של P. americana.</li>
	<li>מניחים את המקקים המוזרקים בסביבה חשוכה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, 70% לחות, מספקים מים, מזון ומחסה, וצופים בשינויים אפשריים בפנוטיפ של המקקים באופן קבוע.</li>
</ol>7. אישור נוקאאוט וניתוח פנוטיפי
<ol><li>הערך את היעילות של RNAi באמצעות כל טכניקות ביולוגיה מולקולרית זמינות כגון PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR) ו סופג מערבי. לקבלת נהלי qRT-PCR ו-QRT-PCR מפורטים, ראה הפניות 1,12.</li>
	<li>כדי לבחון ולנתח פנוטיפים הקשורים RNAi, להשתמש במיקרוסקופ המתאים לבעלי חיים חיים. הערה: RNAi עשוי להשפיע על המורפולוגיה, התנהגות, מותך, התחדשות גפיים, ופעילויות פיזיולוגיות אחרות של מקקים. התדירות הספציפית של פנוטיפ מחושבת על פי תנאים ספציפיים.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.+J%29%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

דו"ח זה תיאר אסטרטגיית RNAi מתודולוגית צעד אחר צעד ב - P. americana; שימו לב, זה יכול להיות מיושם גם על ג'וקים אחרים (Blattella germanica, למשל) וחרקים רבים אחרים עם שינויים קלים. עם זאת, יעילות השתקת הגנים של RNAi לא תמיד גבוהה מספיק, עם חיסרון ברור בהשוואה לאסטרטגיית נוקאאוט הגנים13. ההשפעה השיורית הבאה של רמת הגן עלולה להפריע פנוטיפים האמיתיים. כדי להבטיח את הטיפול RNAi הוא מוצלח, מספר תנאים חיוניים צריך להיחשב, כולל המצב הפיזי של בעלי חיים, בחירת קבוצת בקרה, אורך וריכוז של מו...

הפרעות RNA (RNAi), מנגנון שנשמר אבולוציונית, הופך בהדרגה לכלי חיוני הפוך-גנטי לעיכוב ביטוי גנים באורגניזמים רבים1, שכן אנדרו פייר וקרייג מלו2 פיתחו את אסטרטגיית השתקת הגנים המתווכת של RNA (dsRNA). dsRNA הוא בקע לתוך שברים של 21-23 נוקלאוטידים, קטן מפריע RNAs (siRNAs), על ידי האנזים Dicer בתאים כדי להפעיל את מסלול RNAi. לאחר מכן siRNAs משולבים לתוך קומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC), אשר זוגות mRNA היעד, גורם מחשוף mRNA, ולבסוף גורם לאובדן תפקוד הגנים 3,4,5. בין מיני החרקים, ניסויי RNAi מערכתיים רבים דווחו עד כה בהרבה סדרי חרקים, כגון אורתופטרה, איזופטרה, המיפטרה, קולופטרה, נוירופטרה, דיפטרה, היימנופטרה, לפידופטרה ובלטודה 5,6,7,8.
מקקים (Blattaria) הם משפחת חרקים חיונית במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים עם מחזורי הצמיחה המהירים שלהם, הסתגלות חזקה לסביבה, ופלסטיות התפתחותית גבוהה9. לפני שגילה כי RNAi היה תואם עם מקקים, מחקר קודם התמקד רק במניעה ובקרה של מקק בשל מחסור של טכניקות מניפולציה גנטית מקקים. המבנה הייחודי של הג'וק אותקה הפך אותו למאתגר לביצוע נוקאאוט גנים מבוסס הזרקת עוברים עם מערכת CRISPR-Cas9. חוץ מזה, רוב הרקמות בג'וקים (כגון P. americana) להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, המאפשרת הדור המהיר של פנוטיפים לא מתפקדים על ידי הזרקת אחד או יותר מיקוד dsRNAs 9,10,11. תכונות אלה הפכו את RNAi לטכניקה הכרחית במחקר תפקודי גנים ב- P. americana.
למרות שהשימוש ב- RNAi במחקר גנים פונקציונלי ב - P. americana דווח, לא היה תיאור מפורט או צעד אחר צעד זמין. דו"ח זה מספק קו מנחה תפעולי צעד אחר שלב עבור RNAi ב - P. americana, שימושי לחקר תפקוד גנים בג'וקים אחרים. יתר על כן, מדריך זה אינו מוגבל לבלאטודה וניתן להחיל אותו על חרקים רבים אחרים עם שינויים קלים.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 ומיקרו; L Syr (26s/51/2)</td> <td>המילטון</td><td>PN: 80300</td><td>חממת הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Jiangnan מפעל מכשירים</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>לג'וקים בקיעה והאכלה</td></tr><tr><td>משאבת מיקרו הזרקה</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>pTOPO-Blunt ערכת שיבוט</td><td>Aidlab ביוטכנולוגיה</td><td>CV16</td><td>להארכת גנים</td></tr><tr><td>כמותית בזמן אמת מערכות PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>לניתוח qRT-PCR</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>לסינתזה dsRNA, המכילה תמיסת Rnase A (4 &mu; g/&mu; L), נתרן אצטט, 3.0M (pH 5.2), תערובת אנזימים, T7 Express, מים ללא נוקלאז, מאגר Express T7 2x, RQ1 RNase ללא RNase DNase</td></tr><tr><td>Thermal Cyclers</td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>להגברת DNA</td></tr></tbody></table>

יישומים של הפרעות rna במקק אמריקאי

Applications of RNA Interference in American Cockroach

מקקים, מזיק תברואתי, הם מינים חיוניים במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים של חרקים בשל האכלתם הקלה ומאפייניהם ההמימטבוליים. בסך הכל עם רצפי גנום מובאים היטב, יתרונות אלה הפכו את הג'וק האמריקאי, פריפלנטה אמריקנה, למודל חרקים המימטבולי חשוב. מוגבל על ידי המחסור באסטרטגיית נוקאאוט, הפרעות RNA יעילות (RNAi) מבוסס גנים נוקאאוט הופך לטכניקה חיונית במחקר גנים פונקציונלי של P. americana. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana. הפרוטוקול כולל (1) בחירה של P. americana בשלבים התפתחותיים נאותים, (2) הכנה להגדרת ההזרקה, (3) הזרקת dsRNA, ו -(4) זיהוי יעילות נוקאאוט גנים. RNAi הוא כלי גנטי הפוך רב עוצמה P . americana. רוב רקמות P. americana רגישות dsRNA חוץ תאי. הפשטות שלה מאפשרת לחוקרים להשיג במהירות פנוטיפים לא מתפקדים תחת אחד או יותר מיקוד dsRNA זריקות, המאפשר לחוקרים להשתמש טוב יותר P. americana למחקרים התפתחותיים מטמורפיים.

איור 1 מראה זריקה מוצלחת. מזרק המיקרו-חדירה עם מחט בקוטר מיקרו צריך להיות ממוקם אופקית על המאיץ (איור 1A). המחט מוכנסת דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקיות כנגד האפידרמיס (איור 1B). ודא שהנוזל נכנס לבטן של פ. אמריקנה . הזווית התלולה מדי של המחט תפגע באיברים הפנימיים (איור 1C), והזרקה לא נכונה מובילה לדליפת פתרון dsRNA מהבטן (איור 1D). אם כל dsRNA דולף החוצה,...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר קווים מנחים שלב אחר שלב לטכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana.

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

הפרוטוקול מספק דרך פשוטה ללמוד ג'וקים אמריקאים. מזיק תברואתי נפוץ וחרק מועיל לרפואה הסינית המסורתית. זה יעזור לחקור את המנגנונים המולקולריים של פעילויות חיים מרובות של מקקים אמריקאים על ידי הפלת גנים ספציפיים.היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא יכולה להפיל גנים בג'וק אמריקאי או חרקים דומים אחרים שאינם מתאימים לעריכת גנים. טכנולוגיה זו יכולה לשמש כדי לחקור תחומים שונים כגון רגולציה גנטית ואפיגנטית, תהליך פיתוח של רקמות, התחדשות של נספחים, התנהגות הזדווגות, וצדדים מעניינים אחרים של הג'וק האמריקאי. טכנולוגיה זו קלה לתפעול ורב-תכליתית.אנו מציעים לשמור על בעלי החיים בריאים במהלך טיפול הזרקת DSRA. אני מאמין טירונים יכולים בקלות לשלוט בטכניקה זו לאחר מספר מפגשי תרגול. כדי להתחיל, להפריד את הנימפות בקעו מן oothecae עם מסננת צמצם ארבעה מילימטר.בחר את P.americana לבן טרי מאלט עם צינור זכוכית. מניחים את P.americana במיכלים חדשים ולחכות לשלב הנכון לטיפול. במערכת התגובה, להוסיף 10 מיקרוליטרים של מאגר T7 2X, 2 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים T7 Express ושני מיקרוגרם של מוצר PCR.לבסוף, לפצות את הנפח הכולל ל 20 microliters עם מים מזוקקים כפול. מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לדלל 4 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר RNase פתרון עם מים DEPC ביחס של 1 עד 200.לאחר מכן הוסיפו 1 מיקרוליטר של יחידה אחת לכל מיקרוליטר RQ1 RNase חינם DNAse ו 1 מיקרוליטר של פתרון RNase A מדולל למערכת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 10% מהנפח הכולל של אצטט נתרן ושלושה כרכים של הנפח הכולל של איזופרופנול.מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני, ואז מניחים על קרח במשך חמש דקות וצנטריפוגה ב 13, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה. לאחר מכן, לשטוף את השאריות עם 75% אתנול, עם 25 אחוז מים שטופלו DEPC, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13, 000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.הסר supernatant שוב, אוויר לייבש את הכדור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להמיס את הרנ"א התקוע הכפול עם כ -100 מיקרוליטרים של מי DEPC ולדלל אותו לריכוז הסופי של 2 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר. הגדר את התוכנית במשאבת microinjection כדי להבטיח כי הנפח של כל זריקה הוא עקבי.לאחר מכן לנקות את המזרק על ידי מילוי אותו עם מים DEPC 8 עד 10 פעמים. התקן את מזרק 10 מיקרוליטר על משאבת הזרקת מיקרו. לאחר מכן להפעיל את המשאבה ולמלא את המזרק עם 10 microliters של פתרון RNA תקוע כפול.מרדימים את המקקים עם פחמן דו חמצני, ואז מרימים אותם בעדינות עם פינצטה ומעבירים את הג'וק לכיוון המחט ביד. לאחר מכן, הכנס את המחט דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקית נגד האפידרמיס. הזרקו את תמיסת הרנ"א התקועה הכפולה לתוך הג'וק והבטיחו שקצה המחט קרוב ככל האפשר לאפידרמיס כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים.לבסוף, לשלוף את קצה המחט. שים את המקקים המוזרקים לתוך מיכלי bioassay נקיים. המתן כ 10 עד 20 דקות כדי לאפשר להם להתאושש מההשפעות של פחמן דו חמצני.לסמן את המיכלים עם תאריך הזרקה, סוג ומינון של RNA תקוע כפול וגיל של P.americana. Ddc או DOPA decarboxylase ו Dpp או גנים decapentaplegic נבחרו כשתי דוגמאות כדי לבחון את הפנוטיפ של מקקים מאלט לאחר הזרקת RNA תקוע כפול dsMocK אשר אין מטרה בבעלי החיים נלקחה כמו שליטה שלילית. יעילות RNAi זוהתה על-ידי qRT PCR.הגנים הופלו באופן משמעותי עם ערך P של פחות מ 0.01 עבור dsDdc ופחות מ 0.05 עבור dsDpp. P.americana עם גנים Ddc נוקאאוט היה האפידרמיס הלבן בשל מלניזציה חסומה. בניסוי עם זריקות dsDpp, RNAi שיבש התחדשות הגפיים.החרקים צריכים להיות בריאים ומוזרקים ללא נזק. טכנולוגיה זו מספקת דרך פשוטה לחקור פונקציות גנים עבור חרקים שלא ניתן לערוך גנים כגון מקק אמריקאי.

applications-of-rna-interference-in-american-cockroach

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

חקור שיטות RNAi להשתקת גנים במקק אמריקאי (Periplaneta americana). פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללמוד על מנגנונים מולקולריים של התנהגות, התפתחות ורגנרציה בחרקים שאינם מתאימים לעריכת גנים.

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

גלה סרטונים נוספים