שיטת פרפוזיה טרנסקרדיאלית הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר
21 בינואר 2022
מוצגת שיטת זלוף נוחה הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר. זיהוי אימונופלואורסצנטי של α-סינוקלאין זרחני מודגם במודל עכברי של מחלת פרקינסון. עבודה זו גם מתארת באופן מקיף את ההעתקה, הנתיחה, הקפאת/הטבעת רקמות ושלבי חתך קפואים.
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה של פרפוזיה מקבעת בעכברים שתאפשר את המחקר ההיסטולוגי של רקמות CNS ללא השקעה משמעותית. היתרון העיקרי של שיטת פרפוזיית הכבידה המוצגת כאן הוא שניתן לבנות את מנגנון השפע עם רכיבים זמינים בקלות. מי שידגים את ההליך יהיה ארנב רנא, סטודנט ל-MD-PhD ממעבדתו של ד"ר שין ג'יה צ'ן.
כדי להתחיל, באמצעות סכין גילוח חדה, לקצץ את הקשיות הפנימיות משני בקבוקי שטיפה של 500 מיליליטר על ידי חיתוך הסומק שלהם לצד הפנימי של הבורג על הפקק. חותכים חור מרובע של ארבעה על ארבעה סנטימטרים בתחתית כל בקבוק חיץ, ואז חותכים חור קטן נוסף בתחתית כל בקבוק כדי לאפשר מעבר של מיקרו מרית נירוסטה כפופה. לאחר מכן, צור כיפוף בצורת S במריתות המיקרו, כך שניתן יהיה להשתמש בהן כווים לתליית בקבוקי החיץ.
הכנס את המיקרו מריתות הכפופות לתוך הפתחים המתאימים בבקבוקי החיץ. לאחר מכן, חברו בחוזקה שני צינורות באורך 25 ס"מ עם שקעי הקש החיצוניים של הבקבוקים, חברו את הקצוות של צינורות אלה יחד עם מחבר Y, ולאחר מכן חברו את הצינורות באורך 2 מטרים לקצה החופשי של מחבר Y. לאחר הסרת הבוכנה ממזרק 1 מיליליטר, חתכו את המזרק במרחק של כ-6 ס"מ מהקצה על ידי ניקוד תחילה של הפלסטיק עם סכין גילוח ולאחר מכן הצמדה חדה של פלסטיק המזרק.
מכניסים את פני החתך של המזרק לקצה החופשי של צינורות הפלסטיק לעומק מספיק ומבטיחים אטימה הדוקה. לאחר מכן, סמן בקבוק חיץ אחד כ-PFA והשני כ-PBS. יש למדוד כ-1/3 מהאורך מפתיחת הבקבוק ולצייר קו סביב היקף הבקבוק בנקודה זו כדי לציין את רמת המילוי המתאימה של תמיסות ה-perfusate.
לאחר יישור פיסת נייר גדולה, צרו לולאה שיכולה להתאים להיקף הצינורות והניחו את הלולאה הזו סביב הצינורות, רק קרובים למזרק, ואז הניחו גוש קלקר בגודל מתאים במגש הזכוכית, הניחו את קצות הצינור לתוך גוש הקלקר כדי להדביק את הצינורות באמצעות מגבת נייר, הרימו את הקצה הקדמי של מגש הזכוכית בכ-2 סנטימטרים. לאחר שטיפת של ליטר אחד עם מים מזוקקים, מלאו אותה בכ-800 מיליליטר של מים ברמה מולקולרית-ביולוגית של 18 מיליוהמס. מחממים את הכוס במיקרוגל במשך שלוש דקות או עד שטמפרטורת המים מגיעה ל-65 מעלות צלזיוס, ואז מניחים אותה על חימום או צלחת ערבוב שנשמרת במכסה אדים.
לאחר מכן, לשטוף מוט ערבוב עם מים מזוקקים ולהניח אותו בכוס. התחילו את המערבל והפכו את הצלחת החמה לחום בינוני, כדי להבטיח שטמפרטורת המים לא תעלה מעל 70 מעלות צלזיוס. לאחר לבישת מסכה כירורגית, כפפות ומעיל מעבדה, יש למדוד 40 גרם של אבקת PFA ולהוסיף אותה למים המחוממים, ולאחר מכן באמצעות פיפטת העברה, להוסיף כמה טיפות של נתרן הידרוקסיד 5-טוחן לתמיסה.
אפשרו לאבקה להתמוסס במלואה. אם האבקה לא התמוססה במלואה, הוסיפו עוד נתרן הידרוקסיד לפי הצורך. לאחר שכל ה-PFA כמעט התמוסס, הפסיקו את הערבוב והחימום והוסיפו מיד 100 מיליליטר של 10x PBS, ואז השתמשו במים בדרגה מולקולרית-ביולוגית של 18 מיליוהמס כדי להעלות את הכוס לסימן ה-1 ליטר.
מכסים את הכוס בניילון נצמד ומניחים אותה במקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה מגיעה לטמפרטורת החדר. לאחר כיול מד pH באמצעות סטנדרטים מתאימים, מדוד את ה- pH של התמיסה בזמן שהכוס נמצא על לוח ערבוב. מוסיפים חומצה הידרוכלורית עד שה-pH מגיע ל-7.4.
אם ה-pH נמוך מדי, הוסיפו נתרן הידרוקסיד 5-טוחן כדי להעלות את ה-pH. לאחר מכן, חברו בקבוקון ואקום לוואקום והניחו משפך בוכנר קרמי נקי עם נייר מסנן בבקבוקון. לאחר הפעלת הוואקום, הרטיבו את נייר המסנן באמצעות פיפטת העברה מלאה בתמיסת 4% PFA, ואז שפכו באיטיות את התמיסה על נייר הסינון עד שכל התמיסה סוננה.
לאחר הסינון, אחסן את התמיסה במיכל מוגן באור ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. במכסה האדים, הניחו גוש חיתוך קלקר במגש זכוכית. ודא כי בלוק הניתוח כולל חמש עד שש מחטים קצרות לריסון העכבר במהלך הניתוח ושתי מחטים ארוכות לתמיכה בצינורות הזלוף.
לאחר מכן, לשטוף את מנגנון perfusion עם מים מזוקקים. לאחר שכל המים התנקזו, תלו את בקבוקי השפע מטר אחד מעל החיה כדי שניתן יהיה לחדור אליהם, ואז הכינו PBS לא סטרילי 1x באמצעות 10x PBS מדולל במים מולקולריים-ביולוגיים-דרגה. מהדק את הקו הראשי של מנגנון ההזזה באמצעות המוסטאט, ואז מהדק את קו ה- PFA עם המוסטאט אחר.
לאחר מילוי מיכל החיץ ב- PBS, מניחים את קצה המזרק של מנגנון הזלוף בכוס כדי לאסוף חיץ פסולת ולהסיר את ההמוסטאט החוסם את הקו הראשי. בזמן שה-PBS זורם דרך הקו, הקישו במרץ על דפנות הצינור כדי להסיר אוויר כלוא. לאחר שכל האוויר הוסר מהמאגר ומהקווים הראשיים, יש לחסום את הזרימה על ידי הצבת המוסטאט על הקו הראשי.
לאחר מכן, הסר את ההמוטט מקו ה-PFA, מה שמאפשר ל-PBS לזרום באופן מדרדר עד לבקבוק ה-PFA תוך הקשה על בועות כלשהן בקו ה-PFA. המשיכו לאפשר ל-PBS להיכנס לקו ה-PFA עד שניתן יהיה לראות אותו ממש מעל פתח הבקבוק, ואז הסתירו את קו ה-PFA עם המוסטאט כדי לעצור את זרימת ה-PBS לתוך בקבוק ה-PFA. לאחר מכן, חברו את מחט עירוי הפרפר למזרק הזלוף ופתחו את ההמוסטט בקו הראשי כדי לשטוף את PBS דרך הקו ולהסיר בועות ממזרק הזלוף.
לאחר שהבועות הוסרו, סגרו את ההמוסטט של הקו הראשי. ודא שבקבוק ה- PBS מלא כעת בערך 1/3 ב- PBS. במידת הצורך, יש לשטוף את ה-PBS דרך הקו הראשי או למלא יותר PBS לתוך בקבוק החיץ עד ל-1/3 מתפוקתו המלאה.
לאחר שכל הבועות הוסרו מה-PBS, ה-PFA והקווים הראשיים, מלאו את בקבוק ה-PFA בתמיסת PFA של 4% בטמפרטורת החדר עד לסימן השחור שעל הבקבוק. לאחר מכן, התכוננו לניתוח שאינו הישרדותי על ידי ניקוי המכשירים הדרושים תחילה עם מים ולאחר מכן עם 70% אתנול. לאחר שהצמדת עכבר C57 שחור 6J מורדם לבלוק הקלקר, התחל את הניתוח על ידי הרמת עור הבטן עם מלקחיים בעור וחיתוך דרך דופן הבטן עם מספריים גדולים.
ממשיכים את חתך הבטן בצורה מעולה לכיוון הכבד, ואז מנתקים את הכבד מדופן הבטן הקדמית וממשיכים את החתך הראשוני בצורה מעולה לכיוון הסרעפת. כאשר החתך מגיע לדיאפרגמה, באמצעות מספריים עדינים, יוצרים חור בסרעפת וחותכים דרך הצלעות בצד ימין של העכבר בערך באמצע הדרך לבית השחי הימני, ואז מבצעים חתך דומה, אך ארוך יותר, דרך הצד השמאלי של הסרעפת כמעט עד לבית השחי השמאלי. לשקף את דופן החזה ולהצמיד אותו לגוש הקלקר.
לאחר זיהוי החדר השמאלי, באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים, החזיקו את הלב יציב בלחץ קל, ואז פתחו את ההמוסטט בקו הראשי כדי לאפשר ל-PBS לזרום דרך המחט ומיד לנקב את החדר השמאלי עם המחט. ודא כי המחט מוכנסת לא יותר מ 0.5 ס"מ לתוך החדר. לאחר מכן, הניחו את צינורות הפרפר על X המיוצר בקלקר עם שתי מחטים גדולות בעלות 18 מדים.
זהה את הווריד הנבוב התחתון כשהוא יוצא מהכבד וכתוב אותו באמצעות מספריים עדינים. יש להמשיך את פיזור ה-PBS עד שהנוזל הזורם מתוך הווריד הקאווה הנחות הוא נטול דם, ואז פועל במהירות, חוסמים את קו ה-PBS עם המוסטאט ופותחים את קו ה-PFA. אפשרו ל-PFA לחלחל במשך כמה דקות עד שהזנב מתחיל להתכרבל.
ברגע שהזנב מתחיל להתכרבל, התחילו טיימר של 50 דקות. לאחר 50 דקות, חסמו את הקו הראשי עם המוסטאט ומשכו את המחט מהחדר השמאלי. לאחר מכן, הניחו את העכבר במיכל מסומן של תמיסת PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
פרפוזיה באיכות גבוהה מסומנת על ידי היעדר דם בכבד, חוט השדרה ומבנים עמוקים של מערכת העצבים המרכזית. הדם שנצפה במוח ממוקם בין הגולגולת לבין הדורה מאטר ולכן אינו בעייתי או מרמז על זלוף באיכות ירודה. גילוי אלפא-סינוקלאין בשיטת זלוף זו מראה כי אלפא-סינוקלאין זרחני מצטבר גבוה משמעותית בעכברים סימפטומטיים בני 15.5 חודשים ביחס לעכברים אסימפטומטיים בני שבעה חודשים המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי A53T.
תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים המתארים העשרה של ציטופתולוגיה בקרניים הקדמיות של חוט השדרה ובמוח האמצעי של עכברים אלה. חשוב כי אין איברי בטן נחתכים בעת הגישה לחלל בית החזה. יתר על כן, אין למקם את מחט הזלוף עמוק מדי בתוך החדר השמאלי.
סקירה
מחקר זה מציג שיטת השקיה נוחה באמצעות כוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של עכבר. הפרוטוקול מדגים איתור אימונופלואורסצנטי של α-סינקלין מוזרח בדגם עכבר של מחלת פרקינסון ומפרט את השלבים להשקיה טרנס-קרדיאלית, ניתוח רקמות, הקפאה, הטבעה וחיתוך.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- היסטולוגיה
- מחקר על מחלת פרקינסון
רקע
- מחקרים היסטולוגיים חיוניים להבנת מחלות מערכת העצבים המרכזית.
- טכניקות שימור רקמות יעילות משפרות את האיתור האימונופלואורסצנטי.
- שיטות השקיה באמצעות כוח הכבידה יכולות להפחית עלויות ציוד.
מטרת המחקר
- להציג שיטת השקיה פשוטה וחסכונית לעכברים.
- לאפשר ניתוח היסטולוגי של רקמות מערכת העצבים המרכזית.
- להדגים צביעה אימונופלואורסצנטית במודל של מחלת פרקינסון.
שיטות ששימשו
- המחקר מפרט שיטת השקיה בכוח הכבידה המשתמשת בחומרים נפוצים במעבדה.
- מודל עכבר של מחלת פרקינסון משמש לפרוטוקול.
- שלבים מרכזיים כוללים הכנת חומר ההשקיה, הרכבת המנגנון ותפעול הרקמות.
- לוחות זמנים חשובים כוללים תהליכים ספציפיים להכנת תמיסת ה-PFA וביצוע ההשקיה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת קיבוע יעיל של רקמות מערכת העצבים המרכזית לניתוח אימונופלואורסצנטי.
- הוכח איתור מוצלח של α-סינקלין מוזרח.
- הממצאים מדגישים את היתכנות השימוש בשיטה זו לחקר מנגנונים של מחלות ניווניות.
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקול אמין למחקרים היסטולוגיים של רקמות מערכת העצבים המרכזית.
- הממצאים משפרים את יכולתנו לנתח סמנים מרכזיים במחלת פרקינסון.
- ההשלכות להבנת מנגנונים עצביים בהקשרים של מחלות הן משמעותיות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This gravity-fed perfusion method provides a cost-effective, accessible approach for preparing mouse CNS tissues for histologic analysis, supporting target validation and biomarker detection in neurodegenerative disease models. By enabling reliable fixation and subsequent immunofluorescent staining of phosphorylated α-synuclein, the method enhances predictive confidence in preclinical studies of Parkinson's disease pathology. The technique supports early discovery workflows by reducing equipment barriers while maintaining tissue integrity for downstream analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through sensitive detection of phosphorylated α-synuclein as a disease biomarker.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing consistent tissue fixation for reproducible immunohistochemical analysis.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by allowing comparison of pathology between symptomatic and asymptomatic disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream immunofluorescent screening applications.
- Reproducibility: Delivers standardized tissue fixation enabling quantitative and comparable readouts across experiments.
- Platform Utility: Uses accessible components to support scalable and reusable perfusion setups in discovery laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with Parkinson's disease models by enabling detection of cytopathology in spinal cord and midbrain regions.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation through consistent histologic preparation.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides histologic evidence to inform go/no-go decisions in target validation cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting histologic preparation for target validation, assay development, and preclinical evaluation of neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through reliable CNS tissue preservation.
- Screening: Enables assay readiness by delivering fixed tissues suitable for immunofluorescent staining and imaging.
- Analytics: Generates quantitative histologic outputs that allow comparison of biomarker expression across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via consistent tissue preparation for biomarker analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion capability using low-cost, widely available materials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by enabling sensitive detection of disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through a simple, gravity-driven perfusion system.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by supporting early, mechanistically informative histologic analysis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing histologic evidence of target engagement and pathology progression.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory skills in solution preparation, tubing assembly, and animal handling.
- Needs standard lab equipment including glass trays, tubing, connectors, syringes, and temperature control for PFA preparation.
- Demands cross-team standardization of perfusion timing, fixative volume, and needle placement for consistent results.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and fixation durations based on target antigen stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid excessive needle depth in the left ventricle and prevent abdominal organ damage during thoracic access.
