פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

המחקר על עוברים אנושיים מוגבל על ידי הזמינות הנמוכה שלהם והחששות האתיים שלהם, ולכן השגת מודלים בודדים המשכפלים בנאמנות את ההתפתחות האנושית המוקדמת תתמוך בהתקדמות המדעית והרפואית. יכולתה של טכניקה זו לחזות את התפתחות האדם תלויה ביכולתה לשחזר את רצפי קביעת התאים הבלסטוציסטים והמורפוגנזה ביעילות, על פי הרצף והקצב ההתפתחותי, ומידול כזה יבטיח היווצרות של תאים המשקפים באמת את שלב הבלסטוציסט. בעתיד, בלסטואידים אנושיים עשויים לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות ולתרום למודלים פרה-קליניים, למשל, כדי לשפר את מדיום ההפריה החוץ גופית, או לפתח אמצעי מניעה שאינם הורמונליים.

מי שידגימו את הנוהל יהיו הארונובו קגאווה, אלוק ג'ואלי, היידר היידארי חואיי, תרזה מריה זומר וג'ובאני ססטיני. כדי להתחיל, הכן וחימם מראש את מדיית PXGL, המדיה הבסיסית N2B27, מאגר הכביסה, PBS ומדיית הצבירה. אל תכלול MEFs מתלי hPSC ליצירת בלסטואידים.

להחרגת MEF, הכינו צלחת מצופה ג'לטין על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.1% ג'לטין לבאר של צלחת בעלת שש בארות. דגירה של הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 90 דקות. כדי לקצור את התאים, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים עם מילימטר אחד של PBS.

הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של לוחית שש באר, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לעקוב אחר הדיסוציאציה של מושבות לתאים בודדים. דיללו את תמיסת ניתוק התאים במיליליטר אחד של חיץ כביסה.

לאסוף את התאים מן הצלחת על ידי pipetting בעדינות חמש עד 10 פעמים. מעבירים את תרחיף התא לצינור 15 מיליליטר. סובב את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות.

הסר את הסופרנטנט, ובצע החייאה של התאים ב-1.5 מיליליטרים של מדיום PXGL בכל באר. זרעו את התאים על הצלחות מצופות הג'לטין להרחקת MEF, ודגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 עד 90 דקות. לאחר שהתאים הנאיביים נזרעים להרחקת MEF, הסירו את ה-PBS מ-MicroWells ואזננו את הבארות עם 200 מיקרוליטרים של מדיום N2B27 בסיסי עבור כל שבב MicroWell, ודגרו במשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

אסוף את הסופרנאטנט המכיל את התאים הנאיביים שאינם מחוברים. מעבירים אותו לצינור 15 מיליליטר, ומסובבים את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות. יש להשליך את המדיה, ולהחיות את התאים במיליליטר אחד של מדיה בסיסית N2B27.

ספרו את התאים באמצעות שקופיות של ספירת תאים. סובב את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות. יש להשליך את המדיום, ולהוסיף כמות מתאימה של מדיה N2B27 המכילה 10 מיקרומולר Y27632 כדי לקבל צפיפות תאים של 30, 000 תאים לכל 50 מיקרוליטרים.

הסר את המדיום ממערכי MicroWell משוכללים, והוסף 25 מיקרוליטרים של מדיית N2B27 עם 10 מיקרומולר Y27632. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תרחיף תאים, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים ליפול לתחתית ה-MicroWell. לאחר מכן הוסיפו 125 מיקרוליטרים של מדיום N2B27, בתוספת 10 מיקרומולר Y27632.

תוך 24 שעות, אגרגטים של hPSCs נאיביים ייצפו בשבב MicroWell. ליזום את היווצרות הבלסטואיד על ידי הכנת מדיום PALY. מחממים אותו מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הסר את מדיום הצבירה, והוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום PALY מחומם מראש ל- MicroWells. מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה לחממה היפוקסית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. חזור על שינוי המדיה ביום הראשון.

ביום השני, הסירו את מדיום ה-PALY והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום N2B27, בתוספת LPA ו-10 מיקרומולר Y27632. חזור על שינוי מדיה ביום השלישי. היווצרות בלסטואידים מלאה מתרחשת עד היום הרביעי.

הכן תרחיף תאי hPSC נאיבי להיווצרות בלסטואידים כפי שתואר קודם לכן. יש להשליך את המדיום, ולהוסיף כמות מתאימה של מדיה N2B27 המכילה 10 מיקרומולר Y27632 כדי לקבל את צפיפות התאים של 70 תאים לכל 100 מיקרוליטרים של המדיום. כדי לאסוף תאים בתחתית הבארות, צנטריפוגה של הצלחת ב-200 RCF למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי תרבית היפוקסיים. תוך 24 שעות, אגרגטים של hPSCs נאיביים ייצפו על הבארות. הוסיפו לבארות 100 מיקרוליטרים של מדיום PALY טרי ומתוכנן מראש פעמיים PALY.

מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה באינקובטור היפוקסי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להשליך מחצית מהתקשורת, ולהחליף אותה ב-100 מיקרוליטרים של מדיום PALY מוכן מראש. חזור על השלב עד היום הרביעי.

הכן תרחיף תאי HPSC נאיבי להיווצרות טרופוספירה כפי שתואר קודם לכן. לאחר שצבירים של HPSCs נאיביים נוצרו לאחר 24 שעות, החליפו את מדיום הצבירה ב-PALY ללא LIF, בתוספת שלושה מיקרומולרים SC144 ליצירת טרופוספירה המייצגת טרופיקטודרם מוקדם. כדי ליצור טרופוספירה המייצגת טרופיקטודרם בוגר, החליפו את מדיום הצבירה ב-PALY, בתוספת שני מיקרומולרים XMUMP1.

רעננו את המדיום מדי יום. היווצרות טרומוספירה מלאה מתרחשת ביום הרביעי. כדי להעריך את מצבי התא, השווה את נתוני השעתוק מבלסטואידים וטרופוספירה עם הבקרות המתאימות, כולל תאי גזע דמויי טרופולסט אנושיים לאחר ההשתלה.

hPSCs נאיביים שעברו תרבית ב-PXGL היו מבנים מצטברים ומחורשים שהגיחו בין 48 ל-72 שעות לאחר אינדוקציית PALY, והגיעו לקוטר של 150 עד 250 מיקרומטר תוך 96 שעות. בהתבסס על פרמטרים מורפומטריים ונוכחותן של שלוש השושלות, יעילות האינדוקציה הגיעה ל-70% עד 80% Trophospheres נוצרו ביעילות של 50 עד 60% תוך 96 שעות מרגע האינדוקציה. היווצרות Blastoid הצליחה באופן מסחרי בלוחות חיבור נמוכים במיוחד של 96 בארות בחיבורים נמוכים במיוחד בתנאי אינדוקציה אופטימליים.

טכנולוגיית ריצוף RNA של תא יחיד שימשה לאפיון מצב התא הבלסטואידי עוד יותר. התאים מציגים פרופילי אשכולות מובחנים במידה ניכרת, ללא קשר לפרמטרים ששימשו לביצוע האשכולות וההדמיה של הנתונים, מה שאיפשר להבחין בביטחון בין שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. בין 24 ל -60 שעות, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים של PXGL יוצרים אנלוגים של האפיבלסט ושל הטרופיקטודרם.

ואז בין 60 ל 96 שעות, אנלוגים של trophectoderm הקוטב, ושל אנדודרם פרימיטיבי נוצרים. זהו רצף המפרט בתוך הבלסטוציסט, ולכן הבלסטואידים משחזרים את הרצף ההתפתחותי של מפרט השושלת. המיזוג של מערכי נתונים של בלסטואידים עם מערך נתוני הייחוס של תאים שבודדו מעוברים בשלבים שונים של התפתחות הראה כי 97% מהתאים מבלסטואידים התקבצו עם תאי הבלסטוציסט, אך לא עם תאים מעוברים לאחר ההשתלה.

ניתוח עצמאי אישר כי לאורך זמן, תאי הגזע יצרו תאים שהתאימו באופן שעתוק לתאים של עוברים אנושיים בין היום החמישי ל-7.5. זהו אכן השלב ההתפתחותי שבמהלכו נוצר הבלסטוציסט האנושי. הם גם אישרו כי ליותר מ-95% מהתאים בתוך הבלסטואידים יש תעתיק התואם את שלוש שושלות התאים של בלסטוציסטים, בעוד ש-3% מהתאים היו מחוץ למטרה, והותאמו לשלבים שלאחר ההשתלה.

יש לציין כי ראינו שתרביות הדו-ממד הראשוניות שלנו מהוות גם הן כ-5% מתאי היעד. ניתן גם לדמיין את השלב ההתפתחותי המקביל על ידי התבוננות בדפוסי הביטוי של סמנים ספציפיים כגון CDX2 עבור הטרופיקטודרם הבלסטוציסט, ו- PRMD14 עבור אפיבלסט הבלסטוציסט. איכות תרבית ה-PXGL הראשונית היא קריטית לחלוטין, ומספר התאים בתוך הצבירה הראשונית הוא גם קריטי, וניתן לשלוט בו באמצעות MicroWells.

הגודל הכולל של הצבירה התאית לאחר 24 שעות צריך להיות כ-50 עד 70 מיקרומטר. ההיווצרות היעילה של בלסטואידים מלאים בשלבים סוללת את הדרך לחקר תהליכי ההשתלה וההתפתחות שלאחר ההשתלה של העובר האנושי לאחר ההשתלה.