Name: פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: למדו פרוטוקול ליצירת בלסטואידים אנושיים המחקים התפתחות בלסטוציסט מוקדמת. השיטה משתמשת בתאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים ותומכת במחקר פוריות וביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק ERC-Co מס '101002317 'BLASTOID: פלטפורמת גילוי לאמבריוגנזה אנושית מוקדמת'). H.H.K. נתמך על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF), תוכנית Lise Meitner M3131-B. אנו מודים ליאסוהירו טקשימה על שיתוף קווי התאים H9 ו-H9-GFP, ולאוסטין סמית', פיטר אנדרוז וגה גואו על שיתוף קווי התאים HNES1, Shef6, niPSC 16.2b ו-cR-NCRM2. אנו מודים ל-Hossein Baharvand על שיתוף האורגנואידים של רירית הרחם. אנו מודים לג'ושוע מ. בריקמן על שיתוף הרנ"א שבודד מתאי התמיינות PrE ותאי nEND. אנו מודים לשנקר סריניווס על שיתוף נתוני ריצוף ה-RNA החד-תאיים של עובר הפרי-גסטרולציה. אנו מודים לאלכסנד ביקוב וללואיזה קוצ'לה על הסיוע הטכני בהכנת ספריית SMARTSeq2. אנו מודים למתקן ה-NGS, הביואופטיקה ותאי הגזע ב-IMBA על הסיוע הקריטי.

המכון לביוטכנולוגיה מולקולרית, האקדמיה האוסטרית למדעים הגיש בקשת פטנט EP21151455.9 המתארת את הפרוטוקולים להיווצרות בלסטואידים אנושיים ואת בדיקת האינטראקציה בין בלסטואיד לאנדומטריום. HK, AJ, HHK ו- NR הם הממציאים של פטנט זה. כל שאר הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

במחקר הנוכחי, אנו מראים, צעד אחר צעד, כיצד לבסס בלסטואידים אנושיים עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוט וחזק. עם צבירה של PXGL hPSCs נאיביים והעיכוב המשולש שלהם, בלסטואידים נוצרים ביעילות (> 70%) ויוצרים ברצף את 3 האנלוגיות הבלסטוציסטיות תוך 4 ימים. מגבלות ביעילות ובאיכות של הבלסטואידים (למשל, נוכחות של תאים מחוץ למטרה) יכולות להתרחש אם המצב ההתחלתי אינו אופטימלי. יש לציין כי מדדנו כי PXGL hPSCs מכילים כ-5% מהתאים המשקפים את שלבי ההשתלה שלאחר ההשתלה. תאים אלה עשויים להגביל את היווצרותם של בלסטואידים באיכות גבוהה. מעבר למצב PXGL הנאיבי הראשוני המשקף את אפיבלסט הבלסטוציסט, גורם מרכזי נוסף הוא המדיום המשמש להיווצרות בלסטואידים. על מנת ליצור במהירות תאים דמויי בלסטוציסט ולמנוע היווצרות של תאים מחוץ למטרה, דמויי השתלה לאחר ההשתלה, אנו מציעים כי עיכוב מסלולים משולשים (היפו, ERK, TGF-β) הוא חיוני. בעוד שקווי תאים שונים נותנים תפוקות שונות של בלסטואיד על עיכוב ERK/TGF-β (בדרך כלל בסביבות 10%-20%), חשיפה ל-LPA גורמת להיווצרות תפוקת בלסטואידים גבוהה באותה מידה בכל קווי התאים, תוך שימוש בקריטריונים מחמירים למפרט מורפומטרי ושושלת. LPA פועל ככל הנראה על עיכוב מסלול ההיפו, הממלא תפקיד קריטי בהפרדת השושלת הראשונה בין שושלות אפיבלסט וטרופקטודרם בעכבר ובאדם 8,51. השיפור המשמעותי ביעילות הבלסטואידים על ידי LPA מצביע על כך שמנגנוני אפיון התאים הפנימיים-חיצוניים בתיווך מסלול ההיפו הפועלים בבלסטוציסט נבחרים יחד במהלך היווצרות בלסטואידים. מגבלה נוכחית טמונה בעובדה שבשל תת-אופטימליות של הפרוטוקולים המשמשים לתרבית בלסטוציסט אנושי או בלסטואידים ביום המקביל בזמן 7-13 (לאחר היווצרות בלסטוציסט/בלסטואיד), איננו מסוגלים להעריך באיזו מידה אנו יכולים לדגום כראוי התפתחות לאחר ההשתלה.
ניתוח מצב השעתוק של תאי הבלסטואידים יכול להיות מושג בקלות באמצעות scRNAseq, מפות ייחוס נאותות ושיטות ביואינפורמטיות. בעבר, ניתוח התעתיק הראה כי hPSCs שעברו תרבית ב- PXGL דומים יותר לאפיבלסט הבלסטוציסט בהשוואה למצב הראשוני. מגבלות בניתוח הנתונים יכולות להתרחש אם מפת הייחוס כוללת רק תאים בשלב הבלסטוציסט. מפת הייחוס צריכה לכלול תאים שמקורם בעוברים לאחר ההשתלה על מנת להעריך את נוכחותם של תאים פוטנציאליים מחוץ למטרה. בעתיד, על מנת למדוד את תאי הבלסטואיד, מפת ייחוס הכוללת את כל הרקמות של התפיסה האנושית לפני ואחרי ההשתלה תהיה בעלת ערך רב. בנוסף, מפות ייחוס של תאים בודדים מרובי-אומיקה, למשל כולל תעתיק, נגישות כרומטין ומתילציה של דנ"א, יעזרו עוד יותר. לבסוף, שיטות ביואינפורמטיות סטנדרטיות להערכה כמותית של קווי הדמיון בין תאים ממודלים של עוברים ומתפיסות ייחוס, ולזיהוי חיובי של תאים מחוץ למטרה יסייעו עוד יותר לנתח ולהשוות תוצאות ללא משוא פנים.
בסך הכל, בלסטואידים הנוצרים על ידי עיכוב משולש של מסלולי היפופו, TGF-β ו- ERK הם בעלי ארבע התכונות של 1) מורפוגנזה יעילה ביותר, 2) רצף נכון של מפרט שושלת, 3) טוהר גבוה של תאים דמויי בלסטוציסט ברמת השעתוק, 4) יכולת לדגום פיתוח פרי-השתלה. תכונות אלה של בלסטואידים יאפשרו היפותזות בנייה על התפתחות והשתלה של בלסטוציסט, אולם הן אינן משחזרות שלבים מוקדמים יותר של התפתחות עוברית. בניגוד לנגישות המוגבלת והרבגוניות של הבלסטוציסט האנושי, בלסטואידים מקובלים על בדיקות גנטיות ותרופות לצורך חקירות תפקודיות של התפתחות והשתלת בלסטוציסטים. בעתיד, ידע בסיסי כזה עשוי לתרום לשיפור נוסחת המדיה ההפריה החוץ גופית, לפיתוח אמצעי מניעה לאחר הפריה ולניהול טוב יותר של ההריון המוקדם.

<table><tbody><tr><td>מדיה נוירובזאלית</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X N2 תוסף</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>50X B27 תוסף</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>100X Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>100 mM נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>MEM-חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ 2-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>100X פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Medchem express</td><td>HY-10254</td><td></td></tr><tr><td>XAV-939</td><td>Medchem express</td><td>HY-15147</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml; 6983</td><td>Medchem express</td><td>HY-13689</td><td></td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה רקומביננטי אנושי</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Medchem express</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA)</td><td>Peprotech</td><td>2256236</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Medchem express</td><td>HY-10583</td><td></td></tr><tr><td>CMRL בינוני</td><td>Gibco</td><td>21530027</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10-828-028</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biozym</td><td></td><td>תמיסת ניתוק תאים</td></tr><tr><td>B423201 Geltrex</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>גורם גדילה A1413302 תמצית קרום הבסיס</td></tr><tr><td>TROP2 נוגדן R</td><td>& מערכות D</td><td>MAB650</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&אלפא; נוגדנים</td><td>R& מערכות D</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>SC-144</td><td>Axon</td><td>2324</td><td></td></tr><tr><td>XMU-MP-1</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-100526</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת קרום מרתף</td><td>מטריג'ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת שקופיות</td><td>ספירת תאים</td><td>תרמו פישר</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צביעה DAPI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-570</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

מודל של הבלסטוציסט האנושי שנוצר מתאי גזע (בלסטואיד) יתמוך בהתקדמות מדעית ורפואית. עם זאת, כוח החיזוי שלו יהיה תלוי ביכולתו לשחזר ביעילות, בזמן ובנאמנות את רצפי התפתחות הבלסטוציסטים (מורפוגנזה, מפרט, דפוס), וליצור תאים המשקפים את שלב הבלסטוציסט. כאן אנו מראים שתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תמימים בתרבית בתנאי PXGL ולאחר מכן מעוכבים באופן משולש עבור ההיפו, משנים את גורם הגדילה β, ומסלולי קינאז חוץ-תאיים המווסתים על ידי אותות עוברים ביעילות מורפוגנזה ליצירת בלסטואידים (>70%). בהתאם לתזמון ההתפתחותי (כ-4 ימים), הבלסטואידים פותחים את רצף המפרט הבלסטוציסטי על ידי יצירת אנלוגים של הטרופולסט והאפיבלסט, ולאחר מכן היווצרות אנלוגים של האנדודרם הפרימיטיבי והטרופולסטים הקוטביים. התוצאה היא היווצרות של תאים הדומים לשעתוק לבלסטוציסט (>96%) ומיעוט של אנלוגים לאחר ההשתלה. בלסטואידים מעוצבים ביעילות על ידי יצירת הציר העוברי-אבמבריוני המסומן על ידי הבשלת אזור הקוטב (NR2F2+), אשר רוכש את הפוטנציאל הספציפי להיצמד בכיוון לתאי רירית הרחם מגורה הורמונלית, כמו ברחם. בלסטואיד אנושי כזה הוא מודל מדרגי, רב-תכליתי ואתי לחקר ההתפתחות וההשתלה האנושית במבחנה.

בדרך כלל, hPSCs נאיביים המתורבתים בתרבית ב-PXGL (איור 2A) הם מבנים מצטברים ומחוצבים, המתעוררים בין 48 ל-72 שעות לאחר אינדוקציה PALLY ומגיעים לקוטר של 150-250 מיקרומטר תוך 96 שעות (איור 2B). באמצעות מספרי תאי זריעה אופטימליים (1), (2) משך צבירה טרום-תרבית עם N2B27 (0 עד 24 שעות), (3) ריכוז של רכיבים כימיים בודדים (במיוחד LPA), ו-(4) משך הטיפול ב-PALLY, יעילות האינדוקציה מגיעה ל-70%-80% כהגדרתם בהתבסס על פרמטרים מורפומטריים (גודל כולל של 150-250 מיקרומטר, חלל רגיל יחיד, צביר תאים פנימיים יחידים; איור 2C,D) ונוכחותן של שלוש השושלות. מצב תא התחלתי לא אופטימלי ו/או תנאי אינדוקציה יגרמו להיווצרות פחות יעילה או ללא בלסטואידים. כדי להבטיח יעילות מרבית וליצור רק אנלוגים לפני ההשתלה, חיוני להשתמש בתרבות איכותית של PXGL hPSCs נאיביים. ניתן להעריך זאת על ידי מדידה על ידי FACS את אחוז התאים החיוביים עבור סמני פני השטח SUSD2 (מצב נאיבי) ו- CD24 (מצב ראשוני). סמני פני שטח נוספים הספציפיים לשושלות החוץ-אמבריוניות מחוץ למטרה (למשל, אמניון, מזודרם חוץ-אמבריוני) יהיו שימושיים גם כן, אך למיטב ידיעתנו, אינם זמינים כיום. אם יעילות ההיווצרות המתקבלת נמוכה מהתוצאות שדווחו, חשוב לבדוק היטב את כל הרכיבים של מדיום הבלסטואיד, במיוחד LPA המשוחזר ב- PBS ואשר, כליגנד GPCR, יכול להיות לא יציב יותר בהשוואה למולקולות סינתטיות שנוצרו מחדש ב- DMSO. ברוב המקרים, גם אם התשואה אינה מקסימלית, המבנים המקושעים עדיין מורכבים משלוש השושלות הבלסטוציסטיות. ניתן לאשר את הופעתן של שלוש שושלות בלסטוציסטיות והיווצרות ציר עוברי-אבמבריוני על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה של סמנים (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; איור 2E,G). טרופוספירה, המורכבת רק מ- TE, מסייעת לנתח עוד יותר את תפקידה של התקשורת הבין-תאית. טרופוספירה יכולה להיווצר ביעילות של 50%-60% תוך 96 שעות מאינדוקציה (איור 2H,I). ניתן לבצע היווצרות בלסטואידים לא רק במערכים ביתיים של מיקרו-וול, אלא גם בלוחות חיבור נמוכים במיוחד 96 עם אופטימיזציה של תנאי אינדוקציה (ראו פרוטוקול ואיור 2J). לבלסטואידים יש גם את היכולת להמשיך ולהתפתח במשך 6 ימים נוספים, שהם זמן שווה ערך לעובר יום 13, עם פרוטוקול התמיינות חוץ גופית (איור 2K).
על מנת לאפיין עוד יותר את מצב התא של תאי הבלסטואיד, יש להשתמש בטכנולוגיית ריצוף RNA חד-תאית. UMAP מיושם בדרך כלל כדי להמחיש התפלגות של מצבי תאים, וניתוח אשכולות לא מפוקח מבוצע עליו כדי להעריך את הקרבה של מצבי תאים בודדים. פרמטרים שונים בניתוח הנתונים החד-תאיים יכולים להשפיע על אופן הצגת התאים ב-UMAPs, ובכך להוביל לאשכולות עם מיקומים וצורות מרחביים ויחסיים שונים (איור 3A). עם זאת, בניתוח זה, התאים מציגים פרופילי אשכולות מובחנים במידה ניכרת ללא קשר לפרמטרים המשמשים לביצוע האשכולות וההדמיה של הנתונים, מה שמאפשר להבחין בביטחון גבוה בין שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. השתמשנו בתאים מעוברים שנקטפו בשלבי התפתחות שונים כהתייחסות. המיזוג של מערכי נתונים אלה מראה כי רוב הטרופיקטודרם האנלוגי מבלסטואיד מקובץ עם trophectoderm לפני ההשתלה אך לא עם trophoblasts לאחר ההשתלה (איור 3B). תוצאות אלה אושרו גם על ידי קונסורציום עצמאי10.
כאשר עוברי קרנגי שלב 7 (CS7) של גזים מוצגים במפת הייחוס, אוכלוסייה קטנה של תאים בלסטואידים (3%) התקבצה עם שושלות המזודרם והאמניון של העוברים האלה (איור 3C). כאשר תאים דמויי אמניון מוצגים במפת הייחוס, אוכלוסייה קטנה של תאים בלסטואידים (&lt; 2%) התקבצה עם תאים דמויי אמנון כאלה.
באופן כללי, רק המבנים הכוללים חלל רגיל יחיד, צביר תאים פנימיים יחיד, גודל כולל הנע בין 150-250 מיקרומטר, הכולל אנלוגים תעתיקיים של שלוש השושלות הבלסטוציסטיות, ובמידה רבה נטולי שושלות אחרות (למשל, אמניון, מזודרם, מזודרם חוץ-ממבריוני) נחשבים לבלסטואידים אנושיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig01.jpg"> איור 1: ארבע תכונות ושתי גישות ליצירת בלסטואידים בעלי נאמנות גבוהה.אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig02.jpg"> איור 2: בלסטואידים וטרופוספרות שמקורם באגרגטים של hPSC נאיבי. (A) תמונות של ניגודיות פאזה המציגות hPSCs נאיביים המתורבתים במדיום PXGL מתורבתים בשיתוף עם MEF מוקרן. סרגל קנה מידה: 50 μm. (B) תמונות ניגודיות פאזה המראות את השינוי המורפולוגי של אגרגטים תמימים של hPSCs מתורבתים על מערך מיקרווול הידרוג'ל שאינו דבק עם 500 ננומטר LPA (מדיום PALLY). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) בלסטואידים אנושיים שנוצרו על מערך מיקרווול לאחר 96 שעות. סרגלי קנה מידה: 400 μm. (D) כימות של אחוז המיקרו-וולים המכילים בלסטואיד אנושי המושרה על ידי מצב תרבית PALLY עם ריכוז LPA אופטימלי מקווי hPSC נאיביים שונים (n = 3 מערכי מיקרו-וול). (E) צביעה אימונופלואורסצנטית של בלסטואידים אנושיים עם סמני אפיבלסט (EPI) (צהוב) NANOG ו-OCT4; סמני TE (ציאן) CDX2 ו- GATA3; וסמן האנדודרם הפרימיטיבי (magenta) SOX17 ו- GATA4. סרגל קנה מידה: 100 μm. (H-I) כימות של מספר התא (משמאל) ואחוז התאים (מימין) השייכים לכל שושלת בבלסטואיד (96 שעות) בהתבסס על צביעת אימונופלואורסצנציה של OCT4, GATA3 ו- GATA4. (G) צביעה אימונופלואורסצנטית של בלסטואידים אנושיים עבור CDX2 (ציאן) ו-NR2F2 (מגנטה). (F) תמונות ניגודיות פאזה של טרופוספירה בשלב מוקדם ומאוחר על מערך מיקרווול המושרה על ידי תוספת של 3 μM SC144 (H) או 2 μM XMU-MP-1 (I), בהתאמה. (J) תמונות של ניגודיות פאזה המציגות את השינוי המורפולוגי של אגרגטים תמימים של hPSCs המתורבתים בלוחות חיבור נמוכים במיוחד 96 עם 500 ננומטר LPA (מדיום PALLY). (K) תמונת ניגודיות פאזה (משמאל) וכתם אימונופלואורסצנטי (מימין) עבור OCT4 (צהוב), GATA3 (ציאן) ו-GATA4 (מגנטה) בבלסטואיד שגדל במצב תרבית לאחר השרעה במשך 6 ימים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה מותאםמ-6,10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig03.jpg"> איור 3: אפיון הרכב הבלסטואידים על ידי ריצוף של תאים בודדים. (A) ניתוח אשכולות לא מפוקח עם פרמטרים שונים על UMAP של תעתיק של תאים בודדים שמקורם בנקודות הזמן השונות של בלסטואיד (24 שעות, 60 שעות, 96 שעות), hPSCs נאיביים, hPSCs ראשוניים ו- hTSC (מייצגים את הציטוטרופיובלסט שלאחר ההשתלה). (B) UMAP של תעתיק של תאים שמקורם בבלסטואיד (96 שעות), hPSCs נאיביים ו-hPSCs ראשוניים המשולבים עם מערכי נתונים שפורסמו מעוברים אנושיים של שלבי טרום-השתלה, פרי-השתלה (בלסטוציסטים בתרבית חוץ גופית ) וגסטרולציה (שלב קרנגי 7, כלומר, בין E16-19). תאים בודדים נצבעים על סמך מקורם בעוברים אנושיים (משמאל), בתאים שמקורם בבלסטואידים או בתאי גזע (באמצע), ותוצאה של ניתוח אשכולות לא מפוקח (מימין). (C) UMAPs של תעתיק של תאים שמקורם בבלסטואידים, hPSCs נאיביים, hPSCs ראשוניים, ומשולבים עם מערך נתונים שפורסם ממעבר שלב גסטרולציה (קרנגי שלב 7, כלומר, בין E16-19). תאים בודדים נצבעים על סמך מקורם בעוברים אנושיים (משמאל), בתאים שמקורם בבלסטואידים או בתאי גזע (באמצע), ותוצאה של ניתוח אשכולות לא מפוקח (מימין). נתון זה מותאם מתוך6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה משלימה 1: כל הרכב המדיה המשמש במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/Supplementary%20Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרוטוקול המתאר את היווצרותם של בלסטואידים אנושיים היוצרים ביעילות, בזמן וברצף תאים דמויי בלסטוציסט.

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

המחקר על עוברים אנושיים מוגבל על ידי הזמינות הנמוכה שלהם והחששות האתיים שלהם, ולכן השגת מודלים בודדים המשכפלים בנאמנות את ההתפתחות האנושית המוקדמת תתמוך בהתקדמות המדעית והרפואית. יכולתה של טכניקה זו לחזות את התפתחות האדם תלויה ביכולתה לשחזר את רצפי קביעת התאים הבלסטוציסטים והמורפוגנזה ביעילות, על פי הרצף והקצב ההתפתחותי, ומידול כזה יבטיח היווצרות של תאים המשקפים באמת את שלב הבלסטוציסט. בעתיד, בלסטואידים אנושיים עשויים לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות ולתרום למודלים פרה-קליניים, למשל, כדי לשפר את מדיום ההפריה החוץ גופית, או לפתח אמצעי מניעה שאינם הורמונליים.מי שידגימו את הנוהל יהיו הארונובו קגאווה, אלוק ג'ואלי, היידר היידארי חואיי, תרזה מריה זומר וג'ובאני ססטיני. כדי להתחיל, הכן וחימם מראש את מדיית PXGL, המדיה הבסיסית N2B27, מאגר הכביסה, PBS ומדיית הצבירה. אל תכלול MEFs מתלי hPSC ליצירת בלסטואידים.להחרגת MEF, הכינו צלחת מצופה ג'לטין על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.1% ג'לטין לבאר של צלחת בעלת שש בארות. דגירה של הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 90 דקות. כדי לקצור את התאים, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים עם מילימטר אחד של PBS.הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של לוחית שש באר, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לעקוב אחר הדיסוציאציה של מושבות לתאים בודדים. דיללו את תמיסת ניתוק התאים במיליליטר אחד של חיץ כביסה.לאסוף את התאים מן הצלחת על ידי pipetting בעדינות חמש עד 10 פעמים. מעבירים את תרחיף התא לצינור 15 מיליליטר. סובב את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות.הסר את הסופרנטנט, ובצע החייאה של התאים ב-1.5 מיליליטרים של מדיום PXGL בכל באר. זרעו את התאים על הצלחות מצופות הג'לטין להרחקת MEF, ודגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 עד 90 דקות. לאחר שהתאים הנאיביים נזרעים להרחקת MEF, הסירו את ה-PBS מ-MicroWells ואזננו את הבארות עם 200 מיקרוליטרים של מדיום N2B27 בסיסי עבור כל שבב MicroWell, ודגרו במשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.אסוף את הסופרנאטנט המכיל את התאים הנאיביים שאינם מחוברים. מעבירים אותו לצינור 15 מיליליטר, ומסובבים את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות. יש להשליך את המדיה, ולהחיות את התאים במיליליטר אחד של מדיה בסיסית N2B27.ספרו את התאים באמצעות שקופיות של ספירת תאים. סובב את התאים ב-200 RCF למשך ארבע דקות. יש להשליך את המדיום, ולהוסיף כמות מתאימה של מדיה N2B27 המכילה 10 מיקרומולר Y27632 כדי לקבל צפיפות תאים של 30, 000 תאים לכל 50 מיקרוליטרים.הסר את המדיום ממערכי MicroWell משוכללים, והוסף 25 מיקרוליטרים של מדיית N2B27 עם 10 מיקרומולר Y27632. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תרחיף תאים, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים ליפול לתחתית ה-MicroWell. לאחר מכן הוסיפו 125 מיקרוליטרים של מדיום N2B27, בתוספת 10 מיקרומולר Y27632.תוך 24 שעות, אגרגטים של hPSCs נאיביים ייצפו בשבב MicroWell. ליזום את היווצרות הבלסטואיד על ידי הכנת מדיום PALY. מחממים אותו מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הסר את מדיום הצבירה, והוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום PALY מחומם מראש ל- MicroWells. מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה לחממה היפוקסית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. חזור על שינוי המדיה ביום הראשון.ביום השני, הסירו את מדיום ה-PALY והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום N2B27, בתוספת LPA ו-10 מיקרומולר Y27632. חזור על שינוי מדיה ביום השלישי. היווצרות בלסטואידים מלאה מתרחשת עד היום הרביעי.הכן תרחיף תאי hPSC נאיבי להיווצרות בלסטואידים כפי שתואר קודם לכן. יש להשליך את המדיום, ולהוסיף כמות מתאימה של מדיה N2B27 המכילה 10 מיקרומולר Y27632 כדי לקבל את צפיפות התאים של 70 תאים לכל 100 מיקרוליטרים של המדיום. כדי לאסוף תאים בתחתית הבארות, צנטריפוגה של הצלחת ב-200 RCF למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי תרבית היפוקסיים. תוך 24 שעות, אגרגטים של hPSCs נאיביים ייצפו על הבארות. הוסיפו לבארות 100 מיקרוליטרים של מדיום PALY טרי ומתוכנן מראש פעמיים PALY.מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה באינקובטור היפוקסי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להשליך מחצית מהתקשורת, ולהחליף אותה ב-100 מיקרוליטרים של מדיום PALY מוכן מראש. חזור על השלב עד היום הרביעי.הכן תרחיף תאי HPSC נאיבי להיווצרות טרופוספירה כפי שתואר קודם לכן. לאחר שצבירים של HPSCs נאיביים נוצרו לאחר 24 שעות, החליפו את מדיום הצבירה ב-PALY ללא LIF, בתוספת שלושה מיקרומולרים SC144 ליצירת טרופוספירה המייצגת טרופיקטודרם מוקדם. כדי ליצור טרופוספירה המייצגת טרופיקטודרם בוגר, החליפו את מדיום הצבירה ב-PALY, בתוספת שני מיקרומולרים XMUMP1.רעננו את המדיום מדי יום. היווצרות טרומוספירה מלאה מתרחשת ביום הרביעי. כדי להעריך את מצבי התא, השווה את נתוני השעתוק מבלסטואידים וטרופוספירה עם הבקרות המתאימות, כולל תאי גזע דמויי טרופולסט אנושיים לאחר ההשתלה.hPSCs נאיביים שעברו תרבית ב-PXGL היו מבנים מצטברים ומחורשים שהגיחו בין 48 ל-72 שעות לאחר אינדוקציית PALY, והגיעו לקוטר של 150 עד 250 מיקרומטר תוך 96 שעות. בהתבסס על פרמטרים מורפומטריים ונוכחותן של שלוש השושלות, יעילות האינדוקציה הגיעה ל-70% עד 80% Trophospheres נוצרו ביעילות של 50 עד 60% תוך 96 שעות מרגע האינדוקציה. היווצרות Blastoid הצליחה באופן מסחרי בלוחות חיבור נמוכים במיוחד של 96 בארות בחיבורים נמוכים במיוחד בתנאי אינדוקציה אופטימליים.טכנולוגיית ריצוף RNA של תא יחיד שימשה לאפיון מצב התא הבלסטואידי עוד יותר. התאים מציגים פרופילי אשכולות מובחנים במידה ניכרת, ללא קשר לפרמטרים ששימשו לביצוע האשכולות וההדמיה של הנתונים, מה שאיפשר להבחין בביטחון בין שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. בין 24 ל -60 שעות, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים של PXGL יוצרים אנלוגים של האפיבלסט ושל הטרופיקטודרם.ואז בין 60 ל 96 שעות, אנלוגים של trophectoderm הקוטב, ושל אנדודרם פרימיטיבי נוצרים. זהו רצף המפרט בתוך הבלסטוציסט, ולכן הבלסטואידים משחזרים את הרצף ההתפתחותי של מפרט השושלת. המיזוג של מערכי נתונים של בלסטואידים עם מערך נתוני הייחוס של תאים שבודדו מעוברים בשלבים שונים של התפתחות הראה כי 97% מהתאים מבלסטואידים התקבצו עם תאי הבלסטוציסט, אך לא עם תאים מעוברים לאחר ההשתלה.ניתוח עצמאי אישר כי לאורך זמן, תאי הגזע יצרו תאים שהתאימו באופן שעתוק לתאים של עוברים אנושיים בין היום החמישי ל-7.5. זהו אכן השלב ההתפתחותי שבמהלכו נוצר הבלסטוציסט האנושי. הם גם אישרו כי ליותר מ-95% מהתאים בתוך הבלסטואידים יש תעתיק התואם את שלוש שושלות התאים של בלסטוציסטים, בעוד ש-3% מהתאים היו מחוץ למטרה, והותאמו לשלבים שלאחר ההשתלה.יש לציין כי ראינו שתרביות הדו-ממד הראשוניות שלנו מהוות גם הן כ-5% מתאי היעד. ניתן גם לדמיין את השלב ההתפתחותי המקביל על ידי התבוננות בדפוסי הביטוי של סמנים ספציפיים כגון CDX2 עבור הטרופיקטודרם הבלסטוציסט, ו- PRMD14 עבור אפיבלסט הבלסטוציסט. איכות תרבית ה-PXGL הראשונית היא קריטית לחלוטין, ומספר התאים בתוך הצבירה הראשונית הוא גם קריטי, וניתן לשלוט בו באמצעות MicroWells.הגודל הכולל של הצבירה התאית לאחר 24 שעות צריך להיות כ-50 עד 70 מיקרומטר. ההיווצרות היעילה של בלסטואידים מלאים בשלבים סוללת את הדרך לחקר תהליכי ההשתלה וההתפתחות שלאחר ההשתלה של העובר האנושי לאחר ההשתלה.

protocol-for-human-blastoids-modeling-blastocyst-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

MicroSecure Vitrification פותחה כמערכת התקני ויטריפיקציה סגורה אספטית לא מסחרית התואמת לשיטות הייצור והטיפול ברקמות של ה-FDA. עקב הוצאת קשיות עובר סתומות הידרופוביות מהתעשייה, הליך הזיגוג שונה כך שיכלול אטם פנימי לפני פקק הכותנה הפנימי הסטנדרטי.

Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

כאן אנו מציגים פרוטוקול זמן לשגות morphometric לעקוב האינטנסיביות של הבלסטוציסט התכווצות והתרחבות re במהלך התערבויות previtrification ושחזור פוסט-התחממות כדור הארץ. היישום של הפרוטוקול אפשרי במבחנה מעבדות הפריה מצויד מיקרוסקופים בצילום מואץ והוא מומלץ בפיתוח של שיטת ויטריפיקציה הבלסטוציסט אופטימלית.

פרוטוקול Morphometric להערכה אובייקטיבית של הבלסטוציסט התנהגות במהלך ויטריפיקציה והשלבים התחממות כדור הארץ

ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.

ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס מודל פשוט ויעיל להשתלת עוברים במבחנה להערכת המולקולות הרלוונטיות המשפיעות על תהליך השתלת העוברים.

הקמת מודל השתלת עוברים במבחנה

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

טכנולוגיית Microarray מאפשרת מדידה כמותית ופרופיל ביטוי גנים של תעתיקים על בסיס גנומי. לכן, פרוטוקול זה מספק הליך טכני אופטימלי במערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בעוברי בקר ביום 7 כדי להדגים את ההיתכנות של שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל.

Transcriptome Profiling של In-Vivo עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שעורר תגובתיות של קורטיזול במדגם אמריקאי מקסיקני פגיע, תוך שימוש בגרסה חדשה של מבחן המתח החברתי (TSER). דגימות רוק נאספו בתחילת, 15, 30, ו 45 דקות לאחר תחילת TSST. מחקר עתידי יכול לנצל את זה TSST שונה עם נוער פגיע.

מבחן שינוי חברתי של טריגר חברתי למבוגרים מתבגרים מקסיקנים אמריקנים פגיעים

למדו פרוטוקול ליצירת בלסטואידים אנושיים המחקים התפתחות בלסטוציסט מוקדמת. השיטה משתמשת בתאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים ותומכת במחקר פוריות וביולוגיה התפתחותית.

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

גלה סרטונים נוספים