קביעת התפלגות אורך שרשרת גלוקאן של גליקוגן באמצעות שיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)

בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) משמשת לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן.

שיטה זו מספקת הבנה טובה יותר של הארגונים המבניים של חלקיקי גליקוגן. זהו נושא חשוב מכיוון שאוכלוסיית שרשראות הגלוקן, מה שמכונה התפלגות אורך השרשרת, קובעת את התכונות הכימיות הפיזיקליות של חלקיקי הגליקוגן. כגון מסיסות מים.

אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו הוא שהפלואורסצנציה קבועה ללא קשר לאורך שרשרת הגלוקן. יש רק מולקולת APTS אחת הקשורה לגלוקן. לפיכך, עוצמת הפלואורסצנציה עומדת ביחס ישר למספר שרשראות הגלוקן.

השדה לאלקטרופורזה נימית בסיוע מתאים לפתרון המנגנון הרפואי של אנזימים מטבוליזם גליקוגן. לדוגמה, אנו יכולים לקבוע את מידת הפילמור של שרשראות גלוקן המועברות על ידי הסתעפות אנזימים לגלוקן מקובל. התגובה חייבת להתבצע בתנאים.

לכן, אזורים חייבים להיות מוגנים מפני לחות. מערבבים 200 מיקרוליטרים של 0.5-2 מיליגרם למיליליטר של גליקוגן מטוהר עם 200 מיקרוליטרים של 100 מאגר אצטט של pH 4.8. הוסיפו 2 מיקרוליטרים של איזואמילאז, ו-1.5 מיקרוליטרים של פולולנאז.

מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בצינור 1.5 מיליליטר. עצור את התגובות על ידי דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.

צנטריפוגה ב 16, 100 פעמים G'במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לכדור ולהסיר כל חומר מסיס. הסר את תחזוקת העל עם פיפטה והעביר אותם לצינורות מבוארים חדשים. לאחר הוספת חרוזי שרף לתוך צינור מיקרו-פוגה ריק, התפלה את הסופרנאטים על ידי הוספת המקבילה של 100 מיקרוליטרים של חרוזי שרף חילופי קטיון אניון ותסיסה.

אסוף את הדגימות על ידי צנרת, והנח אותן בצינורות מבוארים חדשים. להקפיא לייבש את הדגימות. אחסן דגימות מיובשות בטמפרטורת החדר או 20 מעלות צלזיוס.

ערבבו את הדגימות המיובשות עם 2 מיקרוליטרים של 1 נתרן טוחן ציאנובורוהידריד וטטרהידרופורן, ו-2 מיקרוליטרים של 8 חומצה טריסולפונית פירן 1-3-6 אמינה. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בחושך. הוסיפו 46 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד לכל דגימה.

כדי לדלל את הדגימות 50 פעמים, הוסיפו מיקרוליטר אחד של הדגימה ל-49 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד ב-100 מיקרו-ויאטים של מיקרוליטר. במערבולת כדי לערבב ביסודיות. הניחו את הדגימות בחושך למשך 5 עד 10 דקות בעת הגדרת הפנים.

כדי לבצע אלקטרופורזה של קוטביות הפוכה, הגדר את השיטה, הגדר את לחץ ההזרקה לכוח של 0.5 פאונד לאינץ ' מרובע. לאחר מכן הגדר את הקוטביות למצב הפוך להפרדה. דיללו את מאגר הפרדת הפחמימות המקושר ל-N לשליש במים טהורים במיוחד.

בצע את הפרדת ה- Glucans המסומנת ב- APTS במאגר המדולל ב- 30 קילובולטים בנימי סיליקה מתמזגים חשופים. לאחר מכן הגדר את זמן ההזרקה, והתחל את הניתוח. ייצא את קבצי ה-ASC וה-CDF המכילים את פרופיל האלקטרו-פרוגרמה ואת נתוני האינטגרציה בהתאמה.

פתח את קובץ ה- ASC וצייר את יחידת הפלואורסצנציה היחסית בהתאם לתרשים הזמן. פתח את קובץ ה- CDF. המשך עם אינטגרציה אוטומטית ראשונה והתאם את הפרמטרים הבאים עם אינטגרציה בין עמק לעמק ושטח מינימלי.

בדוק ותקן כל אירוע אינטגרציה לא תקין באופן ידני. האותות הפלואורסצנטיים שנצפו בין 4.13 ל-4.67 דקות מקורם ב-APTS שלא תוקן. הזמן האלאוטי של ה-DP 6 של מלטוהקסאוז הוערך ב-8.49 דקות.

ה-APTS שכותרתו גלוקנים של גליקוגן בקר זוהו על סמך הזמן האלאוטי של DP 6. בדגימת הבקרה לא זוהה זכר למלטו-אוליגוסכריד חופשי, שבה הגליקוגן לא דוגר עם אנזימי התייבשות. לוח הכניסה מראה הפרדת שרשראות גלוקאן עד 44 DP. התפלגות אורך השרשרת מוצגת כאחוז של DP עבור כל DP. אורך השרשרת הממוצע חושב על ידי סיכום כל אחוז שרשרת פעמים מידת הפילמור המתאימה.

ניתוח פנים הראה כי הגלוקנים הנפוצים ביותר הם מלטוז וכבד ארנב, מלטוהקסאוז בצדפה ומלטוהפטאוז בכבד הבקר. התפלגויות אורך השרשרת של גליקוגן שטוהר מסוג בר ומזני חיידקים ציאנובקטריאליים מוטנטיים נקבעו באמצעות ניתוח פנים. ניתוחים תת-קרקעיים בוצעו על ידי הפחתת האחוז של כל DP מסוג פראי מאחוז של כל DP של מוטציות.

התפלגויות אורך השרשרת הממוצעות של גליקוגן מסוג בר ומוטנטים של Synechocystis נורמלו על פי השיא המרבי שנצפה עבור כל CLD. טכניקה זו מאפשרת הבנה טובה יותר של מחלות אנושיות הקשורות לפגם בחילוף החומרים של גליקוגן, במיוחד מחלת אנדרסן, תוצאות עשירות מהצטברות של חלקיקי גליקוגן חריגים בתאים.