קביעת התפלגות אורך שרשרת גלוקאן של גליקוגן באמצעות שיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)
31 במרץ 2022
בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) משמשת לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן.
שיטה זו מספקת הבנה טובה יותר של הארגונים המבניים של חלקיקי גליקוגן. זהו נושא חשוב מכיוון שאוכלוסיית שרשראות הגלוקן, מה שמכונה התפלגות אורך השרשרת, קובעת את התכונות הכימיות הפיזיקליות של חלקיקי הגליקוגן. כגון מסיסות מים.
אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו הוא שהפלואורסצנציה קבועה ללא קשר לאורך שרשרת הגלוקן. יש רק מולקולת APTS אחת הקשורה לגלוקן. לפיכך, עוצמת הפלואורסצנציה עומדת ביחס ישר למספר שרשראות הגלוקן.
השדה לאלקטרופורזה נימית בסיוע מתאים לפתרון המנגנון הרפואי של אנזימים מטבוליזם גליקוגן. לדוגמה, אנו יכולים לקבוע את מידת הפילמור של שרשראות גלוקן המועברות על ידי הסתעפות אנזימים לגלוקן מקובל. התגובה חייבת להתבצע בתנאים.
לכן, אזורים חייבים להיות מוגנים מפני לחות. מערבבים 200 מיקרוליטרים של 0.5-2 מיליגרם למיליליטר של גליקוגן מטוהר עם 200 מיקרוליטרים של 100 מאגר אצטט של pH 4.8. הוסיפו 2 מיקרוליטרים של איזואמילאז, ו-1.5 מיקרוליטרים של פולולנאז.
מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בצינור 1.5 מיליליטר. עצור את התגובות על ידי דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
צנטריפוגה ב 16, 100 פעמים G'במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לכדור ולהסיר כל חומר מסיס. הסר את תחזוקת העל עם פיפטה והעביר אותם לצינורות מבוארים חדשים. לאחר הוספת חרוזי שרף לתוך צינור מיקרו-פוגה ריק, התפלה את הסופרנאטים על ידי הוספת המקבילה של 100 מיקרוליטרים של חרוזי שרף חילופי קטיון אניון ותסיסה.
אסוף את הדגימות על ידי צנרת, והנח אותן בצינורות מבוארים חדשים. להקפיא לייבש את הדגימות. אחסן דגימות מיובשות בטמפרטורת החדר או 20 מעלות צלזיוס.
ערבבו את הדגימות המיובשות עם 2 מיקרוליטרים של 1 נתרן טוחן ציאנובורוהידריד וטטרהידרופורן, ו-2 מיקרוליטרים של 8 חומצה טריסולפונית פירן 1-3-6 אמינה. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בחושך. הוסיפו 46 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד לכל דגימה.
כדי לדלל את הדגימות 50 פעמים, הוסיפו מיקרוליטר אחד של הדגימה ל-49 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד ב-100 מיקרו-ויאטים של מיקרוליטר. במערבולת כדי לערבב ביסודיות. הניחו את הדגימות בחושך למשך 5 עד 10 דקות בעת הגדרת הפנים.
כדי לבצע אלקטרופורזה של קוטביות הפוכה, הגדר את השיטה, הגדר את לחץ ההזרקה לכוח של 0.5 פאונד לאינץ ' מרובע. לאחר מכן הגדר את הקוטביות למצב הפוך להפרדה. דיללו את מאגר הפרדת הפחמימות המקושר ל-N לשליש במים טהורים במיוחד.
בצע את הפרדת ה- Glucans המסומנת ב- APTS במאגר המדולל ב- 30 קילובולטים בנימי סיליקה מתמזגים חשופים. לאחר מכן הגדר את זמן ההזרקה, והתחל את הניתוח. ייצא את קבצי ה-ASC וה-CDF המכילים את פרופיל האלקטרו-פרוגרמה ואת נתוני האינטגרציה בהתאמה.
פתח את קובץ ה- ASC וצייר את יחידת הפלואורסצנציה היחסית בהתאם לתרשים הזמן. פתח את קובץ ה- CDF. המשך עם אינטגרציה אוטומטית ראשונה והתאם את הפרמטרים הבאים עם אינטגרציה בין עמק לעמק ושטח מינימלי.
בדוק ותקן כל אירוע אינטגרציה לא תקין באופן ידני. האותות הפלואורסצנטיים שנצפו בין 4.13 ל-4.67 דקות מקורם ב-APTS שלא תוקן. הזמן האלאוטי של ה-DP 6 של מלטוהקסאוז הוערך ב-8.49 דקות.
ה-APTS שכותרתו גלוקנים של גליקוגן בקר זוהו על סמך הזמן האלאוטי של DP 6. בדגימת הבקרה לא זוהה זכר למלטו-אוליגוסכריד חופשי, שבה הגליקוגן לא דוגר עם אנזימי התייבשות. לוח הכניסה מראה הפרדת שרשראות גלוקאן עד 44 DP. התפלגות אורך השרשרת מוצגת כאחוז של DP עבור כל DP. אורך השרשרת הממוצע חושב על ידי סיכום כל אחוז שרשרת פעמים מידת הפילמור המתאימה.
ניתוח פנים הראה כי הגלוקנים הנפוצים ביותר הם מלטוז וכבד ארנב, מלטוהקסאוז בצדפה ומלטוהפטאוז בכבד הבקר. התפלגויות אורך השרשרת של גליקוגן שטוהר מסוג בר ומזני חיידקים ציאנובקטריאליים מוטנטיים נקבעו באמצעות ניתוח פנים. ניתוחים תת-קרקעיים בוצעו על ידי הפחתת האחוז של כל DP מסוג פראי מאחוז של כל DP של מוטציות.
התפלגויות אורך השרשרת הממוצעות של גליקוגן מסוג בר ומוטנטים של Synechocystis נורמלו על פי השיא המרבי שנצפה עבור כל CLD. טכניקה זו מאפשרת הבנה טובה יותר של מחלות אנושיות הקשורות לפגם בחילוף החומרים של גליקוגן, במיוחד מחלת אנדרסן, תוצאות עשירות מהצטברות של חלקיקי גליקוגן חריגים בתאים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה משתמש בטכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בעזרת פלואורופור (FACE) כדי לנתח את התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואת אורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן. הבנת פרמטרים אלה חיונית להבהרת הארגון המבני והתכונות של חלקיקי גליקוגן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- מטבוליזם של גליקוגן
- טכניקות אלקטרופורזה
רקע
- ההתפלגות של אורכי השרשראות של הגלוקן משפיעה על התכונות הפיזיקליות והכימיות של הגליקוגן.
- עוצמת הפלואורסצנציה בשיטה זו היא קבועה, מה שמאפשר כימות מדויק של שרשראות הגלוקן.
- הבנת מבנה הגליקוגן חיונית לחקר הפרעות מטבוליות קשורות.
- אנזימים למטבוליזם של גליקוגן ממלאים תפקיד מרכזי בקביעת דרגת הפולימריזציה של שרשראות הגלוקן.
מטרת המחקר
- לקביעת התפלגות אורך השבבים ואורך השבב הממוצע של גליקוגן.
- להעמקת ההבנה של הארגון המבני של הגליקוגן.
- לבחינת ההשלכות של מבנה הגליקוגן על מחלות אנושיות, כגון מחלת אנדרסן (Andersen's disease).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות גליקוגן עם אנזימים ספציפיים תחת תנאים מבוקרים.
- סימון פלואוריפורי של גלוקנים לצורך אנליזה באמצעות אלקטרופורזה.
- אלקטרופורזה בקיטוב הפוך להפרדת גלוקנים מסומנים.
- ניתוח נתונים באמצעות אינטגרציה של פרופילי אלקטרופורוגרמה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גלוקנים שונים על בסיס דרגת הפולימריזציה שלהם.
- קביעת התפלגות אורך השרשראות של גליקוגן ממקורות שונים.
- ניתוחים חיסוריים החשופים הבדלים בין זני בר לזנים מוטנטיים.
- תובנות לגבי הקשר בין מבנה הגליקוגן לבין הפרעות מטבוליות.
מסקנות
- טכניקת ה-FACE מספקת שיטה מהימנה לניתוח מבנה הגליקוגן.
- הממצאים תורמים להבנת מחלות הקשורות למטבוליזם של גליקוגן.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון השלכות טיפוליות עבור הפרעות הקשורות לגליקוגן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת התפלגות אורך השרשראות של הגליקוגן מספקת תובנות קריטיות לגבי מנגנוני מחלות מטבוליות ותפקוד אנזימי, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) בהפרעות אגירת גליקוגן. שיטת ה-FACE מאפשרת הערכה כמותית של אוכלוסיות שרשראות הגלוקן, המשפיעה ישירות על הממיסות והזמינות הביולוגית של הגליקוגן – שיקולים מרכזיים בפיתוח מודלים פרה-קליניים. פרמטר מבני זה מסייע בהפחתת סיכונים מכנית (mechanistic de-risking) על ידי קישור הפעילות האנזימטית לתוצאות פנוטיפיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מכמת את התפלגות אורך שרשראות הגלוקן כדי לבחון השערות טיפוליות לגבי תפקוד אנזים הפיצול של הגליקוגן.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי ביסוס קשרי מבנה-תפקוד בין פעילות האנזים לבין תכונות חלקיקי הגליקוגן.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות מתאם בין התפלגויות אורך שרשראות לבין פנוטיפים של גליקוגן הקשורים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: ייצור מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף עם התפלגויות אורכי שרשראות מכומתות לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- פלט כמותי: יצירת קריאות מבוססות פלואורסצנציה הפרופורציונליות למספר שרשראות הגלוקן, המאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות.
- שחזוריות: אינטגרציה סטנדרטית של אלקטרופורוגרמות תומכת ביכולת הרחבה של הבדיקה ובעקביות בין פלטפורמות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין מבנה הגליקוגן לבין הפרעות מטבוליות אנושיות, כגון מחלת אנדרסן (Andersen's disease), באמצעות התפלגויות חריגות של אורך שרשראות.
- המשכיות תרגומית: מחבר בין בדיקות אנזימטיות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות נקודות קצה מבניות מדידות.
- קידום מותאם סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי כימות סטיות מבניות במודלים של מחלה.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-FACE משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת נתונים מבניים המאירים את מנגנון האנזים ואת הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של אנזימים המפרקים גליקוגן על ידי מדידת שינויים בדרגת הפולימריזציה.
- סריקה: מספק דגימות מוכנות לבדיקה עם פרופילים סטנדרטיים של התפלגות אורך שרשרת לצורך הערכת ספריות תרכובות.
- אנליזה: מספק נתוני אינטגרציה של אלקטרופורוגרמה ופלטים של אחוזי אורך שרשרת לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנון האנזים לתוצאות פרה-קליניות באמצעות שינויים מבניים של גליקוגן הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח מבנה גליקוגן במספר מודלי מחלות ומטרות אנזימטיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי חילוף הגליקוגן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרופורציונליות של עוצמת הפלואורסצנציה למספר שרשראות הגלוקאן.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקה (go/no-go) המבוססות על סמנים מבניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות השוואות כמותיות של התפלגות אורך השרשראות בין מודלים של סוג בר (wild-type) למודלים מוטנטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופורזה של פחמימות ובטכניקות סימון פלואורופורית.
- תלוי במכשור לאלקטרופורזה קפילרית בעל יכולת קוטביות הפוכה ומערכות גילוי עבור תרכובות פלואורסצנטיות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות, דגירה של אנזימים ואינטגרציה של אלקטרופורוגרמות.
- כולל שיקולי התאמה עבור מקורות גליקוגן שונים (למשל, חיידקיים, יונקיים) ותנאי אנזימים.
- מוגבל על ידי הצורך בתנאי תגובה מוגנים למניעת הפרעות לחות במהלך הכנת הדגימה.
