יעיל SARS-CoV-2 כמותי הפוך Transcriptase PCR רוק אסטרטגיה אבחון באמצעות רובוטים צנרת קוד פתוח

פיתחנו מבחן אבחון COVID 19 מבוסס רוק בעלות נמוכה וזרימת עבודה שקל ליישם ולהגדיל עבור יישומי סינון קהילתיים בקנה מידה גדול. כאן אנו משתמשים רובוטים לטיפול בנוזל קוד פתוח, thermocyclers סטנדרטי ותוכנה כדי לבצע בדיקה ישירה של רוק ללא מיצוי או מאגרי ייצוב תוך מתן תוצאות אבחון מדויקות. בגלל זרימות העבודה המקבילות האוטומטיות הפשוטות, ניתן להגדיל את המערכת כדי לבצע אלפי בדיקות מדי יום עם ציוד מינימלי, מקום ודרישות כוח אדם.

בנוסף לקיילי קינג, רייצ'ל האם, מפקחת המעבדה הקלינית שלנו ואוסטין סמות'רס, רכז החינוך שלנו, תסייע להדגים את ההליך בגין על ידי טיהור החלק החיצוני של צינורות איסוף הרוק עם 70% אתנול והעברתם למעבדה לבדיקה. תיעדו את הגעת הדגימה על-ידי סריקת כל ברקוד לדוגמה בגיליון האלקטרוני של הצריכה היומית. חום לטפל בדגימות הסריקה במשך 30 דקות בתנור 95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר את הדגימות באמצעות כפפות עמידות בחום.

פתח את הגיליונות האלקטרוניים היומיים של טעינת הדגימה עבור כל רובוט טעינה לדוגמה בתחנת ההקצאה לדוגמה. לאחר מכן להקצות 188 דוגמאות לכל צלחת 384 באר. מגשי תוויות עם שם צלחת, תאריך ומספר רבעון.

סרוק את הדגימות לפי הסדר לתוך גיליון העבודה של טעינת הדגימה לדוגמה. בתחנת הטעינה לדוגמה, בשורה שני סטים מלאים של שמונה מתלים מודפסים 3D, המתאים למיקום הסיפון ברובוט. יש לנתק את הצינורות של רבע אחד ולהניח אותם במתלים מודפסים בתלת-ממד, החל ממיקום A1 בארון תקשורת אחד.

מלאו כל ארון תקשורת משמאל לימין ומלמעלה למטה. המשך דפוס טעינה זה בארון תקשורת 2, ולאחר מכן להמשיך מתלים ארבע וחמש. שים טעון רבע אחד מדפי מדגם על סיפונים אחד, שניים, ארבעה, חמש, שבע, שמונה, 10, 11.

מניחים טיפים P20 על סיפונים שלוש ותשע. כדי לפשט את תהליך ההתקנה, טען חומרים מהחלק האחורי לחזית לתוך הרובוט. לוחות המיקס הראשיים מיוצרים על רובוט ייעודי ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס.

צלחת אחת משמשת בכל פעם ומסומנת בשם צלחת, ולהב חד משמש לחיתוך קו בנייר הכסף סביב בארות הבקרה. מניחים את צלחת התערובת הראשית על סיפון שש ומקלפים את כיסוי נייר הכסף, ומשאירים מאחור את המלבן הקטן המכסה את בארות הבקרה. לחשוף את תיבות הקצה ולסגור את הרובוט.

אתחל את פרוטוקול ההפעלה המותאם אישית של Python על-ידי לחיצה על התחל לפעול דרך יישום שולחן העבודה הרובוטי. כל רבעון לוקח 24.5 דקות לטעון על הצלחת. הגדר טיימר כתזכורת.

בזמן שהרובוט פועל, שחררו וטענו רבע שני צינורות מדגם לתוך הסט השני של מתלים מודפסים בתלת-ממד. כאשר הרובוט מושהה, הסר את ארונות התקשורת של רבע אחד והחלף אותם ברבע שני ארונות תקשורת, ולאחר מכן לחץ על חידוש הפעלה ביישום שולחן העבודה. סכום רבע אחד צינורות מדגם ולאחסן אותם במקרר ארבע מעלות צלזיוס תוך המתנה לתוצאות.

חזור על תהליך טעינה זה עבור רבעים שלוש וארבע. מעבירים את הצלחת הטעונה לארון בטיחות ביולוגי. כדי למזער את הזיהום, לשמור על הצלחת מכוסה במהלך ההעברה.

לאסוף את כל הדגימות החוזרות ולהקצות אותם כדגימות האחרונות ברבעון הרביעי. ספור את הדוגמאות, סרוק את הברקודים והזן את המיקום לדוגמה המקורי ואת התוצאה בגיליון האלקטרוני של טעינת הדגימה לדוגמה. העבר את הדגימות החוזרות לארון הבטיחות הביולוגית.

אין לטעון את צינורות הדגימה החוזרים למתלי הטעינה של הרובוטים. פיפטה שני מיקרוליטרים של כל דגימה חוזרת לבארות הנכונות. השתמש בפיפטה המיועדת להוספת דגימות מטופלים.

שמור על בארות הבקרה מכוסות בנייר כסף תוך הוספת דגימות כדי למזער את הזיהום. לקלף את כיסוי נייר הכסף מעל בארות בקרה באמצעות מלקחיים. פיפט שני מיקרוליטרים של דגימות חולים חיוביים מאומתים לתוך בארות M23 ו- M24.

פיפטה שני מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז לבארות N23 עד N24 ושני מיקרוליטרים של 200 עותקים לכל מיקרוליטר מעורב שליטה חיובית וולס O23 ל O24. השאר בארות P23 עד P24 ריק כדי לפקח על איכות אצווה תערובת ראשית. לכסות את הצלחת עם חותם ברור אופטית ולהשתמש רולר אפליקטור כדי לדבוק חותם לכל הבארות.

מערבולת את הצלחת ב 2, 500 סל"ד במשך 30 שניות לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך דקה אחת. בחר את תוכנית הפרוטוקול בתוכנת התרמו-מחזור ושמור את הפרוטוקול ללוחות עתידיים. מניחים את הצלחת האטומה בתרמוציקלר ומפעילים את הפרוטוקול.

יצא ערכי CT והעתק את הערכים לגיליון האלקטרוני לדוגמה של טעינה. לשליטה חיובית, בדוק אם לפחות בקרה חיובית אחת מפיקה ערכי CT בין 22 ל- 28 עבור בדיקות P1 ו- N1. לחלופין, בארות המדגם החיוביות הידועות מייצרות ערכי P1 ו- N1 CT פחות מ-33 בבדיקות P1 ו- N1.

לשליטה שלילית, ודא שאין ערכי N1 או P1 CT באחת משתי בארות הבקרה השליליות. ודא שלערכי CT יש עקומות הגברה חוקיות לפני ביטול תוקף הלוח. אם P1 מייצר תוצאה של CT פחות מ-33, שקול את הבאר תקפה והמשיך לתוצאה מ- N1. אם P1 מפיק תוצאה של CT הגדולה או שווה ל- 33 או ללא ערך CT, שקול את הבאר כלא חוקית.

אם N1 מייצר תוצאה של CT פחות מ 33, להעריך את הבאר כמו כן. אם N1 אינו מפיק ערך CT, הערך את הבאר כמו לא. אם N1 מפיק ערך CT הגדול או שווה ל- 33, הערך את הבאר ללא כוכב.

ודא שכל ערכי N1 CT משויכים לעקומת הגברה אמיתית. אם לערך CT עבור N1 אין עקומת הגברה, הבאר אינה. זהה את הדוגמאות החוזרות, תייג אותן במספר מדגם פנימי ובסוג מדגם והחזר אותן לזרימת העבודה של הטעינה.

התמונות הייצוגיות מראות את זיהוי RTQ PCR של N1 או SARS CoV-2 RNA סינתטי ו- P1 או HSRPP30 DNA סינתטי. עקומות סטנדרטיות שורטטו עם סטיות תקן כדי לקבוע את טווח הזיהוי המדויק באמצעות שילוב פריימר בדיקה זה. ערכי ה- CT הממוצעים שהושגו בדילול בהתאמה שורטטו כנגד הכמות המשוערת של RNA סינתטי ודנ"א סינתטי.

בשני המקרים, העקומות הליניאריות הראו מקדמי מתאם טובים על פני מגוון רחב של ריכוזי העתקת גנים. ערכי N1 CT שהתקבלו מדגימות ייחודיות באמצעות רובוט וטעינת מדגם ידנית הוחלפו כדי לקבוע את השונות הבין-מדומה בין טעינת המדריך לרובוט. הקשר הליניארי בין השיטות הידניות והאוטומטיות יצר מקדם מתאם גבוה המציין ששתי השיטות שוות ערך מבחינה פונקציונלית.

שונות פנימית נקבעה גם באמצעות ערכי N1 CT משוכפלים שהוחלפו המתקבלים הן מהרובוט והן מטעינת מדגם ידנית. הערכה של שיטות טיפול בחום להפחתת צמיגות ברוק מוצגת כאן. סארס CoV-2 רוק שלילי נאסף ממקור אחד ו aliquots טופלו בחום במשך אפס דקות, 30 דקות או 60 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.

ערכי P1 CT משכפלים טכניים של כל תנאי שורטטו כדי לקבוע את השונות בין שיטות הטיפול. הן 30 דקות והן 60 דקות שיטות טיפול בחום הפיקו ירידה משמעותית השתנות מדגם לעומת שום בקרת טיפול. לא היה הבדל משמעותי בין טיפולים של 30 דקות ל -60 דקות.

לכן יושמה שיטת הטיפול בחום של 30 דקות כדי לקצר את זמן העיבוד. השתמש בטכניקה אספטית מתאימה כדי למזער את הזיהום של לוחות הבדיקה, במיוחד בעת טעינת דגימות ופקדים ידניים. הימנעו מלחצות את הצלחת עם הידיים או השרוולים.

לאחר הפקת תוצאות קליניות, ניתן להיפטר מדגימות בפסולת ביולוגית או לשמור אותן לניתוח נוסף, כגון ריצוף גנום שלם כדי לקבוע זנים ספציפיים. טכניקה זו מאפשרת בדיקות קהילתיות בקנה מידה רחב, המאפשרת לנו לחקור את ההשפעות של כיסוי הבדיקה ואת ההתפשטות הלא סימפטומטית של Covid 19.