בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

בפרוטוקול JoVE זה, אנו משתמשים בריצוף RNA חד-גרעין מבוסס טיפות כדי לאפיין את הארכיטקטורה הביולוגית של נוירונים סימפתטיים לבביים בבריאות ובמחלות. שיטה זו מאפשרת ריצוף של אוסף גדול של דגימות נוירונים לאורך פרק זמן. על ידי משיכת גרעינים עם אוליגוס האשטאג, שיטה זו מאפשרת ריבוב של הדגימות.

שיטה זו טומנת בחובה פוטנציאל להתרחב לריצוף נוירונים של הגרעינים האנושיים, דבר שהיה מאתגר בשל גודל התאים הגדולים שלו ואיסוף סימולטני קשה של דגימות. המדגימים את הנוהל יהיו קוני ואן מונסטרן, טכנאי מחקר, ולייק ואן רון, דוקטורנטים מהמעבדה שלנו בגין על ידי איסוף כל החומרים הדרושים לנתיחה, ואז לתקן את העכבר על לוח הנתיחה. הרטיבו את העכבר ב-70% אתנול כדי למזער את פיזור הפרווה.

פתח את העור של אזור הצוואר על ידי ביצוע חתך קו אמצע עם מספריים. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הזיזו את הבלוטות התת-מנדיבולריות הצידה והסירו את שריר המסטואיד החזה כדי לחשוף את עורק הצוואר המשותף ואת הביפורקציה שלו, כמו גם את הגרעינים הצוואריים העליונים ולהסיר את הרקמה המחוברת אליו. נתחו את ביפורקציה של עורק הצוואר הימני והשמאלי ואת הרקמה המחוברת אליו.

העבירו כל פיסת רקמה מנותחת לצלחת פטרי נפרדת בקוטר 3.5 ס"מ המכילה PBS קר. אתר את הגרעינים הצוואריים העליונים המחוברים לביפורקציה הצווארית. נקה את הגרעינים הצוואריים העליונים על ידי הסרת העורק והרקמה המצורפת.

כדי לנתח את הגרעינים הסטלטיים, יש לבצע חתך בקו האמצע בבטן, ולאחר מכן לפתוח את הסרעפת ואת דופן בית החזה הגחוני. הסר את הריאות, ואחריו הלב, כדי לחשוף את בית החזה הגבי. ברמה של הצלע הראשונה, אתרו את הגרעינים הסטלטיים השמאלי והימניים אנטרולטרליים אל השלד והשרירים קולי לונגוס.

לנתח את שני הגרעינים הסטלטיים עם מלקחיים על ידי הסרת הרקמה הסובבת. מעבירים אותם לצלחות פטרי בקוטר 3.5 ס"מ המכילות PBS קר. באמצעות מלקחיים, מעבירים את הגרעינים הצוואריים העליונים ואת גרעיני הסטלטים כדי להפריד בין צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ואז מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA לכל צינור ודגירה באמבט מים רועד.

אפשרו לגרעינים להתיישב בתחתית צינורות המיקרו-צנטריפוגה. מעבירים את ה-supernatant לצינור של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטרים של מדיום גנגליון. לצינורות המיקרו-צנטריפוגה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן מסוג 2 ודגרו באמבט מים רועד.

לאחר הדגירה, החייאת הגרעינים בתמיסת קולגן על ידי צנרת עד שגושי רקמות אינם מזוהים עוד. העבר את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר ששימש בעבר המכיל את מדיום תרבית הגרעינים עם מתלי טריפסין-EDTA. צנטריפוגה את תרחיף התא והשליכה את הסופרנטנט של התא.

בצעו החייאה של הכדור ב-270 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי והעבירו אותו לקרייוביאל של 1 מיליליטר. כדי לספור את התאים, יש לערבב 5 מיקרוליטרים של תרחיף התא הגנגליוני עם חמישה מיקרוליטרים של 0.4% צבע כחול טריפאן. טען את התערובת להמוציטומטר וספור את מספרי התאים הכוללים והחיים תחת מיקרוסקופ.

לאחר מכן, להוסיף 30 microliters של דימתיל sulfoxide לכל cryovial ולערבב היטב. מעבירים את הקריוביציאלים למיכל הקפאת תאים ומניחים אותו על מינוס 80 מעלות צלזיוס בן לילה. מכינים צינורות 15 מיליליטר עם מסננת של 30 מיקרומטר למעלה.

יש לשטוף מראש את המסננת עם 1 מיליליטר של מדיום גנגליון. מוציאים את הקריוביציאלים מחנקן נוזלי ומיד מפשירים אותם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנשארת כדור קרח קטן בקריוביה. מוסיפים 1 מיליליטר של מדיום הגנגליון לכל קריוביאל תוך ניעור זהיר של הבקבוקון כדי לשחזר את התאים הגנגליוניים.

טען את תרחיף התא הגנגליוני על המסננת ושטוף עם 4 עד 5 מיליליטרים של מדיום גנגליון. צנטריפוגה את מתלה התא המתוח. הסר את חומר העל ובצע החייאה של התאים ב-50 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת תאים.

העבר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה בעל קשירה נמוכה של 0.5 מיליליטר. צנטריפוגה את מתלה התא. צנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד היא חיונית מעתה והלאה.

לאחר צנטריפוגה, הסר 45 מיקרוליטרים של ה-supernatant מבלי לנתק את גלולת התא. מוסיפים 45 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס מצונן, מעורבב בעדינות על ידי צנרת, ומדגרים את התאים במשך 8 דקות על קרח, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת גרעינים קרים לכל צינור. צנטריפוגה תרחיף הגרעינים והסרת 95 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט מבלי לשבש את גלולת הגרעינים.

הוסיפו 45 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת גרעינים צוננים לכדור, חזרו על הצנטריפוגה והסירו את ה-supernatant. לכדור הגרעין, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של ST-SB ומקטרים בעדינות עד שהגרעינים עוברים החייאה מוחלטת, ואז מוסיפים 5 מיקרוליטרים של ריאגנט חוסם FC ודגירה למשך 10 דקות על קרח. לאחר מכן, הוסיפו 1 מיקרוליטר של נוגדן האשטאג חד-גרעין ודגרו במשך 30 דקות על קרח.

לאחר הדגירה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של ST-SB לכל צינור. צנטריפוגה את המתלים והסירו 145 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט מבלי לשבש את גלולת הגרעינים. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

בצעו החייאה של גלולת הגרעינים ב-50 מיקרוליטרים של ST-SB וערבבו בעדינות. קחו 5 מיקרוליטרים של תרחיף הגרעינים וערבבו אותו עם 5 מיקרוליטרים של 0.4% טריפאן כחול כדי לספור את הגרעינים תחת מיקרוסקופ. שוב, צנטריפוגה את תרחיף הגרעינים והחזירו את גלולת הגרעינים ב- ST-SB כדי להשיג ריכוז גרעיני מטרה של 1, 000 עד 3, 000 גרעינים למיקרוליטר.

משוך את הדגימות כדי להשיג את מספר התאים הרצוי. ניתוח בקרת איכות להכנת ספרייה הראה כי cDNAs שמקורם בהאשטאג אוליגו קטן מ-180 זוגות בסיסים. פסגה רחבה מ-300 ל-1, 000 זוגות בסיסים ייצגה ספריית ביטוי גנים איכותית, בעוד ששיא מסוים של 194 זוגות בסיסים הראה את ספריית ההאשטאג אוליגו.

ניתוח ריצוף RNA של גרעין יחיד גילה כי 12 צבירים שהוצגו על ידי UMAP ונוגדני האשטאג התפלגו בין כל האשכולות. תיוג ספציפי על ידי האשטאג אוליגוס אושר על ידי הביטוי של Xist. האשטאגים 1 עד 4 מסומנים כנקבה, בעוד ש-5 עד 8 סימנו דגימות זכריות.

האיכות והרזולוציה של נתוני הריצוף אומתו על ידי תעתיקי מפתח כגון TH, DBH ו-SNAP25 באשכולות 5 ו-7 עבור נוירונים סימפתטיים, S100B באשכולות 0 עד 3 עבור תאי גליה לווייניים, PECAM 1 באשכול 4 עבור תאי אנדותל, ו-ACTA2 באשכול 8 עבור תאים סטרומליים. כאשר מנסים שיטה זו, חשוב לזכור את ההכנה הנכונה וציוד הולם כגון מספריים דיסקציה עדינה, פינצטה חדה וצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד הם חיוניים. הגישה הצעדית לריצוף RNA חד-גרעין של גרעינים חיצוניים אוהדים של גרעיני לב יש פוטנציאל ליישום רחב באפיון הגרעינים הפנימיים של איברים ורקמות קשורים אחרים בבריאות ובמחלות.