Name: כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: למדו שיטת כתם גולגי מהירה לצביעת נוירונים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית בעכברושים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח צפיפות קוצים דנדריטיים ופלסטיות עצבית במחקר נוירואנטומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת הלב הקדוש יוזמת מחקר לתואר ראשוןGrants.

כל ההליכים הניסיוניים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת הלב הקדוש והם בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. בידוד וחדירה של רקמת המוח
<ol><li>פתרונות Premix A ו- B של ערכת הכתמים Golgi 24 שעות לפני השימוש ולשמור בבקבוקים כהים ו / או בחושך. הפוך כ 80 מ"ל של פתרון A ו- B לערבב אשר מספיק כדי לשנות את הפתרון לאחר 24 שעות. יש לאחסן בבקבוקים אטומים. הערה: זלוף עם תמיסת מלח או paraformaldehyde אינו הכרחי.</li>
	<li>להקריב חולדות על ידי גיליוטינה בעקבות המתת חסד פחמן דו חמצני ולהסיר מוחות בתוך שניות. יש לשטוף את המוח בתמיסת מלח במידת הצורך, אך אין צורך בכך.<ol>
<li>מניחים את המוח, קליפת המוח כלפי מטה כך ההיפותלמוס גלוי כי החתכים נעשים קדמיים ואחוריים אליו, על משטח שאינו נקבובי. חותכים לבלוק קדמי (מכיל את קליפת המוח הקדם-מצחית) ואת הבלוק האחורי (מכיל את ההיפוקמפוס) כפי שמוצג באיור 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם בלוקים בפתרונות המעורבים מראש של A ו- B, וודא שהם שקועים היטב בפתרון. ודא שאמצעי האחסון של פתרונות A ו- B מספיק כדי לטבול את הבלוקים. יש לאחסן בלוקים בבקבוקים חומים או בבקבוקים שקופים המכוסים בנייר כסף (כדי להרחיק את האור) בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>החליפו את התמיסה לאחר 24 שעות ושמרו בחושך למשך 13 ימים נוספים בטמפרטורת החדר. הערה: אם משתמשים בו עם מוחות עכבר, אין צורך לחסום, וניתן למקם את המוח כולו בתמיסה. אם מכתימים אזורים במוח, השונים בגודלם, ייתכן שהזמן בפתרונות A ו- B ייקבע על ידי ניסוי וטעייה.</li>
	<li>לאחר שבועיים הרקמה מסתננת היטב עם פתרונות A ו- B, להעביר את הבלוקים לפתרון cryoprotectant (פתרון C בערכת הכתמה Golgi), ולהשאיר אותם במשך 48-72 שעות ב 4 °C (4 °F). הערה: לאחר cryoprotection, בלוקים עשויים להיות מוקפאים עד עיבוד נוסף. כמו כן, שימו לב כי כל הפתרונות מהערכה נאספים ונפטרים כפסולת מסוכנת.</li>
	<li>להקפיא את המוח, קליפת המוח למטה, על מגלשת זכוכית על קרח יבש. פעם קפוא או לחתוך על cryostat או לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד חתך באמצעות cryostat. הערה: אין להקפיא בחנקן נוזלי מכיוון שהדבר מייצר סדקים ברקמה.</li>
</ol>2. חתך של רקמות המוח
<ol><li>מניחים כמות קטנה של רקמות בינוניות על צ'אק קריוסטט מקורר מראש. הר בלוקים על צ'אקים קריוסטט על ידי הפשרת צד אחד של הבלוק מעט ביד (בכפפה) והנחתו על מדיום הרקמה. הערה: אין צורך להטמיע את הרקמה. הבלוק המכיל את ההיפוקמפוס הוא קצת יותר קל לחתוך מאשר הבלוק עם קליפת המוח הקדם מצחית כי האחרון הוא קדמי לקורפוס callosum ושני החצאים נפרדים.</li>
	<li>חותכים מקטעי 100 מיקרומטר על קריוסטט ב -22 °C (60 °F) ולהעלות על שקופיות subbed. ניתן להשתמש במקטעים עד 150 מיקרומטר של עובי. נסה להרכיב 3-4 מקטעי coronal לכל שקופית כמו זה מקטין את מספר השקופיות הדורשות עיבוד. השתמש באחת מהטכניקות הבאות כדי לשמור על החלקים קפואים עד שהם נכנסים לשקופית. הערה: מקטעים אלה אינם קבועים בדרך הרגילה ולכן הם נוטים להינמס במהירות. אפשר למקטעים להינמס בשקופית. אם הם מתחילים להינמס לפני שהם ממוקמים על השקופית, אי אפשר לגרום להם להיות שטוחים על השקופית. ישנן מספר טכניקות לעשות זאת.<ol>
<li>השתמש בתרסיס הקפאה על הסכין והבלוק. בהתאם לטמפרטורה ולחות בחדר, ייתכן שיהיה צורך בכל חלק. השתמשו בלוח האנטי-רול או במברשת כדי לשמור על החלק שטוח בזמן החיתוך. הערה: הקפד לקבל מספיק תרסיס הקפאה. מספר פחיות ניתן להשתמש בעת חיתוך 20 בלוקים.</li>
		<li>להפשיר את ההר, אם אפשר, באמצעות שקופית טמפרטורת החדר במהירות appose אותו לחלק. עם תרגול, אפשר להרכיב כמה חלקים בבת אחת. אם זה לא עובד, לשמור שקופיות בקריוסטט כך שהם קרים מאוד ולהעביר את החלק עם מלקחיים קרים או מברשת צבע קרה ולאחר מכן להפשיר הר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נקו את הסכין עם מגבוני נייר בין הפרוסות. אם הסכין דורשת ניקוי נוסף, השתמש 100% אתנול (EtOH), ולתת לו להתייבש לפני חיתוך הפרוסה הבאה.</li>
	<li>לאחר ההתקנה על המגלשה, מניחים את השקופית שטוחה על מגשי שקופיות קרטון ולאפשר למקטעים להתייבש בטמפרטורת החדר (למשך מספר שעות עד 48 שעות לכל היותר) בחושך. אל תכסה את מגש השקופיות. ודא כי החלקים יבשים לחלוטין לפני כניסת גולגי. יש לאחסן שטוח, בחושך, על מגשי שקופיות עד לספיגת גולגי. הערה: ייבוש המקטעים אינו גורם נזק.</li>
</ol>3. הכתמה והתייבשות של רקמת המוח
<ol><li>בצעו ויטראז'ים במנות ויטראז' מזכוכית. יש לערבב את הפתרונות D ו-E מיד לפני ההכתמה. לפי הפרוטוקול, הוסף חלק אחד של פתרון D, חלק אחד של פתרון E ושני חלקים של מים מזוקקים. עבור כלי ויטראז 'זכוכית, לעשות פתרון 200 מ"ל כדי להטביע לחלוטין את החלקים. עבור צנצנות קופלין, זה דורש פחות נפח.</li>
	<li>מקם שקופיות בארון תקשורת במרווחים רחוקים מספיק זה מזה כדי לאפשר גישה לפתרון למקטעים.</li>
	<li>מניחים חלקים במים מזוקקים במשך 4 דקות (2x) לפני שמכניסים אותם לתמיסת הכתמת הספיגה של גולגי למשך 10 דקות. שנה את תמיסת ההכתמה כל 70 חלקים. שנה את המים המזוקקים כאשר הוא הופך צהוב. הערה: התזמון של שלב ההכתמה הוא קריטי. קצר מדי אינו מאפשר מספיק כתמים וגורמים ארוכים מדי על כתמים, מה שהופך את הדנדריטים קשה להפריד בעת ביצוע ניתוח. ברגע שמחוץ לתמיסת ההכתמה התזמון פחות קריטי.</li>
	<li>ייבשו את הסעיפים כדלקמן: 70% EtOH (5 דקות), 95% EtOH (5 דקות; 2x), 100% EtOH (5 דקות; 2x), חומר סליקה (5 דקות; 3x). שנה את כל הפתרונות לעתים קרובות, במיוחד 100% EtOH וסוכן סליקה כדי להבטיח את החלקים להישאר נטולי מים. הערה: אין צורך לעבור שלב EtOH של 50%. אין צורך בהבעת מונים להדמיה של תאים מכיוון שהספגת גולגי מספקת ניגודיות מספקת. השימוש בחומרי סליקה אחרים לא עבד כמו גם זה המשמש כאן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כיסוי עם כיסוי זכוכית באורך 60 מ"מ עם כמות נדיבה של מדיום הרכבה. ודא שיש, כמה שפחות בועות אוויר. במידת הצורך, להסיר בזהירות, ולעשות שוב את המכסה (ניתן לעשות זאת גם שבועות לאחר מכן). לעשות את זה לאט מאוד כדי לא לפגוע בקטע (יכול להיעשות בגלל כמות גדולה של מדיום הרכבה). הערה: כמות גדולה של מדיום הרכבה היא מבולגנת במקצת אך עדיין הכרחית מכיוון שיש להשתמש במדיום הרכבה מספיק כדי לכסות את החלקים העבים של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>כדי להבטיח כי רק כיסוי אחד ממוקם על המקטעים, להפריד את כיסויים מראש של התהליך.</li>
	<li>לאחר שהכיסוי החליק, החלקות היבשות שטוחות על כל נייר שאינו נקבובי במשך 3-5 ימים, מעבירות אותם מעט, במיוחד לאחר היום הראשון, כדי למנוע דבק. לאחר 3-5 ימים להעביר את השקופיות למחזיקי שקופיות, באופן אידיאלי, שקופיות יבשות לפחות 3 שבועות לפני בדיקתם. שמור שקופיות שטוחות כדי להקטין את האפשרות של בועות אוויר להרכיב.</li>
</ol>4. קביעת צפיפות עמוד השדרה הדנדריטית
<ol><li>לניתוח צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי בתאי עצב פירמידליים הן של ה- mPFC והן של אזור CA1 של ההיפוקמפוס, בחן את הדנדריטים הבסיסיים המשניים הצדדיים הצדדיים ביותר ואת הדנדריטים השלישוניים המאוחרים ביותר כמתואר בשלב 4.1.1 (איור 2).<ol>
<li>בחר דנדריט, מדוד את אורך הדנדריט באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, ספור את עמוד השדרה על הדנדריטים באמצעות מונה ידיים, ורשום הן אורך והן מספר קוצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למד וניתח שישה תאים לכל אזור (mPFC, CA1) לכל מוח. לכמת לפחות שישה מוחות לכל קבוצה כפי שתואר בעבר 7,8. בחר נוירונים העונים על הקריטריונים הבאים לניתוח: גופי תאים ודנדריטים ספוגים היטב; דנדריטים נבדלים מתאים סמוכים והם רציפים.</li>
	<li>ספרו את קוצים בגודל 1000x (טבילה בשמן) בספירה ידנית עם מיקרוסקופ אור ומדדו אורך דנדריטי באמצעות תוכנית ניתוח תמונה. חשב את צפיפות עמוד השדרה על ידי חלוקת מספר עמוד השדרה באורך הדנדריט והבע נתונים כמספר קוצים / 10 מיקרומטר דנדריט. הערה: ישנן שיטות מתוחכמות בהרבה להבחנה בין תת-סוגים של עמוד השדרה לבין ארכיטקטורה דנדריטית שניתן להשתמש בהן, אך ספירת ידיים עם מיקרוסקופ אור בגודל 1000x יכולה לתת תוצאה מהירה שיכולה לקבוע אם יש צורך בחקירה נוספת. למרות שנעשה כל מאמץ לדגום באופן עקבי דנדריטים דומים, ישנן וריאציות בעובי שעשויות להשפיע על הספירה.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הספגת גולגי המאפשרת עיבוד סימולטני מהיר של חלקים רבים. זהו שיפור לעומתשתוארו בעבר 5 שיטות עתירות עבודה יותר, בעקביות מניב נוירונים ספוגים לניתוח. בנוסף, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים המשמשים בהספגת גולגי. החלק המאתגר ביותר של התהליך הוא מקבל את החלקים להיות שטוחים על השקופיות, אשר לוקח תרגול ניכר. שמירה על הכל קר ככל האפשר עם השימוש בתרסיס הקפאה היא חיונית.
לאחר ששקופיות יבשות וניתן לבצע ניתוח, חשוב מאוד להיות עקביים בבחירת התאים הנספרים. ...

השיטה של שימוש באשלגן דיכרומט וכסף חנקתי לתיוג נוירונים תוארה לראשונה על ידי קמילו גולגי 1,2 ולאחר מכן שימשה את סנטיאגו רמון y Cajal כדי לייצר גוף עצום של עבודה המבדילה תת-סוגים עצביים וגליאליים. ספר שפורסם לאחרונה עם האיורים שלו זמין כעת3. בעקבות מחקריו של רמון y Cajal, אשר פורסמו לפני יותר מ -100 שנה, מעט מאוד ספיגה גולגי שימש. הספגת גולגי היא תהליך מייגע המאפשר הדמיה תלת ממדית של נוירונים עם מיקרוסקופ אור. היו שינויים רבים בשיטת Golgi לאורך השנים כדי להפוך את השיטה לקלה יותר ואת הכתמים עקביים יותר4. בשנת 1984, Gabbott ו Somogyi5 תיארו את הליך ההספגה גולגי סעיף אחד שאיפשר עיבוד מהיר יותר. שיטת הספגה גולגי זו דורשת זלוף עם 4% paraformaldehyde ו 1.5% חומצה picric, לאחר קיבוע ואחריו חלוקת ויברטום לתוך אמבטיה של 3% אשלגן dichromate. חלקים רכובים על מגלשות זכוכית, ארבע פינות הכיסוי מודבקות כך שכאשר שקועים בכסף חנקתי, הדיפוזיה הדרגתית. לאחר מכן מכסים נפתחים, חלקים מיובשים, ובסופו של דבר מכסים החליק לצמיתות עם מדיום הרכבה. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי לתייג נוירונים גליה 6,7,8 בהיפוקמפוס. שיטת גולגי המהירה המתוארת כאן היא שיפור מכיוון שיש הרבה פחות חשיפה הן אשלגן דיכרומט והן חנקתי כסף ולא נעשה שימוש בפרפורמלדהיד וחומצה פיקרית. בנוסף, למרות תאים שהיו ספוגים באמצעות שינויים של שיטת Gabbott ו Somogyi5 ניתן לנתח, לעתים קרובות החלקים היו חשופים יתר על המידה או מתחת או נפלו מהשקופיות במהלך שלב ההתייבשות ובאופן כללי, כמה ניסויים היו צריכים להיות משולבים יש מספיק תאים לניתוח.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בערכת הכתמה של גולגי (ראה טבלת חומרים) לתיוג דנדריטים וקוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של החולדה. היתרונות של שיטה זו על פני קודמים הם שזה מהיר, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים עבור החוקר ויש כתמים עקביים של נוירונים. הפרוטוקול המתואר להלן שימש עם שינויים קלים כדי להעריך את צפיפות עמוד השדרה דנדריטי בהיפוקמפוס ו- mPFC של החולדה במחקרים רבים 9,10,11,12,13,14,15.

<table><tbody><tr><td>מגשי שקופיות קרטון</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiStain kit</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>יציב ב-RT בחושך במשך חודשים; ערכת צביעה גולגי</td></tr><tr><td>ספריי הקפאה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>סוכן סליקה</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>קייסוויל, יוטה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>רקמות Tek CTYO OCT תרכובת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-373-65</td><td>משמש להרכבת מוחות על צ'אק קריוסטט</td></tr></tbody></table>

כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

ספיגת גולגי, באמצעות ערכת הכתמת גולגי עם התאמות קלות, משמשת להפריית קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס החולדה ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. טכניקה זו היא שיפור ניכר לעומת שיטות קודמות של הספגת גולגי מכיוון שהכימיקלים המעורבים מראש בטוחים יותר לשימוש, נוירונים ספוגים היטב בעקביות, יש הרבה פחות פסולת רקע, ועבור אזור נתון, יש סטיות קטנות מאוד בצפיפות עמוד השדרה בין ניסויים. יתר על כן, המוח יכול להצטבר לאחר נקודה מסוימת ולשמור קפוא עד עיבוד נוסף. באמצעות שיטה זו ניתן ללמוד כל אזור מעניין במוח. לאחר מוכתם וכיסוי החליק, צפיפות עמוד השדרה דנדריטי נקבע על ידי ספירת מספר קוצים לאורך דנדריט מבוטא כמו צפיפות עמוד השדרה לכל 10 מיקרומטר דנדריט.

באמצעות שיטת Golgi המהירה, תאים הם ספוגים היטב באופן עקבי, כך שיש הרבה תאים לנתח. זהו שיפור ניכר לעומת שיטות קודמות שבהן היה צורך לאגד ניסויים כדי שיהיו מספיק נתונים לניתוח. לכן, ניתן לעבד דגימות נוספות בבת אחת וניתן לאחסן את המוח קפוא עד לעיבוד. דוגמאות לתאים ספוגים של גולגי באזור CA1 של ההיפוקמפוס מוצגות בעוצמה נמוכה וגבוהה באיור 3. ספירת קוצים באזור נתון מניבה תוצאות עקביות עם שגיאות סטנדרטיות קטנות. זה חשוב גם כי אפשר לעשות השוואות בין ניסויים. איור 4 ממחיש ...

הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

למרות פשוט יחסית, טכניקת הספיגה Golgi יש כמה צעדים מסובכים כישלון לעשות אותם כראוי תוצאות בתאים שאינם מתאימים לניתוח. טכניקה זו מספקת תיוג מהיר, לשחזור של נוירונים ספוגים Golgi. בנוסף, השגיאה הסטנדרטית הקטנה של הממוצע מאפשרת השוואה בין ניסויים.החלק המאתגר ביותר בטכניקה זו הוא חיתוך קטעי cryostat, כי יש עקביות וקיבעון יוצא דופן, ולכן מקבל אותם על שטוח שקופית הוא קצת אתגר לוקח בפועל. ראשית, מניחים כמות קטנה של רקמות בינוניות על צ'אק קריוסטט טרום מגניב. הר את בלוקי המוח על צ'אקים קריוסטט על ידי הפשרת צד אחד של הבלוק מעט ביד בכפפה והנחתו על מדיום הרקמה.השתמש בתרסיס הקפאה על הסכין והבלוק. השתמשו בצלחת האנטי-רול או במברשת כדי לשמור על החלק שטוח בזמן החיתוך. חותכים 100 מקטעי מיקרומטר על קריוסטט במינוס 22 מעלות צלזיוס.להפשיר הר, אם אפשר, באמצעות שקופית טמפרטורת החדר במהירות להתנגד לו לחלק. לחלופין, שמור שקופיות בהקפאה, כך שהם קופאים. מעבירים את המקטע עם מלקחיים קרים או מברשת צבע קרה ואז מפשירים את ההרכבה.הר שלושה עד ארבעה חלקים קורונליים על שכך. נקו את הסכין עם מגבוני נייר בין הפרוסות. אם הסכין דורשת ניקוי נוסף, יש להשתמש ב-100% אתנול ולייבש לפני חיתוך הפרוסה הבאה.מקם שקופיות בארון תקשורת, מרווחים מספיק כדי לאפשר גישה לפתרון למקטעים. מניחים חלקים במים מזוקקים פעמיים במשך ארבע דקות לפני שמכניסים אותם לפתרון הספיגה של גולגי למשך 10 דקות. הפרד את פתקי הכיסוי כדי להבטיח רק פתק כיסוי אחד ממוקם על המקטעים.מכסים את מגלשות הזכוכית בכמות נדיבה של מדיום הרכבה לפני הנחת פתק כיסוי זכוכית על השקופית. ברגע שהכיסוי החליק, שקופיות יבשות מסומנות על כל נייר שאינו נקבובי במשך שלושה עד חמישה ימים, מזיז אותן מעט, במיוחד לאחר היום הראשון כדי למנוע הידבקות. מאוחר יותר העבר את השקופיות למחזיקי שקופיות ובאופן אידיאלי, שקופיות יבשות במשך שלושה שבועות לפחות לפני בדיקתן.כדי לנתח את צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי בתאי עצב פירמידליים הן של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית והן של אזור CA1 של ההיפוקמפוס, למדוד את האורך הדנדריטי באמצעות תוכנית ניתוח תמונה. לספור את קוצים על dendrites באמצעות מונה יד ולתעד הן אורך ומספר קוצים. לניתוח, בחרו נוירונים עם גופי תאים ודנדריטים בעודם ספוגים, ודנדריטים רציפים ונבדלים מהתאים הסמוכים.האיור מראה דוגמאות של תאים ספוגים גולגי באזור CA1 של ההיפוקמפוס מוצג בעוצמה נמוכה וגבוהה. האיור ממחיש ניסוי שבו צפיפות עמוד השדרה הדנדריטית הבסיסית גדלה על תאים פירמידליים בחולדות זכר ונקבה מתבגרים לאחר העשרה סביבתית ב- CA1 ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. זה מאתגר לשמור על החלקים קרים מספיק בעת חיתוך ואנחנו משתמשים במידה רבה של תרסיס הקפאה כדי לעשות את זה.ולאחר מכן, קשה לקבל את החלקים על השקופיות ויש להם יבש שטוח. טכניקה זו משמשת לבחינת מאפיינים נוירואנטומיים. זה יכול לשמש לבד או בשילוב עם שיטות מעקב נוירואנטומיות אחרות.

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתויג חלבונים בתאים בתרבית. בדקנו את השברים הנייד / נייח של ה-GFP על ידי ניתוח שחזור אחוז הקרינה לאחר photobleaching. במחקר זה, FRAP בוצעה על עמוד השדרה של נוירונים בהיפוקמפוס.

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

מקור: McLeod, F., et al. הערכת צפיפות הסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים בהיפוקמפוס. J. Vis. Exp. (2017). סרטון זה מדגים שיטה להמחשת סמנים סינפטיים בפרוסות מוח בהיפוקמפוס באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי קונפוקלי. הפרוסות מוכתמות במערכת החיסון בנוגדנים ראשוניים המכוונים לסמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. הסמנים המסומנים מוצגים לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את הארכיטקטורה הסינפטית באמצעות הקו-לוקליזציה שלהם.

ניתוח מיקרוסקופי של סינפסות בפרוסות היפוקמפוס של עכבר באמצעות אימונופלואורסצנציה

הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.

לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

אנו מתארים שתי שיטות להדמיה וכימות של ארבוריזציה דנדריטית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברים: הדמיה בזמן אמת ועומק שדה מורחב. בעוד שהשיטה הראשונה מאפשרת מעקב טופוגרפי מתוחכם וכימות של היקף ההסתעפות, השנייה מאפשרת הדמיה מהירה של העץ הדנדריטי.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

למדו שיטת כתם גולגי מהירה לצביעת נוירונים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית בעכברושים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח צפיפות קוצים דנדריטיים ופלסטיות עצבית במחקר נוירואנטומי.

כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

גלה סרטונים נוספים