כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית
3 בדצמבר 2021
הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.
למרות פשוט יחסית, טכניקת הספיגה Golgi יש כמה צעדים מסובכים כישלון לעשות אותם כראוי תוצאות בתאים שאינם מתאימים לניתוח. טכניקה זו מספקת תיוג מהיר, לשחזור של נוירונים ספוגים Golgi. בנוסף, השגיאה הסטנדרטית הקטנה של הממוצע מאפשרת השוואה בין ניסויים.
החלק המאתגר ביותר בטכניקה זו הוא חיתוך קטעי cryostat, כי יש עקביות וקיבעון יוצא דופן, ולכן מקבל אותם על שטוח שקופית הוא קצת אתגר לוקח בפועל. ראשית, מניחים כמות קטנה של רקמות בינוניות על צ'אק קריוסטט טרום מגניב. הר את בלוקי המוח על צ'אקים קריוסטט על ידי הפשרת צד אחד של הבלוק מעט ביד בכפפה והנחתו על מדיום הרקמה.
השתמש בתרסיס הקפאה על הסכין והבלוק. השתמשו בצלחת האנטי-רול או במברשת כדי לשמור על החלק שטוח בזמן החיתוך. חותכים 100 מקטעי מיקרומטר על קריוסטט במינוס 22 מעלות צלזיוס.
להפשיר הר, אם אפשר, באמצעות שקופית טמפרטורת החדר במהירות להתנגד לו לחלק. לחלופין, שמור שקופיות בהקפאה, כך שהם קופאים. מעבירים את המקטע עם מלקחיים קרים או מברשת צבע קרה ואז מפשירים את ההרכבה.
הר שלושה עד ארבעה חלקים קורונליים על שכך. נקו את הסכין עם מגבוני נייר בין הפרוסות. אם הסכין דורשת ניקוי נוסף, יש להשתמש ב-100% אתנול ולייבש לפני חיתוך הפרוסה הבאה.
מקם שקופיות בארון תקשורת, מרווחים מספיק כדי לאפשר גישה לפתרון למקטעים. מניחים חלקים במים מזוקקים פעמיים במשך ארבע דקות לפני שמכניסים אותם לפתרון הספיגה של גולגי למשך 10 דקות. הפרד את פתקי הכיסוי כדי להבטיח רק פתק כיסוי אחד ממוקם על המקטעים.
מכסים את מגלשות הזכוכית בכמות נדיבה של מדיום הרכבה לפני הנחת פתק כיסוי זכוכית על השקופית. ברגע שהכיסוי החליק, שקופיות יבשות מסומנות על כל נייר שאינו נקבובי במשך שלושה עד חמישה ימים, מזיז אותן מעט, במיוחד לאחר היום הראשון כדי למנוע הידבקות. מאוחר יותר העבר את השקופיות למחזיקי שקופיות ובאופן אידיאלי, שקופיות יבשות במשך שלושה שבועות לפחות לפני בדיקתן.
כדי לנתח את צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי בתאי עצב פירמידליים הן של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית והן של אזור CA1 של ההיפוקמפוס, למדוד את האורך הדנדריטי באמצעות תוכנית ניתוח תמונה. לספור את קוצים על dendrites באמצעות מונה יד ולתעד הן אורך ומספר קוצים. לניתוח, בחרו נוירונים עם גופי תאים ודנדריטים בעודם ספוגים, ודנדריטים רציפים ונבדלים מהתאים הסמוכים.
האיור מראה דוגמאות של תאים ספוגים גולגי באזור CA1 של ההיפוקמפוס מוצג בעוצמה נמוכה וגבוהה. האיור ממחיש ניסוי שבו צפיפות עמוד השדרה הדנדריטית הבסיסית גדלה על תאים פירמידליים בחולדות זכר ונקבה מתבגרים לאחר העשרה סביבתית ב- CA1 ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. זה מאתגר לשמור על החלקים קרים מספיק בעת חיתוך ואנחנו משתמשים במידה רבה של תרסיס הקפאה כדי לעשות את זה.
ולאחר מכן, קשה לקבל את החלקים על השקופיות ויש להם יבש שטוח. טכניקה זו משמשת לבחינת מאפיינים נוירואנטומיים. זה יכול לשמש לבד או בשילוב עם שיטות מעקב נוירואנטומיות אחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מפרט שיטה מהירה ומותאמת של גולג'י לצביעת נוירונים באופן ספציפי בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הפרה-פרונטלית המדיאלית של חולדות. הטכניקה מאפשרת סימון יעיל של נוירונים, ובכך מאפשרת ניתוח של מאפיינים נוירו-אנטומיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- נוירו-אנטומיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- טכניקת סגינה של גולג'י היא שיטה מבוססת לצביעת נוירונים.
- היישום מאפשר חקירה של מבנה הדנדריטים וצפיפות הקוצים.
- ניתן להתאים את השיטה לאזורים שונים במערכת העצבים.
- קיימים אתגרים בחיתוך נתחים בקריוסטטים בשל עקביות הרקמה.
מטרת המחקר
- שיפור שיטת גולג'י הקיימת לצורך סימון עצבי טוב יותר.
- בדיקת צפיפות קוצים דנדריטיים באזורי מוח ספציפיים.
- בחינת השפעותיהם של גורמים סביבתיים על מורפולוגיה עצבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת צביעת גולג'י מהירה ברקמות מוח של חולדה.
- דיוק גבוה בחיתוך נתחים של 100 micrometer באמצעות קריוסטט.
- טכניקות הפשרה להרכבה נכונה של הנתחים על עלויות.
- אינקובציה בתמיסת גולג'י לצביעה יעילה של נוירונים.
- הניתוח כלל מדידה של אורך הדנדריטים וספירת קוצים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה הניבה סימון רב-סיבוב (reproducible) של נוירונים המתאים לניתוח.
- הראיות הראו עלייה בצפיפות הקוצים בנוירונים פירמידליים בעקבות העשרה סביבתית.
- צוינה זיהוי מוצלח של שינויים בצפיפות הקוצים הדנדריטיים הבזאליים בחולדות מתבגרים, זכרים ונקבות כאחד.
מסקנות
- מחקר זה מתקף את שיטת Golgi המשופרת כגישה מהימנה לניתוח נוירו-אנטומי.
- תובנות לגבי צפיפות קוצי הדנדריטים תורמות להבנת הפלסטיות הנוירונלית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול הערכה של השפעות סביבתיות על מורפולוגיית המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת צביעת גולג'י מהירה זו מספקת גישה בעלת שחזוריות ושונות נמוכה להדמיה של צפיפות קוצים דנדריטיים באזורי מוח מרכזיים הרלוונטיים למודלים של מחלות נוירופסיכיאטריות. על ידי מתן אפשרות לכימות עקבי של מבנים סינפטיים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הפרה-פרונטלית, הטכניקה תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתוכניות לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). התאימות שלה לאחסון רקמות קפואות והשונות המינימלית בין ניסויים משפרות את מהימנות הבדיקה במחקרי פרה-קליניים ארוכי טווח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לפלסטיות סינפטית ולמורפולוגיה דנדריטית במעגלים עצביים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות וסטנדרטיות של צפיפות קוצים לכל 10 µm של דנדריט לצורך השוואה מהימנה בין ניסויים.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור נוירו-אנאטומיה מבנית לתוצאות תפקודיות במודלים של העשרה סביבתית ומודלים פרמקולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר באופן עקבי נוירונים עם חדירה טובה של הצבע ובמינימום שרידי רקע, מה שמאפשר ויזואליזציה וספירה מהימנות של קוצים דנדריטיים.
- שחזוריות: מראה סטיות קטנות ביותר בצפיפות הקוצים בין ניסויים, מה שתומך בדיוק הבדיקה ובבעוצמה הסטטיסטית.
- יכולת הרחבה: מאפשר הצטברות של דגימות מוח ואחסון בהקפאה עד לעיבוד, מה שמקל על עיבוד של סדרות דגימות ועל יעילות זרימת העבודה בתהליכי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי לאזורי ההיפוקמפוס וקליפת המוח הפרה-פרונטלית המעורבים במודלים של קוגניציה, דיכאון וסכיזופרניה.
- המשכיות טרנסלציונלית: מאפשר ניתוח צפיפות קוצים (spines) כמדד תומך-ביומארקר להערכת השפעות של תרכובות על המבנה העצבי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מקשר בין שינויים מבניים (למשל, עלייה בצפיפות הקוצים לאחר העשרה) לבין פלסטיות תפקודית, ובכך מחזק את הוודאות לגבי המטרה בתוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לסריקה פנוטיפית פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תוכניות הממוקדות במערכת העצבים המרכזית (CNS) להערכת נוירופלסטיות ושלמות סינפטית.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מבנה דנדריטי וצפיפות קוצים כסממנים לבריאות סינפטית וקישוריות נוירונלית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור (ספירת קוצים לכל 10 µm של דנדריט) המתאימות לניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis) ולהשוואת השפעות של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של צפיפות קוצים בין תנאים שונים באמצעות ניתוח תמונות וספירה ידנית, כאשר טעות תקן נמוכה של הממוצע מגבירה את המהימנות של הנתונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מדדים מבניים המתאימים לתוצאות תפקודיות במודלים של למידה וזיכרון.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה נוירו-אנטומית סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר, הישמימה באזורי מוח שונים ובמודלים שונים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהערכות של פלסטיות סינפטית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות ספיגה עקבית, רקע נמוך ושונות מינימלית בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים נוירו-אנטומיים מהימנים לצורך תעדוף של תרכובות עם השפעות מוכחות על מבנה הדנדריטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי כימות של סמנים ביולוגיים מבניים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הקשורים לנקודות קצה קוגניטיביות והתנהגותיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בחיתוך באמצעות קריוסטט וטיפול ברקמות כדי לשמור על מישוריות ושלמות הפרוסות במהלך החיתוך בטמפרטורה של -22°C.
- תלוי בטכניקות נכונות של הפשרה והרכבה (thaw-mounting) ובשימוש בלוחית למניעת גלילה (anti-roll plate) או במברשת כדי למנוע נזק לפרוסות במהלך ההעברה לזכוכית.
- מחייב תזמון סטנדרטי של הצביעה (10 min בתמיסת Golgi) ומריחה של מדיום הרכבה כדי להבטיח סימון עצבי עקבי.
- כולל תקופות ייבוש ממושכות (3–5 ימים בתחילה, ולאחר מכן ≥3 שבועות) לפני הדימוג, דבר הדורש תכנון מוקדם של לוח הזמנים של זרימת העבודה.
- מסתמך על כוח אדם מיומן לספירה מדויקת של קוצים דנדריטיים ומדידת אורכם באמצעות כלי ניתוח תמונה ומונים ידניים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
