Name: גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד שיטת הדמיה תוך-ורידית ללא תווית לסגמנטציה של מיקרו-סביבת גידולי יונקים באמצעות קולגן ופלואורסצנציה אנדוגנית מ-NAD(P)H. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של אינטראקציות פיזיולוגיות במודל עכברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר במענקי NCI R01 CA216248, CA206458 ו- CA179556 למימון עבודה זו. אנו רוצים גם להודות לד"ר קווין אליסירי ולקבוצת ההדמיה שלו על המומחיות הטכנית שלהם בפיתוח המוקדם של התוכנית התוך-לוויתית שלנו. אנו מודים גם לד"ר בן קוקס ולחברים אחרים בקבוצת הייצור של אליסירי במכון מורגרידג' למחקר על התכנון הטכני החיוני שלהם בשלבים המוקדמים של ה-MIW. ד"ר אלן דובסון סייע בשיחות שימושיות על כלי הפילוח של WeKA הניתן לאימון של ImageJ. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר מליסה סקאלה ולד"ר אלכסה בארס-היטון על השימוש בזמן במיקרוסקופ שלהן. לבסוף, ברצוננו להודות לד"ר בריג'יט ראבה, D.V.M, על כל הדיונים והעצות המהורהרות על הטיפול והטיפול בעכברים שלנו.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הדמיה תוך-ורידית 4D היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות דינמיות בהקשר המרחבי והזמני של המיקרו-סביבה של הגידול הטבעי. כתב יד זה מספק מסגרת תפעולית בסיסית מאוד וניתנת להתאמה כדי למדר אינטראקציות של תאים דינמיים בתוך מסת הגידול, הסטרומה הסמוכה, או בסמיכות לרשת כלי הדם באמצעות אותות אנדוגניים בלבד מדור הרמוני שני או NAD(P)H autofluorescence. פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה, שלב אחר שלב, החל מהשתלת חלון ההדמיה ועד לרכישה, ניתוח ופילוח של תמונות. אנו מאמינים שטכניקה זו תתרום למסגרת ניתוח נחוצה כדי לפלח ולכמת נתונים תוך-ו...

המטריצה החוץ-תאית (ECM) במיקרו-סביבה של הגידול ידועה כמי שהופקדה באופן דינמי ושופצה על ידי סוגי תאים מרובים כדי להקל עוד יותר על התקדמות המחלה 1,2,3. שינויי מטריצה אלה מספקים רמזים מכניים וביולוגיים המשנים את התנהגות התאים ולעתים קרובות גורמים למחזור מתמשך של שיפוץ מטריצה4. חקירת יחסי הגומלין הדינמיים וההדדיים בין תאי הגידול לבין המטריצה החוץ-תאית מתבצעת לעתים קרובות באמצעות תרבית מבחנה תלת-ממדית (תלת-ממדית) או מערכות מיקרופלואידיות. בעוד שגישות אלה מלמטה למעלה הדגימו מנגנונים של שיפוץ ECM 5,6,7, התפשטות מוגברת8, מעבר אפיתל למזנכימלי 9,10,11,12, והגירה ופלישה של תאי גידול 7,13,14,15,16 ההתמקדות שלהם הייתה בעיקר בכמה סוגי תאים (למשל, תאי גידול או פיברובלסטים) בתוך מטריצה תלת-ממדית הומוגנית בהשוואה למגוון ולהטרוגניות של אינטראקציות הקיימות בתוך רקמה פיזיולוגית., בנוסף למערכות in vitro, היסטולוגיה של גידולי ex vivo יכולה גם לספק כמה תובנות לגבי האינטראקציות האלה בין תאים לתאים ותאים-ECM17. לאימונוהיסטוכימיה יש יתרון בכך שהיא מסוגלת לנתח סוגי תאים מרובים ביחס להרכב ההטרוגני המרחבי ולארכיטקטורה של ה-ECM, אך נקודות הקצה הסטטיות של רקמות קבועות אינן לוכדות את האופי הדינמי של אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה. הדמיה תוך-ורידית פתחה את הדלת לחקור אינטראקציות מגוונות ודינמיות בהקשר הפיזיולוגי של המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול.
היכולות של הדמיית גידולים תוך-ורידיים מתקדמות במהירות. שיפורים בתכנון חלונות הדמיה וטכניקות כירורגיות להשתלת החלונות אפשרו הדמיה ארוכת טווח של גידולים אורכיים במגוון מקומות אנטומיים (כלומר, גידול ראשוני, בלוטות לימפה, אתרים גרורתיים 18,19,20). יתר על כן, היכולת של מכשור אופטי להמחיש ולאסוף נתונים בממדים מרובים (כלומר, ספקטרלי, עוצמת פלואורסצנציה מרחבית ואורך חיים), וברזולוציה ובמהירות גבוהה (קצב וידאו) הופכת לנגישה באופן נרחב. הטכנולוגיה המשופרת מספקת הזדמנות לחקור שינויים מהירים באיתות תאי ובדינמיקה פנוטיפית בתוך סביבה פיזיולוגית. לבסוף, הרחבת הכלים האופטוגנטיים והמגוון הרחב של מבנים פלואורסצנטיים גנטיים מאפשרים תיוג של סוגי תאים ספציפיים כדי ללכוד את נדידת התאים במיקרו-סביבה של הגידול או במעקב אחר שושלת התאים במהלך ההתפתחות או התקדמות המחלה21,22. השימוש בכלים אלה בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מספק לחוקרים את ההזדמנות ליצור מודלים ייחודיים של בעלי חיים בזמן.
בעוד שכל ההתקדמות הזו הופכת את ההדמיה התוך-לוויתנית לשיטה רבת עוצמה יותר ויותר לחקר אינטראקציות תאיות דינמיות ופיזיולוגיות, עדיין יש צורך חשוב לפתח אסטרטגיות המספקות הקשר מרחבי, זמני ומבנה ברמת הרקמה לאינטראקציות ביולוגיות אלה. נכון לעכשיו, מחקרי הדמיה תוך-ורידיים רבים מפצים על היעדר ציוני דרך חזותיים כגון כלי דם על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לתוך כלי הדם או שימוש במודלים של עכברים המבטאים באופן אקסוגני חלבונים פלואורסצנטיים כדי להגדיר תכונות פיזיות. צבעים ומצעים הניתנים להזרקה כמו דקסטרנים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לתייג בהצלחה את כלי הדם באוספים תוך-ויטליים19, 23, 24. עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. ראשית, היא דורשת מניפולציות נוספות בעכברים והתועלת שלה מוגבלת לניסויים קצרי טווח. עבור מחקרי אורך, דקסטרן פלואורסצנטי יכול להיות בעייתי כאשר אנו צופים בהצטברות של דקסטרן בתאים פאגוציטיים או דיפוזיה לתוך הרקמה הסובבת לאורך זמן25. שילוב חלבון פלואורסצנטי אקסוגני במודל העכבר הוצג כחלופה לדקסטרנים פלואורסצנטיים, אך מציג מגבלות משלו. הזמינות והמגוון של פלואורופורים אקסוגניים בתוך דגמי עכברים עדיין מוגבלים ויקרים ליצירה. בנוסף, במודלים ספציפיים, כגון מודלים של PDX, מניפולציות גנטיות אינן רצויות או אפשריות. כמו כן, הוכח כי נוכחותם של חלבונים פלואורסצנטיים או ביולומינסצנטיים בתוך התאים מוכרת כזרה בתוך העכבר, ובתוך מודלים של עכברים מדוכאי חיסון, הדבר מפחית את כמות הגרורות עקב התגובה של מערכת החיסון המארחת26,27. לבסוף, חלבונים פלואורסצנטיים אקסוגניים או צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להקשר מרחבי או לפלח נתונים מאוחרים יותר תופסים לעתים קרובות טווחים ראשוניים של ספקטרום האור, שאחרת ניתן היה להשתמש בהם כדי לחקור את האינטראקציות הפיזיולוגיות המעניינות.
השימוש באות הפנימי מה-ECM או פלואורסצנציה אנדוגנית מתאים בתוך הרקמה מייצג אמצעי אוניברסלי פוטנציאלי ללא תוויות לפלח נתונים תוך-תאיים לצורך ניתוח תאי ומרחבי מעמיק יותר. הדור ההרמוני השני (SHG) שימש זה מכבר להדמיית ה-ECM28. עם התפתחותם של כלים חשובים שיסייעו באפיון ארגון הסיבים 29,30,31, ניתן לאפיין את התנהגות התא ביחס למבנה ECM המקומי. בנוסף, אוטופלואורסצנציה מהמטבוליט האנדוגני, NAD(P)H, מספקת כלי נוסף ללא תווית למידור המיקרו-סביבה של הגידול in vivo. NAD(P)H פלואורסצנטי בבהירות בתאי הגידול וניתן להשתמש בו כדי להבחין בין גבולות קן הגידול הגדל לבין הסטרומה הסובבת אותו21,32. לבסוף, כלי הדם הוא מבנה פיזיולוגי חשוב במיקרו-סביבה של הגידול ובאתר של אינטראקציות מפתח ספציפיות לסוג התא 33,34,35. עירור של תאי דם אדומים (RBC) או פלזמת דם שימש כדי לדמיין את כלי הדם של הגידול, ובאמצעות עירור של שניים או שלושה פוטונים (2P; 3P) מדידת קצב זרימת הדם הוכחה כאפשרית36. עם זאת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ניתנים לזיהוי בקלות על ידי חתימות הפלואורסצנטיות האנדוגניות שלהם, זיהוי של כלי דם קטנים עדינים, משתנים ופחות פלואורסצנטיים דורש מומחיות רבה יותר. קשיים מובנים אלה מעכבים פילוח תמונה אופטימלי. למרבה המזל, ניתן למדוד את המקורות הללו של פלואורסצנציה אנדוגנית (כלומר, תאי דם אדומים ופלסמה בדם) גם על ידי הדמיה פלואורסצנטיתלכל החיים 37, המנצלת את התכונות הפוטופיזיות הייחודיות של כלי הדם ומייצגת תוספת שימושית לארגז הכלים התוך-ורידי ההולך וגדל.
בפרוטוקול זה מתוארת זרימת עבודה לסגמנטציה של הדמיה תוך-לוויטלית ארבע-ממדית (4D) המשתמשת במפורש באותות פנימיים כמו פלואורסצנציה אנדוגנית ו-SHG מרכישה ועד ניתוח. פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד למחקרי אורך דרך חלון הדמיה של יונקים שבו פלואורסצנציה אקסוגנית עשויה להיות לא מעשית או אפשרית, כמו במקרה של מודלים של PDX. עם זאת, עקרונות הסגמנטציה המתוארים כאן ישימים באופן נרחב למשתמשים תוך-ורידיים החוקרים ביולוגיה של גידולים, התפתחות רקמות או אפילו פיזיולוגיה של רקמות תקינה. החבילה המדווחת של גישות הניתוח תאפשר למשתמשים להבדיל התנהגות תאית בין אזורים של תצורות סיבי קולגן מיושרות או אקראיות, להשוות מספרים או התנהגויות של תאים השוכנים באזורים ספציפיים של המיקרו-סביבה של הגידול, ולמפות את כלי הדם למיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אות נטול תוויות או פנימי בלבד. יחד, שיטות אלה יוצרות מסגרת תפעולית למקסום עומק המידע המתקבל מהדמיה תוך-ורידית 4D של בלוטת החלב תוך מזעור הצורך בתוויות אקסוגניות נוספות.

<table><tbody><tr><td>#1.5 זכוכית כיסוי עגול 12 מ"מ</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td> <td># 64-0712</td><td>בניית MIW</td></tr><tr><td>מזרק 1.0 מ"ל להזרקת SQ</td><td>מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td></tr><tr><td>20x אובייקטיבי</td><td>Zeiss</td><td>421452-988</td><td>טבילה במים</td></tr><tr><td>27G מחט להזרקת SQ</td><td>מחט</td><td>Covidien</td><td>1188827012</td></tr><tr><td>40x אובייקטיבי</td><td>ניקון</td><td>MRD77410</td><td>טבילה במים</td></tr><tr><td>5-0 תפר קלוע משי</td><td>Ethicon</td><td>K870</td><td>תפר להשתלת MIW</td></tr><tr><td>ג'ל דמעות מלאכותיות</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td>ג'ל עיניים</td></tr><tr><td>תמיסת בטדין, 5%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>NC1558063</td> Surgery מוליך <td>חיטוי</td></tr><tr><td>כותנה עם קצה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td>MIW</td></tr><tr><td>בניית דקסטרן פלואורסצנטי</td><td>Sigma</td><td>T1287-50mg</td><td>תיוג תוך ורידי של</td></tr><tr><td>מלקחיים</td> כלי דם <td>Mckesson.com</td><td>Miltex&nbsp;#18-782</td> צינור פוטו-מכפיל GaAsP <td>מעוקל, 4 אינץ ', מעוקל</td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמיכת חימום</td><td>כרית חימום CARA 72</td><td>&nbsp; 038056000729</td> תא חימום <td>לבחירה טמפרטורה</td></tr><tr><td></td><td>ביתית</td><td></td><td></td></tr> מדריך <tr><td>לכל החיים פלואורסצנטי</td><td>בקר והיקל</td><td></td><td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td></tr><tr><td>בסיס מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-106-01</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>Liqui-Nox</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-125</td><td>MIW ניקוי</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>משכך כאבים</td></tr><tr><td>מיקרו צינור</td><td>Scientific Commodities INC.</td><td>&nbsp; ראש סריקה מולטיפוטון BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker Ultima II</td><td></td><td>ראש סריקה ופלטפורמת הדמיה מולטיפוטון</td></tr><tr><td>מסנן NADH FLIM Chroma</td><td></td><td>284994</td><td>ET 440/80 m-2P</td></tr><tr><td>Nair</td><td>CVS</td><td>339826</td><td>מחמם אובייקטיבי קרם אפילטורי</td></tr><tr><td></td><td>Tokai Hit</td><td>STRG-WELSX-SET</td><td></td></tr><tr><td>SHG/FAD מסנן</td><td>Chroma</td><td>320740</td><td>ET450/ 40m-2P</td></tr><tr><td>מנקה זכוכית נוצץ</td><td>Amazon.com</td><td>B00814ME24</td><td>מנקה זכוכית ללוח</td></tr><tr><td>ספירת פוטונים מושתל MIW SPC-150</td> אור כירורגי <td>בקר והיקל</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FAJ</td><td>B06XV1VQVZ</td><td>מגנטי LED צוואר אווז אור</td></tr><tr><td>מיקרו-מספריים כירורגי</td><td>Excelta</td><td>366</td><td>אל חלד, 3 אינץ'</td></tr><tr><td>משחה אנטיביוטית משולשת</td><td>Actavis פארמה</td><td>NDC 0472-0179-34</td><td></td></tr><tr><td>צנתר טלוויזיה</td> אנטיביוטי <td>מחט BD 30G מותאמת</td><td>אישית: 305106</td><td>קטטר להזרקת טלוויזיה</td></tr><tr><td>מסנן שני פוטונים</td><td>Chroma</td><td>320282</td><td>ET585/65m-2P</td></tr><tr><td>לייזר דו-פוטוני</td><td>קוהרנטי צ'רמליון</td><td></td> ג'ל אולטרסאונד <td>לייזר מולטיפוטון מתכוונן</td></tr><tr><td></td><td>Parker</td><td>PKR-03-02</td><td>ג'ל טבילה במים</td></tr><tr><td>אוריאה גבישים</td><td>Sigma</td><td>U5128-5G</td><td>אופציונלי: FLIM IRF</td></tr></tbody></table>

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

היכולת לדמיין אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות ודינמיות בין סוגי תאים רבים לבין המטריצה החוץ-תאית (ECM) בתוך מיקרו-סביבה של גידול חי היא צעד חשוב לקראת הבנת מנגנונים המווסתים את התקדמות הגידול. אמנם ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות הדמיה תוך-ורידיות עכשוויות, אך זה עדיין מאתגר בשל האופי ההטרוגני של הרקמות והצורך בהקשר מרחבי בתוך התצפית הניסיונית. לשם כך, פיתחנו תהליך הדמיה תוך-ורידי המשלב הדמיה של קולגן מהדור ההרמוני השני, פלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H, ומיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) כאמצעי למידור לא פולשני של המיקרו-סביבה של הגידול לתחומים בסיסיים של קן הגידול, הסטרומה או ה-ECM שמסביב, וכלי הדם. פרוטוקול לא פולשני זה מפרט את התהליך שלב אחר שלב, החל מרכישת תמונות בהילוך מהיר של מודלים של גידולי יונקים ועד לניתוח לאחר העיבוד ופילוח תמונות. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא בכך שהיא מנצלת חתימות מטבוליות כדי להקשר את המיקרו-סביבה של הגידול החי המשתנה באופן דינמי ללא שימוש בתוויות פלואורסצנטיות אקסוגניות, מה שהופך אותה ליתרון עבור מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם במטופלים אנושיים ולשימוש קליני עתידי שבו פלואורופורים חיצוניים אינם ישימים בקלות.

ההתקנה של MIW ותכנון ניסיוני בסיסי הם הצעדים הראשונים בתהליך זה. העיצוב והפרוטוקול הספציפיים האלה של MIW נוחים יותר למחקרי אורך19 , והם נוצלו בהצלחה עם מיקרוסקופים זקופים והפכים כאחד. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך מכיוון שהוא הביא ליציבות תמונה גבוהה יותר של בלוטת החלב עם פחות ממצאי נשימה. באיור 1A, אנו מספקים את הממדים של ה-MIW הנוקשה וסקירה גרפית של תהליך ההשתלה.
שדה ראייה טיפוסי בתוך גידול החלב MMTV-PyMT39 ...

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

הדמיה תוך-ורידית מאפשרת לנו לבחון אינטראקציות פיזיולוגיות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. ועל ידי שימוש בשיטה זו, ניתן למדר התנהגויות דינמיות ספציפיות שנצפו באמצעות תכונות רקמה מקומיות. פרוטוקול זה משתמש רק באות נטול תוויות הנמצא בכל מקום מסיבי קולגן או ממטבוליטים אוטופלואורסצנטיים כדי לפלח את ה-TME, ובכך למזער את כמות המניפולציות לעכבר.שיטה זו ישימה באופן נרחב לכל מערכת תוך-תאית שבה נדרשת הבנת אינטראקציות דינמיות ביחס למבני מטריצה חוץ-תאיים או למבנים וסקולריים. מי שידגימו הליך זה יהיו דייב אינמן, מומחה מחקר בכיר, ואריקה הופמן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה. התחילו להכין זכוכית כיסוי חלון הדמיה של יונקים על ידי השריית זכוכית כיסוי עגולה של 1.5 12 מילימטרים ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ואז ייבשו את זכוכית הכיסוי מתחת למנורת חום והצמידו את הזכוכית למסגרת החלון הדמיה של יונק המתכת באמצעות דבק ציאנואקרילט.לרפא את הדבק למשך הלילה. למחרת, השתמשו במטוש ספוג אצטון כדי לנקות את חלון הדמיית היונקים המורכב מהדבק העודף לפני שתטביעו את חלון הדמיה של היונק ב-70% אתנול למשך 10 דקות לפחות כדי לסייע בניקוי. לאחר הייבוש, אחסנו את חלון הדמיית היונקים המנוקה בצלחת פטרי סטרילית.לפני תחילת הניתוח להשתלת החלון, כלים כירורגיים של autoclave וחיטוי משטחים עם 70% אתנול. הכינו שולחן מחוטא לניתוח עם שמיכת חימום מכוסה בשדה סטרילי. קבעו את שמיכת החימום כך שהטמפרטורה הנמדדת על גבי השדה הסטרילי היא 40 מעלות צלזיוס.השתמש בתאורת עזר קרה ובמשקפיים מגדילים לצורך הניתוח. לבשו PPE המורכב ממעיל מעבדה חד-פעמי סטרילי, שרוולים כירורגיים, כפפות, הגנה על העיניים ומסכת פנים. לאחר מכן, להסיר את הפרווה של העכבר המרדים בבלוטת היונק המפשעה הרביעית עם קרם depilatory ולשטוף את האתר הניתוחי עם גזה ספוגה מים סטרילית.לאחר מכן הכינו את האתר הכירורגי המדולדל לניתוח על ידי חיטוי משטח העור עם שלושה קרצופי בטאדין ואתנול מתחלפים. בסיום, הרימו בעדינות את העור מעל בלוטת החלב מספר ארבע באמצעות מלקחיים. לאחר שהעור נשלף מדופן הגוף, הסר קטע של מילימטר אחד של השכבה העורית בקצה המלקחיים באמצעות מיקרו-חותכים כירורגיים.מבלי לחתוך את הבלוטה הבסיסית, ליצור חתך 10 מילימטר ולאחר מכן לשחרר את בלוטת החלב מן השכבה העורית עם התנועה העדינה של המלקחיים. הוסיפו PBS כדי לכסות את הבלוטה החשופה. השתמשו בתפר קלוע משי 5-0 כדי ליצור תפר מיתר ארנק לאורך שולי הפתח, ואז הכניסו קצה של חלון הדמיה של החלב כך שהשכבה העורית תתחבר לחריץ המקבל של חלון ההדמיה של החלב.תוך כדי מתיחת האפיתל בקצה הנגדי של חלון ההדמיה של היונקים, דחפו את חלון ההדמיה של יונק המתכת למקומו כך שהשכבה העורית תפעיל באופן מלא את החריץ המקבל סביב כל היקף חלון הדמיון של היונק. לאחר מכן חרבו את חוט הארנק כדי למשוך את השכבה העורית לתוך החריץ וקשרו את השכבה כדי לאבטח את החלון. יש למרוח אנטיביוטיקה מקומית על השכבה העורית בחלון ההדמיה של היונק ולנטר באופן רציף את העכבר.לאחר שחזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה, אחסן את העכבר המושתל בחלון הדמיה של היונק בנפרד על מצעים רכים עם איגלו שהונח בכלוב ומאפשר לעכבר להתאושש במשך 48 שעות לפני ההדמיה. לצורך ההדמיה, השתמש במערכת אוויר כפויה המוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס. השתמשו במחמם מטרה נוסף כדי למנוע סחף במיקוד Z ואפשרו למערכת להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני ההדמיה.לאחר מכן הקימו תא חימום על במת המיקרוסקופ. לאחר אישור ההרדמה בשיטת צביטה בבוהן, מוסיפים משחה לעיניים לעכבר. כדי לשמור על הידרציה נכונה, להזריק 0.5 מיליליטרים של PBS תת עורית כל שעתיים למשך ההדמיה.יש למרוח ג'ל על בסיס מים במקום מים למטרה ולנקות את החלק החיצוני של זכוכית חלון ההדמיה של החלב עם אפליקטור כותנה ומנקה זכוכית לפני העברת העכבר לשלב המיקרוסקופ המחומם מראש. לאחר הנחת העכבר על במת המיקרוסקופ, לחץ על צווארון חלון ההדמיה של היונק לתוך חור קליטה של 14 מילימטרים בתוספת הבמה כדי לייצב את התמונות ולהתאים את צינור האיזופלורן. לאחר מכן הביאו את שדה ההדמיה למוקד באמצעות עיניות המיקרוסקופ והתאורה של ברייטפילד, תוך התבוננות בכלי הדם עם זרימת הדם.בדוק את יציבות שדה הראייה. אם קיימים ממצאי תנועת נשימה, יש למרוח דחיסה עדינה על החלק האחורי של הבלוטה עם גוש קצף קטן ופיסת סרט דבק דמוית סיכה. לאחר הפעלת הדחיסה, ודא שזרימת הדם נשמרת בכל שדה הראייה.לאחר שהעכבר מורדם וממוקם בבטחה על שלב המיקרוסקופ ההפוך, התחל לאתר אזורי עניין. באמצעות מקור אור המכוון לחלון ההדמיה של היונקים, השתמשו בעיניים של המיקרוסקופ כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה. ההתמקדות צריכה להיות בראיית כלי הדם וזרימת הדם.הוסף ושמור את מיקומי XY בתוכנה. כאשר נקבעות רמות ההספק המתאימות, הגדירו את ערימת Z והתבוננו במראה של סיבי קולגן בשפע של 20 עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של חלון הדמיית החלב. הקולגן יהפוך לפחות נפוץ ככל שהמיקרוסקופ יעמיק בגידול.החללים בדור ההרמוני השני או SHG חושפים את מיקומם של מסות הגידול. הגדר את פרוסת Z העליונה מתחת לשכבת התאים הבודדים כאשר סיבי הקולגן הראשונים מופיעים על 50 עד 100 מיקרון. הגדר את פרוסת Z התחתונה על 250 מיקרומטרים שבהם הסיבים דוהים החוצה והאות הלקוי שולט.לאחר מכן חזור על ההליך עבור כל עמדות XY שנשמרו. לאחר הגדרת טווח מחסנית Z, הגדל את זמן השהייה לשמונה מיקרו-שניות ובצע אופטימיזציה של הגדרות ההספק והגלאי. מטב את רמות ההספק הדרושות כדי להלהיב את הרקמה עבור כל ניסוי והשתמש בהספקים של עד 90 מילי-וואט ב-750 ננומטר או 70 מילי-וואט ב-890 ננומטר בפתח האחורי של המטרה.לאחר מכן, התחילו במרווחים של 10 דקות בין נקודות איסוף עבור רוב סרטי ההעברה התוך-לוויטליים והתאימו את מרווחי הזמן בהתאם למטרות הניסוי. אם נצפים סימנים של פוטוטוקסיות כמו הלבנת תאים או הגדלה מהירה של האוטו-פלואורסצנציה והלבנת פוטו-אקונומיקה מוגזמת, הפחיתו את עוצמת הלייזר או הגדילו את מרווחי הזמן כפי שעולה מהתנאים. עבור הדמיית אורך חיים פלואורסצנטי או FLIM של NADPH, התחל בסריקת תצוגה מקדימה והתאם את עוצמת הלייזר עד שהקריאה של מפלה השברים הקבוע או CFD תהיה בין 10 לחמישית ו-10 לשישית.חריגה מ-CFD מעבר ל-10 לתוצאה השישית בערימת פוטונים ותוצאות כלליות גרועות. לאחר הגדרת רמת ההספק, הגדר את זמן האינטגרציה בין 90 ל- 120 שניות והתחל את אוסף FLIM כדי להשיג פוטונים משדה הראייה למשך הזמן המוקצב. שדה ראייה טיפוסי בתוך גידול החלב ללא תווית הדגים שפע של סיבי קולגן ליד החלון וירידה בשפע עמוק יותר לתוך הגידול.השימוש בחיים פלואורסצנטיים או NADPH סייע בזיהוי כלי הדם. חלק מהאזורים הכהים בתמונות היו קפלי גידולים או התבקעות של אונות גידול סמוכות. כדי לזהות כלי דם, תמונה מורכבת באמצעות NDPH FLIM אומתה על ידי השוואת הקרנות בעוצמה המרבית של הערימה התוך-ורידית לפני ואחרי הזרקת וריד הזנב של דקסטרן פלואורסצנטי.הניתוח הייצוגי מראה את הכימות של ארבעה עכברים ואת שדות הראייה. כדי לשרטט את הגבולות של מסות הגידול נטולות התוויות, נעשה שימוש באוטופלואורסצנציה של NADPH. התמונות דיווחו על החתימות המטבוליות של התאים ועל מיקומם של כלי הדם.גם ה-AFD זיהה את המקרופאגים. עם ערכת הסגמנטציה, הגידול נטול התוויות חולק לתאים עבור קן הגידול, סטרומה וכלי דם באמצעות SHG ו- NADPH אוטופלואורסצנציה בלבד. בנוסף, ניתן לסווג את סיבי הסטרומה והקולגן גם לאזורים מקומיים של הסיבים המיושרים.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עבור פרוטוקול זה הוא לוודא כי העכבר מסומם כראוי ומרוסן, כך שדה הראייה נשאר יציב להדמיה.

a-label-free-segmentation-approach-for-intravital-imaging-mammary

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד...

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

על ידי שימוש בעכברים מדווחים טרנסגניים ותוויות פלואורסצנטיות הניתנות להזרקה, מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב תוך-חיוני לטווח ארוך מאפשרת הדמיה ישירה של התנהגות התאים המיאלואידיים לאדנומה של המעי הגס במודל סרטן המעי הגס Apc Min/+.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת Apc מינימום / + מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

אנו מתארים שתי שיטות להערכת חדירות בכלי הדם ארעי הקשורים עם מיקרוסביבה הגידול של גרורות (tmem) הדלת הפתח ואת התא סרטן in, באמצעות הזרקה ורידית של משקל גבוה-מולקולרי (155 kda) תוספי בעכברים. השיטות כוללות הדמיה של האינטרטל בבעלי חיים חיים וניתוח רקמות קבועות באמצעות מאימונולובורנציה.

הערכת מיקרוסביבה הגידול של גרורה בתיווך החדירות כלי דם הקשורים להפצת תאים סרטניים באמצעות הדמיה Intravital וניתוח רקמות קבוע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).

כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית

פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

למד שיטת הדמיה תוך-ורידית ללא תווית לסגמנטציה של מיקרו-סביבת גידולי יונקים באמצעות קולגן ופלואורסצנציה אנדוגנית מ-NAD(P)H. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של אינטראקציות פיזיולוגיות במודל עכברי.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

גלה סרטונים נוספים