Name: פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: חקור פיתוח אורגנואידים מבלוטת יותרת המוח עכבר כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בבלוטה זו. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על התבגרות, הזדקנות וגידולים בבלוטה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר KU Leuven והקרן למחקר מדעי (FWO) - פלנדריה. E.L. (11A3320N), ו- C.N. (1S14218N) נתמכים על ידי מלגת דוקטורט מ- FWO / FWO-SB.

ניסויים בבעלי חיים למחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של KU Leuven לניסויים בבעלי חיים (P153/2018). כל העכברים שוכנו במתקן החיות של האוניברסיטה בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה קבועה של 23 ± 1.5 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 40%-60%, ומחזור יום /לילה של 12 שעות), עם גישה למים ומזון עד ליביטום.
1. עכברים
<ol><li>השתמש בזני עכבר זמינים מסחרית, כגון עכברי C57BL/6J, בגיל צעיר-מבוגר (בני 8-12 שבועות). באופן כללי, 2-3 עכברים מספקים מספר מספיק של תאי AL לפרוטוקול.</li>
</ol>2. בידוד וניתוק של העכבר AL
הערה: בינוני A, B ו- C מוכנים מראש19,20. קומפוזיציות מוצגות בטבלה 2.
<ol><li>בידוד של עכבר אל על<ol>
<li>הרדים את העכברים על ידי חנק CO2 , ואחריו עריפת ראש (איור 2A). לשטוף ראשי עכברים עם מים deionized כדי להסיר את הדם לרסס אותם עם 70% EtOH כדי ליצור סביבה סטרילית.</li>
		<li>בעזרת כלים כירורגיים סטריליים, הסירו את עור הראש בין האוזניים (איור 2B).</li>
		<li>פתח את הגולגולת והסר את המוח.<ol>
<li>לשבור את 'גשר האף' (כלומר, חלק קדמי של העצם הקדמית; איור 2B) עם מספריים סטריליות.</li>
			<li>פתחו את הגולגולת עוד יותר עם מספריים, החל מגשר האף השבור לכיוון האוזניים, משני הצדדים (איור 2C).</li>
			<li>הסר את הגולגולת ואת המוח עם פינצטה סטרילית, מבלי לגעת בבלוטת יותרת המוח (איור 2D).</li>
		</ol>
</li>
		<li>הסר את סלה הסרעפת עם פינצטה קהה, מבלי לפגוע בבלוטת יותרת המוח. השלך את ה- PL ואת ה- IL מה- AL תחת סטריאומיקרוסקופ. הערה: PL ו- IL מקושרים ולכן מוסרים בו זמנית. חלקים אלה מופיעים כרקמה לבנה, בהשוואה ל-AL בצבע ורוד (איור 2D).</li>
		<li>בזהירות לבודד את AL עם פינצטה קהה ולאסוף אותו בקבוק 10 מ"ל Erlenmeyer, מלא 3 מ"ל של בינוני A (ראה טבלה 2). מניחים את הבקבוקון על הקרח עד לעיבוד נוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוק של עכבר AL<ol>
<li>הסר את המדיום העל-טבעי (SN) A מבקבוק ארלנמייר המכיל את ה- AL המבודד. הוסף 2 מ"ל של תמיסת טריפסין 2.5% טרום המלחמה (37 °C) ודגר ב 37 °C (15 °F) במשך 15 דקות.</li>
		<li>מבלי להסיר את פתרון הטריפסין, הוסיפו 2 מ"ל של פתרון DNase לפני המלחמה (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל במדיום A; סינון סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר), וסובבו את בקבוק ארלנמייר 10 פעמים. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית (~ 1 דקות) ולהסיר את SN.</li>
		<li>יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין (37°C) (0.1 מ"ג/מ"ל במדיום A; מסונן באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר) ולדגור ב-37°C למשך 10 דקות. תן את משקע בלוטת יותרת המוח לתחתית ולהסיר את SN.</li>
		<li>יש להוסיף 2 מ"ל של B בינוני (37°C) לפני המלחמה (ראו טבלה 2) ולדגור ב-37°C למשך 5 דקות. מבלי להסיר את ה-SN, הוסיפו 2 מ"ל של C בינוני (37 מעלות צלזיוס) (ראו טבלה 2) ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את SN. לשטוף את בלוטת יותרת המוח שלוש פעמים עם מראש (37 °C )? C בינוני.</li>
		<li>לנתק את בלוטת יותרת המוח לתאים בודדים.<ol>
<li>הוסף 2 מ"ל של prewarmed (37 °C) בינוני C. שאיפה ולגרש את בלוטת יותרת המוח עם סטרילי, מלוטש להבה פסטר פיפטה פיפטה מספר פעמים, עד שברים אינם נראים יותר.</li>
			<li>מעבירים את המתלים לצינור 15 מ"ל עם 4.5 מ"ל של פתרון DNase (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל בינוני A; מסונן סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר). לשטוף את Erlenmeyer שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מראש (37 °C) בינוני C ולהעביר את ההשעיה לצינור 15 מ"ל.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מערבבים את ההשעיה התא שנאספה ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 30 מ"ל. לשטוף את צינור 15 מ"ל ואת מסננת התא שלוש פעמים עם 2 מ"ל של C בינוני ולהעביר את ההשעיה לצינור 30 מ"ל.</li>
		<li>מקם את הקצה של פיפטה פסטר זכוכית, מלא 2 מ"ל של 3% סלמון סרום בקר (BSA) פתרון (בינוני A; סטרילי מסונן דרך רשת 0.22 מיקרומטר), בתחתית הצינור בעדינות פיפטה החוצה כדי ליצור שכבת צפיפות גלויה. צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).</li>
		<li>הסר את SN על ידי היפוך הצינור בתנועה שוטפת אחת ולהסיר את טיפות SN הנותרות עם קצה P1000. לפנק מחדש את גלולה התא ב 1 מ"ל של קר כקרח מתקדם DMEM / F12 (עו"ד DMEM / F12) ולכמת את התאים עם מונה תא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הקמה ופולחן של אורגנוידים שמקורם באל על
הערה: להפשיר ECM על קרח מראש (2-3 שעות עבור 1 מ"ל) ולשמור אותו על קרח למשך הפרוטוקול.
<ol><li>זריעת אורגנויד ופולחן<ol>
<li>צנטריפוגה ההשעיה תא AL ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהסיר את SN. Resuspend גלולה התא עו"ד DMEM / F12 באמצעות אמצעי האחסון הספציפי מחושב כדי להגיע לצפיפות תאים של 1.1 x 106 תאים / מ"ל. הערה: לדוגמה, אם ההשעיה התאית מכילה 500,000 תאים / מ"ל, יש לחדש את גלולה התא ב 454.54 μL של Adv DMEM / F12 כדי להגיע לצפיפות הרצויה של 1.1 x 106 תאים / מ"ל.</li>
		<li>להוציא את נפח ההשעיה התא הדרוש לציפוי (על פי המספר הרצוי של בארות לזרע להתפתחות organoid) ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים (ב עו"ד DMEM / F12 ) ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. הערה: לדוגמה, עבור טיפה אחת של 30 μL (ראה שלב 3.1.3), יש לערבב (בעדינות) 9 μL של השעיית תא (המכיל ~ 10,000 תאים כאשר נלקח מן 1.1 x 1010 6 תאים / השעיה מ"ל) עם 21 μL של ECM.</li>
		<li>לבאר, להפקיד טיפה 30 μL של תערובת השעיית התא / ECM (ראה שלב 3.1.2) על צלחת מחוממת מראש (37 °C ) 48-well. להפוך את הצלחת ולתת ECM להתמצק ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הערה: מחממים מראש את צלחות התרבות לפחות 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>החזירו את הצלחת לכיוון הנכון שלה והוסיפו בזהירות 250 μL של PitOM לפני המלחמה (37 °C) (ראה טבלה 1) בתוספת 10 מעכבי סלע מיקרומטר (Y-27632).</li>
		<li>המשיכו לתרבות את האורגנוידים על ידי שינוי המדיום (נטול Y-27632) כל 2-3 ימים עד שהאורגנואידים יגדלו במלואם, וזה לוקח בין 10-14 ימים (איור 3A). לאחר מכן, להעביר את האורגנוידים. הערה: בעת שאיפת המדיום, הקפד לא לשבש את כיפת ECM. הטה מעט את צלחת התרבות והסר את המדיום מהשוליים התחתונים של הבאר. טרי (לפני המלחמה ב 37 °C (50 °F) בינוני יש להוסיף בעדינות לצד הבאר. אם טיפות ג'ל לבטל לצרף, לאסוף את organoids ו resuspend ולתרבות אותם שוב בטיפת ECM חדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבר אורגנויד<ol>
<li>לשאוף את המדיום בעדינות ולהוסיף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 כדי לפורר את ECM ולאסוף את organoids בצינור microcentrifuge. לשטוף פעם אחת עם 400 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 EM. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).</li>
		<li>הסר את SN בזהירות ולהוסיף 400 μL של אנזים טריפל אקספרס (37 °C) טריפל אקספרס (1X). מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, ודגור ב 37 °C (5 °F) במשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.</li>
		<li>לפנק מחדש את הכדור עם 100 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 ולאחר מכן לשבור את האורגנוידים על ידי צנרת נמרצת למעלה ולמטה עם קצה P200 צר (כלומר, לדחוף את הקצה הריק נגד החלק התחתון של צינור microcentrifuge, כדי להפחית את קוטר הפתיחה שלה) עד שברי organoid (עם קוטר סביב 50 מיקרומטר) מתקבלים (איור 3B). הערה: תערובת הדיסוציאציה צריכה להכיל בעיקר שברי אורגנויד ורק כמה תאים בודדים. דיסוציאציה קשה של האורגנוידים לתאים בודדים משפיעה לרעה על הצמיחה מחדש של האורגנוידים.</li>
		<li>הוסף 800 μL של עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.</li>
		<li>מעבר האורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4. Resuspend את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.</li>
		<li>זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5. הערה: בממוצע, 20 organoids לפתח לבאר מתוך 10,000 תאים שלם AL זרע (0.2%). מעבר זה 0 organoids ניתן לפצל ביחס 1:2, וכתוצאה מכך >50 organoids לפתח לכל באר (קטע 1). לאחר מכן ניתן לפצל אורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4 במהלך הקטעים הבאים. צמיחה מחדש של organoids מאט לאחר ~ 10 קטעים (המקבילים 3 חודשים של תרבות), concretated בהדרגה פחות ופחות organoids קטן יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>4. שימור קריופרציה של אורגנוידים שמקורם באל על והפשרה
<ol><li>שימור קריופרציה של אורגנוידים<ol>
<li>פעל בהתאם לפרוטוקול המעבר משלב 3.2.1 עד שלב 3.2.5.</li>
		<li>Resuspend גלולה organoid (המכיל שברים ותאים) עם 1 מ"ל של מדיום cryopreservation (טבלה 3). מעבירים את ההשעיה להקפאה ומניחים אותה על קרח. הערה: אורגנוידים (כלומר, שברים ותאים תוצאתיים) מתוך עד ארבע בארות של צלחת 48-well ניתן לשלב בהקפאה אחת.</li>
		<li>מניחים את cryovials במיכל הקפאה ולהעביר אותם למינוס 80 °C (80 °F).</li>
		<li>לאחר 24 שעות, העבירו את הדגימות לתיבת הקפאה ואחסנו אותן בחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפשרת אורגנוידים שמורים של קריופ<ol>
<li>הסר את cryovial ממיכל החנקן הנוזלי ומניחים אותו על קרח. מיד להמשיך עם פרוטוקול ההפשרה.</li>
		<li>להפשיר את הפתרון עם שברי organoid cryopreserved ותאים בודדים ב 37 °C (אמבט מים). הערה: אל תשמור את הפתרון במשך יותר מ 2 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע רעילות תאים על ידי DMSO.</li>
		<li>העבירו את התוכן לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח עם 30% סרום בקר עוברי (FBS). יש לשטוף את ההקפאה עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 עם 30% FBS.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). תוסיפו מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח והעבירו את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). לנפח מחדש את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס של 30:70. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.</li>
		<li>זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימות אורגנוידים שמקורם באל על
<ol><li>איסוף וליזה של אורגנוידים לבידוד RNA<ol>
<li>לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).</li>
		<li>הסר את SN ולהוסיף 350 μL של מאגר תמוגה עם 1% 2-mercapto-אתנול. מערבולת עבור 30 s ולאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך מיד לבידוד RNA. זהירות: היזהר כי 2-mercapto-אתנול הוא תרכובת רעילה. כל העבודה חייבת להיעשות בברדס אדים כימי תוך לבישת כפפות ניטריל, מסכת אבק ומשקפי בטיחות. 2-Mercapto-אתנול יכול לגרום נזק בלתי הפיך לעיניים ולעור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קיבעון והטבעה של אורגנוידים לכתם אימונו-היסטוכימיה/פלואורסצנטיות<ol>
<li>לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).</li>
		<li>הסר את SN, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר מסלולית (100 סל"ד). אזהרה: PFA הוא מסרטן אנושי ידוע שיכול לגרום נזק בלתי הפיך לקרנית. כל העבודה חייבת להיעשות במכסה מנוע של אדים כימיים. כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות חייבים תמיד להיות משוחקים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ולהסיר את SN. הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו 10 דקות ב-RT על שייקר מסלולי (100 סל"ד), וצנטריפוגה ב-90 x גרם למשך 3 דקות ב-4 °C (4 °F). חזור על שלב הכביסה פעמיים. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F).</li>
		<li>לעיבוד רקמות והתייבשות, להסיר את SN ולהוסיף 150 μL של 2% ג'ל agarose (ב PBS) לכדור organoid באמצעות קצה p200 מורחב מראש (עשה על ידי חיתוך חתיכה קטנה של הקצה). מיד לשפוך את כל עוצמת הקול למעלה ולהוציא במכסה של צינור microcentrifuge. הערה: חשוב לעבוד במהירות, כמו הג'ל המכיל את organoids יתמצק במהירות.</li>
		<li>נותנים לג'ל להתמצק בחוזקה במשך 30 דקות ומעבירים את דיסק הג'ל לקלטת היסטולוגיה. יש לטבול ולאחסן ב-50% EtOH, עד להתייבשות במעבד הרקמות.</li>
		<li>להטמעת פרפין, מניחים את דיסק הג'ל (בעזרת מלקחיים) בתבנית הטבעה וממלאים בפרפין חם (60 מעלות צלזיוס). מניחים את התבניות על 4 מעלות צלזיוס עד שהפרפין מוצק (כ-45 דקות). דגימות אלה ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) או יכול להיות נתון באופן מיידי חתך.</li>
		<li>Microtome בלוקים פרפין המכיל organoids בעובי 5 מיקרומטר ולאסוף את הדגימות על שקופיות זכוכית. הוסף טיפה אחת של מים deionized מתחת לכל קטע כדי לאפשר מתיחה נכונה של הקטע ומניחים את השקופיות על צלחת חימום שטוחה ב 37 °C (50 °F) לילה. יש לאחסן את השקופיות עם מקטעים בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או להמשיך ישירות עם כתמים אימונוהיסטוכימיים או אימונופלואורסצנטיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelmed%2C+S+%22The+pituitary.+3rd+ed%22">The pituitary. 3rd ed</a>. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem%2Fprogenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li>
<li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li>
<li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li>
<li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li>
<li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+disease+and+recovery%3A+How+are+stem+cells+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).</li>
<li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypopituitarism%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+pituitary+shows+stem%2Fprogenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li>
<li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury%3A+time-related+aspects+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li>
<li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem%2Fprogenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+pituitary+SOX2%2B+stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li>
<li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142(2021).</li>
<li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage%2C+a+competence+quenched+in+the+aging+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).</li>
<li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li>
<li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+remodeling+throughout+life%3A+are+resident+stem+cells+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+pituitary+stem%2Fprogenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li>
<li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li>
<li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats%3A+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li>
<li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li>
<li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+and+Dementia%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li>
<li>Trompeter, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-26a%2C+miR-26b%2C+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111(2013).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li>
<li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li>
<li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome%3A+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Endocrine+Society%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li>
<li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+pituitary+cell+population+control%3A+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

האורגנוידים שמקורם באל, כמתואר כאן, מייצגים מודל מחקר רב עוצמה לחקר תאי גזע בלוטת יותרת המוח במבחנה. נכון לעכשיו, גישה זו organoid הוא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקרי. מודל אורגנויד בלוטת יותרת המוח נגזר מתאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע פלוריפוטנט המושרה (iPSC) דווח בעבר, אשר מקרוב recapitulatesess יותרת המוח organogenesis עוברי23; עם זאת, למרות מאוד שימושי כדי ללמוד פיתוח בלוטת יותרת המוח או מודל מחלת יותרת המוח 23,24,25, הפרוטוקול שדווח, הח...

בלוטת יותרת המוח היא בלוטה אנדוקרינית זעירה הממוקמת בבסיס המוח, שם היא מחוברת להיפותלמוס. הבלוטה משלבת תשומות היקפיות ומרכזיות (היפותלמיות) כדי ליצור שחרור הורמונלי מכוון ומתואם, ובכך מווסתת איברים אנדוקריניים למטרה במורד הזרם (כגון בלוטות יותרת הכליה ובלוטות המין) לייצור הורמונים מתאימים בזמן הנכון. בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית ולכן הוא מכונה בצדק בלוטת הורים1.
בלוטת יותרת המוח של העכבר מורכבת משלוש אונות (איור 1), כלומר, האונה הקדמית (AL), האונה האמצעית (IL) והאונה האחורית (PL). AL האנדוקרינית העיקרית מכילה חמישה סוגי תאים הורמונליים, כולל סומטוטרופים המייצרים הורמון גדילה (GH); לקטוטרופים המייצרים פרולקטין (PRL); קורטיקוטרופים המפרישים הורמון adrenocorticotropic (ACTH); תירוטרופים האחראים על ייצור הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH); וגונדוטרופים שהופכים הורמון מחלמן (LH) והורמון מגרה זקיק (FSH). PL מורכב תחזיות אקסונליות מן ההיפותלמוס שבו ההורמונים אוקסיטוצין ו vasopressin (הורמון antidiuretic) מאוחסנים. ה- IL ממוקם בין AL ו- PL ובתים מלנוטרופים המייצרים הורמון מגרה מלנוציטים (MSH). בבלוטת יותרת המוח האנושית, IL נסוג במהלך הפיתוח, מלנוטרופים מופצים בתוך AL1. בנוסף לתאים האנדוקריניים, בלוטת יותרת המוח מכיל גם בריכה של תאי גזע, מסומן בעצם על ידי גורם שעתוק SOX2 2,3,4,5,6. תאי SOX2+ אלה ממוקמים באזור השולי (MZ), בטנת האפיתל של השסע (לומן שריד עוברי בין AL ל- IL), או מפוזרים כאשכולות לאורך הפרנצ'ימה של AL, ובכך מציעים שתי נישות תאי גזע בבלוטה (איור 1)2,3,4,5,6.
בהתחשב באופי החיוני של בלוטת יותרת המוח, תקלה של הבלוטה קשורה עם תחלואה חמורה. Hyperpituitarism (מאופיין על ידי הפרשת יתר של הורמון אחד או יותר) ו hypopituitarism (ייצור פגום או חסר של הורמון אחד או יותר) יכול להיגרם על ידי גידולים נוירואנדוקריניים יותרת המוח (PitNETs; למשל, גידולים המייצרים ACTH המובילים למחלת קושינג) או על ידי פגמים גנטיים (למשל, חוסר GH וכתוצאה מכך גמדות)7. בנוסף, ניתוח בלוטת יותרת המוח (למשל, כדי להסיר גידולים), זיהומים (למשל, שחפת ההיפותלמוסית-יותרת המוח, או זיהומים בעקבות דלקת קרום המוח חיידקית או דלקת המוח), תסמונת שיאן (נמק בגלל זרימת דם לא מספקת עקב איבוד דם כבד בלידה- מתן), אפופלקסיה בלוטת יותרת המוח ופגיעה מוחית טראומטית הם גורמים חשובים אחרים של hypofunction בלוטת יותרת המוח8 . הוכח כי בלוטת יותרת המוח העכבר בעל יכולת התחדשות, להיות מסוגל לתקן נזק מקומי הציג על ידי אבלציה מהונדסת של תאים אנדוקריניים 9,10. תאי הגזע SOX2+ מגיבים בחריפות לפציעה שנגרמה מראה פנוטיפ פעיל, מסומן על ידי התפשטות משופרת (וכתוצאה מכך התרחבות תאי גזע) וביטוי מוגבר של גורמים ומסלולים הקשורים לגבעול (למשל, WNT / NOTCH). יתר על כן, תאי הגזע מתחילים לבטא את ההורמון ablated, ולבסוף וכתוצאה מכך שיקום משמעותי של אוכלוסיית התאים המדולדלים במהלך החודשים הבאים (5 עד 6) 9,10. כמו כן, במהלך שלב ההתבגרות היילוד של הבלוטה (3 השבועות הראשונים לאחר הלידה), תאי הגזע של בלוטת יותרת המוח משגשגים במצב פעיל 6,11,12,13, ואילו הזדקנות אורגניזמית קשורה לירידה בתפקוד תאי הגזע במקום, עקב סביבה דלקתית גוברת (מיקרו)בהזדקנות (או 'הדלקה')10,14 . בנוסף, tumorigenesis בבלוטה קשורה גם עם הפעלת תאי גזע 7,15. למרות הפעלת תאי גזע זוהתה במספר מצבים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח (נסקר ב 7,16), המנגנונים הבסיסיים עדיין לא ברורים. מאז in vivo גישות (כגון מעקב שושלת בעכברים מהונדסים) לא סיפקו תמונה ברורה או מקיפה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח, פיתוח של מודלים במבחנה אמין לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח נורמלית וחולנית היא חיונית. תרבות הפריה חוץ גופית סטנדרטית של תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים נשאר לקוי בגלל יכולת צמיחה מוגבלת מאוד ותנאים לא פיזיולוגיים (2D) עם אובדן מהיר של פנוטיפ (לסקירה מפורטת יותר, ראה16). תרביות כדור 3D (pituispheres) הוקמו מתאי גזע בלוטת יותרת המוח כפי שזוהו על ידי אוכלוסייה צדדית ופנוטיפ SOX2 + 2,3,4. הפיתוספירות גדלות באופן קלונלי מתאי הגזע, מבטאות סמני גזע ומראים יכולת בידול לסוגי התאים האנדוקריניים. עם זאת, הם אינם מתרחבים במידה ניכרת תוך הצגת מעבר מוגבלת בלבד (2-3 קטעים)3,4. מבנים דמויי כדור התקבלו גם מקבצי תאי גזע לא מנותקים של יותרת המוח כאשר הם מתורבתים ב-50% מטריגל מדולל במשך שבוע אחד, אך יכולת ההרחבה לא הוצגה17. הגישה pituisphere משמש בעיקר ככלי קריאה עבור מספרי תאי גזע, אבל יישומים נוספים מוגבלים על ידי יכולת הרחבה נחותה16.
כדי לטפל ולהתגבר על חסרונות אלה, מודל 3D חדש הוקם לאחרונה, כלומר, organoids, החל AL האנדוקרינית העיקרית של עכברים המכילים את תאי הגזע MZ ו parenchymal. הוכח כי האורגנוידים אכן נגזרים מתאי הגזע של בלוטת יותרת המוח, בנאמנות recapitulate הפנוטיפ שלהם18. יתר על כן, האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך, תוך שמירה איתנה על טבע הגבעול שלהם. לכן, הם מספקים שיטה אמינה להרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים לחקר מעמיק. מחקר כזה אינו בר השגה עם מספר מוגבל של תאי גזע שניתן לבודד מ יותרת המוח, אשר גם אינם ניתנים להרחבה בתנאים 2D16. הוכח כי organoids הם כלים יקרי ערך ואמינים לחשוף תכונות תאי גזע בלוטת יותרת המוח חדשים (מתורגם in vivo)14,18. חשוב לציין, מודל organoid משקף בנאמנות את מצב הפעלת תאי הגזע בלוטת יותרת המוח כפי שהתרחשו במהלך נזק לרקמות מקומיות והתבגרות יילודים, מראה יעילות היווצרות משופרת ושכפול מסלולים מולקולריים upregulated 14,18. לפיכך, מודל organoid שמקורו בבלוטת יותרת המוח הוא חדשני ורב עוצמה יותרת המוח ביולוגיה של תאי גזע מודל מחקר, כמו גם כלי קריאת הפעלת תאי גזע.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הקמתם של אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח של העכבר. לשם כך, האל על מבודדת ומנותקת לתאים בודדים, המוטמעים במטריצה חוץ-תאית המחקה מטריגל (להלן ECM). הרכבה תא-ECM הוא אז תרבית במדיום מוגדר, בעצם המכיל גורמי גדילה של תאי גזע ורגולטורים עובריים בלוטת יותרת המוח (המכונה עוד יותרת המוח 'מדיום organoid בלוטת יותרת המוח' (PitOM)18; טבלה 1). לאחר האורגנוידים מפותחים במלואם (לאחר 10-14 ימים), ניתן להרחיב אותם עוד יותר מעבר רציף שוקת ונתונים לחקירה נרחבת במורד הזרם (למשל, אימונופלואורסצנטיות, RT-qPCR, ותמלול בתפזורת או חד-תאית; איור 1). בטווח הארוך יותר, צפוי כי organoids תא גזע בלוטת יותרת המוח יסלול את הדרך תיקון רקמות גישות ורפואה רגנרטיבית.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 48 בארות, מטופלות TC, עטופות בנפרד</td><td>Costar</td><td>734-1607</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר (דרגת תרבית תאים)</td> תוסף <td>Serva</td><td>47330</td><td></td></tr><tr><td>B-27 ( 50X), מינוס ויטמין A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>תבניות בסיס VWR</td><td></td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>מאגר RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>קלטות, Q Path Microtwin</td><td>VWR</td><td>720-2191</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m mesh,</td><td>פלקון</td><td>352340</td><td></td>רעלן</tr><tr><td>כולרה חד פעמי מ-Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus מגלשות הידבקות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 עד 240Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט 99.8+%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10342652</tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> 688001-L-גלוטמין <td></td></tr><tr><td>(200 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס,</td><td>קורנינג</td> ללא LDEV <td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>מיכל הקפאה מר פרוסטי</td> תוסף N-2 <td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>(100X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קריוגניים של Nunc Biobanking and Cell</td> Culture <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde לסינתזה (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Merck</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CF</td><td>R& D systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF בסיסי/FGF2/bFGF (157 aa) חלבון</td><td>R& D מערכות</td><td>234-FSE</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF-10</td><td>פפרוטק</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IGF-1</td><td>פפרוטק</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-6</td><td>פפרוטק</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי נוגין</td><td>פפרוטק</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי R-Spondin-1</td><td>פפרוטק</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אדם/עכבר FGF-8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי סוניק קיפוד/SHH (C25II) N-Terminus</td><td>R& D systems</td><td>464-SH</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy מיקרו</td><td>קיט Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE אגרוז</td><td>לונזה</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>נתרן די-מימן פוספט 1-הידראט</td><td>PanReac-AppliChem</td><td>A1047</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>נתרן-פירובט (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP יחידת מסנן עליון צינור צנטריפוגה סטרילי, 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>מלח סטרפטומיצין סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Excelsior ES מעבד רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>12505356</td><td></td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>TrypL Express Enzyme (1X), פנול אדום</td><td>תרמו </td><td></td> מעכב טריפסין מבית Fisher Scientific 12605028 <td></td></tr><tr><td>מבית Glycine max (פולי סויה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין 2.5%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח של organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

בלוטת יותרת המוח היא בלוטת האנדוקרינית הראשית ויסות תהליכים פיזיולוגיים מפתח, כולל צמיחת הגוף, חילוף החומרים, התבגרות מינית, רבייה, ותגובת מתח. לפני יותר מעשור, תאי גזע זוהו בבלוטת יותרת המוח. עם זאת, למרות היישום של גישות vivogenic, פנוטיפ שלהם, ביולוגיה, ותפקיד עדיין לא ברור. כדי להתמודד עם תעלומה זו, מודל חדש וחדשני אורגנויד במבחנה מפותחת כדי לפענח עמוק ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח. אורגנוידים מייצגים מבני תאים תלת-ממדיים, אשר בתנאי תרבית מוגדרים, מתפתחים באופן עצמי מתאי גזע (אפיתל) של רקמה ומסמנים מחדש סימני היכר מרובים של תאי גזע אלה ורקמתם. זה מוצג כאן כי אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח מפתחים מתאי הגזע של הבלוטה, בנאמנות recapitulate שלהם in vivo phenotypic ומאפיינים פונקציונליים. בין היתר, הם משחזרים את מצב ההפעלה של תאי הגזע כמו ויוו המתרחשים בתגובה לנזק מקומי שנגרם מהונדסים. האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך תוך שמירה איתנה על פנוטיפ הגבעול שלהם. מודל המחקר החדש הוא בעל ערך רב כדי לפענח את הפנוטיפ של תאי הגזע והתנהגות במהלך תנאים מרכזיים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח, החל התבגרות יילודים כדי דהייה הקשורים להזדקנות, ומ בריא לבלוטות חולים. כאן, פרוטוקול מפורט מוצג כדי להקים אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח עכבר, אשר מספקים כלי רב עוצמה לצלול לתוך העולם עדיין חידתי של תאי גזע בלוטת יותרת המוח.

לאחר בידוד וניתוק של AL, התאים הבודדים המתקבלים נזרעים ב- ECM וגדלים בפיתום (איור 1, טבלה 1). איור 3A מציג את תרבית התא ואת הצפיפות בזריעה (יום 0). פסולת קטנה מסוימת עשויה להיות נוכחת (איור 3A, ראשי חץ לבנים), אך תיעלם בעת המעבר. 14 יום לאחר הזריעה, האורגנוידים שמקורם באל-על מפותחים במלואם (איור 3A). האורגנוידים מציגים מורפולוגיה ציסטית, עם שכבת אפיתל המקיפה לומן. בשלב זה, organoids להג...

בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית של הגוף. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של organoids מן בלוטת יותרת המוח העכבר כמו מודל הפריה חוץ גופית 3D רומן לחקור את אוכלוסיית תאי הגזע של הבלוטה אשר הביולוגיה והתפקוד נשארים מובנים היטב.

פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

המודל organoid שלנו הוא בעל ערך רב לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח בהומיאוסטטית, כמו גם תנאי שיפוץ בלוטת יותרת המוח, כגון התבגרות יילודים של הבלוטה, ירידה תפקודית הקשורים להזדקנות, וצמיחת הגידול בבלוטה. עד כה, טכניקת organoid בלוטת יותרת המוח שלנו היא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים של העכבר. מדגימים את ההליך יהיו אמה לאפורט ושרלוט Nys, סטודנטים לדוקטורט בקבוצת המחקר שלי.כדי להתחיל, לשטוף את ראש העכבר עם מים deionized כדי להסיר את הדם. לרסס 70% אתנול על הראש כדי ליצור סביבה סטרילית. לאחר מכן, להסיר את העור בין האוזניים באמצעות כלים כירורגיים סטריליים.כדי לפתוח את הגולגולת, לשבור את גשר האף עם מספריים סטריליים. פתחו עוד יותר את הגולגולת החל מגשר האף לכיוון האוזניים משני הצדדים. הסר את הגולגולת ואת המוח עם פינצטה סטרילית מבלי לגעת בבלוטת יותרת המוח.מוציאים את הסרעפת עם פינצטה בוטה. לאחר מכן, תחת סטריאומיקרוסקופ, להפריד את האונה הקדמית מן האונות האחוריות והבינוניות. לבודד בזהירות את האונה הקדמית עם פינצטה קהה ולאסוף אותו בקבוק 10 מיליליטר Erlenmeyer המכיל שלושה מיליליטר של בינוני A.Add שני מיליליטר של תמיסת טריפסין 2.5% שחומם מראש.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף שני מיליליטר של פתרון DNAse שחומם מראש וסובב את בקבוק ארלנמייר 10 פעמים. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את supernatant.מוסיפים שני מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין שחוממה מראש ודגורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant כאשר בלוטת יותרת המוח שוקע לתחתית. מוסיפים שני מיליליטר של B בינוני שחומם מראש ודגר במשך חמש דקות.מוסיפים שני מיליליטר של C בינוני שחומם מראש לזה ודגור במשך 15 דקות. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, לשטוף אותו שלוש פעמים עם מחממה מראש בינוני C.Add שני מיליליטר של מדיום שחומם מראש C.Aspirate ולגרש את בלוטת יותרת המוח עם סטרילי, מלוטש להבה פיפטה פסטר מספר פעמים עד שברים אינם נראים יותר.העבר את המתלה לצינור 15 מיליליטר המכיל 4.5 מיליליטר של פתרון DNAse שחומם מראש. לשטוף את הבקבוק שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של C בינוני שחומם מראש ולהעביר את ההשעיה לצינור. מערבבים את ההשעיה התאית שנאספה ומסננים אותה דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לצינור של 30 מיליליטר.לשטוף את הצינור ואת מסננת התא שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של C בינוני ולהעביר את ההשעיה לצינור. מלא פיפטה פסטר זכוכית עם שני מיליליטר של BSA. מקם את קצה הפיפטה בתחתית הצינור ומכין בעדינות פיפטה כדי ליצור שכבת צפיפות גלויה.צנטריפוגה ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של DMEM מתקדם קר כקרח / F-12. לאחר מכן, כימת את התאים באמצעות מונה תאים.צנטריפוגה השעיית התא ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה התא מתקדם DMEM / F-12 כדי להגיע לצפיפות התא של 1.1 פעמים 10 כדי 6 תאים למיליליטר. הוסף ECM לנפח הרצוי של השעיית התא ביחס של 30:70 וערבב היטב.הפקידו טיפה של 30 מיקרוליטר מתערובת זו בכל באר של צלחת 48 באר שחוממה מראש. הופכים את הצלחת ומניחים ל-ECM להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף בזהירות 250 microliters של מדיום אורגנויד בלוטת יותרת המוח שחומם מראש בתוספת עם מעכבי סלע 10-micromolar.כל יומיים עד שלושה ימים, לשנות את המדיום ללא מעכב רוק במשך 10 עד 14 ימים עד organoids גדלים במלואם. כדי להעביר את האורגנוידים, תחילה שאפו את המדיום בעדינות והוסיפו 400 מיקרוליטרים של DMEM/ F-12 מתקדם קר כקרח כדי לפורר את ה- ECM. לאחר מכן, לאסוף את organoids בצינור microcentrifuge.שטפו את הבאר עם 400 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 מתקדם וקר כקרח. צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולהוסיף 400 microliters של אנזים טריפל אקספרס שחומם מראש.מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף 400 מיקרוליטרים של DMEM/ F-12 מתקדם קר כקרח. צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.לשפץ את הכדור עם 100 מיקרוליטרים של DMEM / F-12 מתקדם קר כקרח. צמצמו קצה P-200 והשתמשו בקצה כדי לנתק את האורגנוידים על ידי צנרת נמרצת עד שמתקבלים שברי אורגנואידים. הוסף 800 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 מתקדם.צנטריפוגה ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. כדי לעבור את organoids, resuspend את הכדור בנפח נאות של DMEM / F-12 מתקדם ולהוסיף ECM ביחס של 30:70. מערבבים היטב.המשך לזרוע ולתרבות את האורגנוידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. תאים בודדים מנותקים מן האונה הקדמית נזרעו ECM וגדלו במדיום organoid בלוטת יותרת המוח. 14 ימים לאחר הזריעה, האורגנוידים פותחו במלואם והגיעו לקוטר של עד 500 מיקרומטר.בשלב זה, האורגנוידים הציגו מורפולוגיה ציסטית עם שכבת אפיתל המקיפה לומן. לא מומלץ להשתמש בבארות שבהן מבנים צפופים מופיעים לאחר הצמיחה. עבור מעבר חולף, שברי אורגנויד שימשו לזריעה.שבעה ימים לאחר שעבר, צמיחה מחדש organoid חיובי נצפתה עם מבנים ציסטיים. יש להשליך אורגנוידים צפופים, שכן האורגנוידים השליליים עשויים להשתלט על התרבות. ניתוח כתמים אימונופלואורסצנטי עבור סמני האפיתל E-cadherin ו cytokeratins 8 ו 18 אישר את אופי האפיתל של organoids.ביטוי של סמני תאי גזע בלוטת יותרת המוח Sox2 ו Trop2 הדגים את הגבעול, וסמן ספציפי בלוטת יותרת המוח LHX3 הראה פנוטיפ יותרת המוח של organoids. ביטוי הסמן Ki67 הראה כי התאים המרכיבים אורגנויד נמצאים במצב של התפשטות. ניתוח PCR RTQ הראה ביטוי גבוה יותר של סמני גזע באורגנוידים מאשר באונה הקדמית גם לאחר מעברים מרובים, אימות העשרה של תאי גזע.חשוב לצלחת את המספר המתאים של תאים בודדים בכיפת ECM בזריעה הראשונית, וכאשר עוברים את האורגנוידים, יש לזכור לזרוע מחדש שברים ולא תאים בודדים.

development-organoids-from-mouse-pituitary-as-vitro-model-to-explore

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידים אפיתליאליות החל מהשן האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה חזקה ומשקמים מחדש את תאי הגזע האפיתליאליים של השן, כולל יכולת התמיינות האמלובלסט שלהם. המודל האורגנואידי הייחודי מספק כלי מבטיח לחקר הביולוגיה הדנטלית האנושית (תאי גזע) עם פרספקטיבות לגישות התחדשות שיניים.

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

במחקר זה, אנו מספקים טכניקה מפורטת למערכת תרבית אורגנואידים פשוטה אך חזקה בקליפת המוח באמצעות תרביות hPSC סטנדרטיות ללא הזנה. זהו פרוטוקול מהיר, יעיל וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים המדגימים היבטים של סנסנציית המוח במבחנה.

דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול סנסנציה עצבית במוח במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את יצירת מודל אורגני מבוסס ערמונית בעכברים שגדל בדו-ממד. הוא כולל דיסוציאציה אורגנואידית, זריעת תאים, התמיינות, הערכת שלמות אפיתל וזיהום חוץ-גופי עם אשריכיה קולי אורופתוגנית. המודל מספק נגישות אפיקלית ומתאים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך התגברות על מגבלות של מערכות אורגניות תלת-ממדיות מסורתיות.

יצירת מודל מבוסס אורגנואידים בערמונית בעכבר לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

כאן מוצגת שיטה חדשה המאפשרת המרה של פיברובלסטים בעור בוגרים לתאים המפרישי אינסולין. טכניקה זו מבוססת על המרה אפיגנטית, אינה כרוכה בשימוש בווקטורים רטרו-ויראליים או ברכישת מצב פלוריפוטנטי יציב. לכן זה מבטיח מאוד עבור יישומי רפואה תרגומית.

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

חקור פיתוח אורגנואידים מבלוטת יותרת המוח עכבר כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בבלוטה זו. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על התבגרות, הזדקנות וגידולים בבלוטה.

פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח

גלה סרטונים נוספים