צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

פיתחנו שיטה פשוטה לגרימת ניוון גלאוקומה חזק ומתקדם המבוסס על העלאת לחץ תוך עינית זמנית. זה מייצג הזדמנות ייחודית ללמוד נקודות מפתח של פתופיזיולוגיה DrDeramus. זהו מודל קל ללמידה, לא פולשני, בעלות נמוכה וניתן לשחזור רב, המאפשר ניתוח פונקציות in vivo ותכנוני ניסוי לטווח קצר תוך שימוש במספר מופחת של בעלי חיים לכל ניסוי.

הרשתית ועצב הראייה הם חלקים הניתנים להערכה של מערכת העצבים המרכזית, כך שמידול הליקוי המתקדם של מבנים אלה יכול לספק תובנות חשובות לגבי הפרעות נוירודגנרטיביות אחרות. כדי למדוד לחץ תוך עיני בסיסי, או IOP, של עיני ביקורת ניסיוניות ונגדיות, הניחו את החולדה המורדמת במצב דקוביטוס גחוני על ראש הספסל, כך שמשטח הקרנית נגיש בקלות לקצה הטונומטר. מקמו את קצה הטונומטר כך שייגע מעט באזור הקרנית המרכזי בניצב.

לאחר מכן, רכשו את המדידה על ידי לחיצה על כפתור המדידה. לאחר מכן, הניחו את החולדה בתנוחת דקוביטוס צידית קלה מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובדקו את עין הניסוי בהגדלה של פי 40. במהלך ההליך, לשמור על עין הבקרה contralateral משומן על ידי החדרת טיפה של נתרן carmellose או hyaluronate נתרן.

לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מעוקלים, לדחוף בעדינות את גלגל העין הניסיוני קדימה כדי לחשוף את כלי הדם סביב 360 מעלות של הלימבוס. לאחר מכן, עם זאת, באמצעות צריבה אופתלמית בטמפרטורה נמוכה, בעדינות לצרוב את כלי הדם סביב הקרנית. יש להיזהר שלא לצרוב את שולי הקרנית.

לאשר את ההצלחה של ההליך הכירורגי על ידי התבוננות בהופעתם של סימנים עגולים קטנים של צריבה על הלימבוס הסקלרלי, מחיקת כלי הדם הלימבליים והתרחבות האישון בעין המנותחת. לאחר הניתוח, בדוק את IOP מיד לאחר הניתוח בשתי העיניים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, להחיל טיפה של prednisolone אצטט אופתלמי על פני השטח הקדמיים של העין הניסיונית.

לאחר 40 שניות, להחליף אותו עם משחה אנטיביוטית אופתלמית. החל מעקב קליני יומי של עין הניסוי עם תרופות מקומיות המורכבות מתרופה נוגדת דלקת לא סטרואידית ומשחה אנטיביוטית. לניתוח תגובה אופטומוטורית, מקמו את החולדה להרגלה על פלטפורמה הבנויה עם ארבעה צגי מחשב בזווית מרובעת.

שמור על סמן הצלב האדום על מסגרת הווידאו בין עיניה של החולדה הנעה בחופשיות, כפי שהוא מציין את מרכז הגליל הווירטואלי. שימו לב לתגובה האופטומוטורית המורכבת ממעקב רפלקסיבי של ראש החולדה וצווארה המתעוררים על ידי הדירוגים המסתובבים. בתחילה, להציג גירוי עם תדירות מרחבית נמוכה, ולאחר מכן להגדיל את התדירות בהדרגה עד מעקב אחר התנועה הוא לא שם לב.

כדי להקליט את האלקטרורטינוגרמה של הדפוס, לאחר הרדמת החולדה, הכנס בזהירות את האלקטרודה הפעילה בפריפריה הטמפורלית של הקרנית. בנוסף, הכנס את אלקטרודת הייחוס לרקמה התת עורית של הקנטוס הרקתי האיפסילטרלי ואת אלקטרודת הקרקע לאחת הגפיים האחוריות. לאחר מכן מקמו את החולדה במרחק של 20 סנטימטרים ממסך הגירוי, עקבו אחר קו הבסיס של האות והתחילו את הרכישה על ידי לחיצה על כפתור הניתוח במערכת הרכישה.

לאחר בידוד הרשתיות, העבירו אותן לצלחת תרבית בת 24 בארות המכילה PBS של מיליליטר אחד, תוך שמירה על הרשתית הפנימית פונה כלפי מעלה. חדרו את הרקמה על ידי שטיפה עם חומר פעילי שטח לא יוני 0.5% מדולל ב-PBS. לאחר מכן, דגרו על הרקמה ועל התמיסה החוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעד עדין.

במהלך הדגירה, להכין Brn-3a פתרון נוגדנים ראשוני לאחסן בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חסימת הרקמות, יש לדגור על הרשתית ב-200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בארבע מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם רעידות עדינות. לאחר מכן, לשטוף את הרקמה עם PBS.

לדגור על הרקמה ב 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם תמיסת כתמים נגדית גרעינית למשך 10 דקות לצביעת גרעינים פלואורסצנטיים. לאחר שלוש שטיפות PBS, העבירו את הרשתית למגלשת מיקרוסקופ זכוכית באמצעות שתי מברשות קטנות השומרות על צד הזגוגית כלפי מעלה. מקם את רביע הרשתית הגבי כלפי מעלה על שקופית המיקרוסקופ.

לבסוף, החל 200 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה על משטח כיסוי זכוכית והנח אותו על הרשתית המותקנת השטוחה לניתוח מיקרוסקופי. תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונפוקלי, תוך שימוש במטרה מגדילה פי 40, לבחון את התושבות השטוחות כדי להעריך תאי גנגליון ברשתית. לאחר שאיבת גלגל העין, הסר את החלק הפרוקסימלי של החלק התוך אורביטלי של עצב הראייה, כולל חלק מהחלק התוך עיני.

לאחר מכן, מיד מניחים את הדגימות לתוך בקבוקונים או צינורות המכילים 200 עד 300 מיקרוליטר של קיבוע קר. לאחר שעתיים, לשטוף את הרקמה עם קר 100 מיקרומולרי נתרן cacodylate חיץ. לאחר מכן, לאחר קיבוע הרקמה למשך שעה ב-1% אוסמיום טטרוקסיד וחמישה ננו-מולרים של סידן כלורי בארבע מעלות צלזיוס תחת ניעור עדין.

לאחר שלוש שטיפות עם חיץ נתרן קקודילט קר, שטפו את שברי עצב הראייה במים מזוקקים קרים לפני הדגירה למשך הלילה ואצטט משתנה 1% בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לאחר שלוש שטיפות במים, לייבש בהדרגה את הרקמה בריכוז אצטון הולך וגדל. לאחר מכן, בצע שלושה סבבים של הטבעה ותמיסות אצטון שרף אפוקסי לפני הטמעת הרקמה בשרף אפוקסי טהור למשך 24 שעות.

למחרת, הוציאו את הדגימות מנשא הדגימה והעבירו אותן לתבניות הטבעה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר פילמור, השתמש במיקרוטום אולטרה כדי לחתוך חלקים רוחביים דקים למחצה של שברי עצב הראייה. לאחר מכן, אספו והעבירו את החלקים לשקופית זכוכית במיקרוסקופ.

צבעו את החלקים בכחול טולוידין ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 100. לניתוח אולטרה מבני, בצע חתכים דקים במיוחד ואסוף אותם על רשת נחושת. לאחר מכן, להכתים את החלקים עם אצטט משתנה ו ציטראט עופרת לבדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים שידור.

צריבה במעגל מלא גרמה להעלאת IOP מיד לאחר הניתוח בהשוואה לעיני ביקורת. השיא עבור IOP לאחר הניתוח נצפה ביום הראשון וירד בהדרגה לרמות הבסיס ביום השישי. יתר על כן, תפקוד הרשתית הוערך הן מבחינה התנהגותית והן מבחינה אלקטרופיזיולוגית באמצעות רפלקס אופטומוטורי ואלקטרורטינוגרמה של דפוס, בהתאמה.

לאחר הניתוח, שני הפרמטרים הראו שני שלבים נפרדים של ליקוי: שלב חריף של יתר לחץ דם עיני ביום השלישי ושלב ניוון משני ביום ה-30. בהשוואה לעצבי הראייה הביקורתיים, ספירות אקסונליות ומקטעי עצב ראייה רוחביים דקים למחצה ירדו בהדרגה לאחר הניתוח. מיקרוגרפים אלקטרוניים של עצבי ראייה מעין הבקרה הדגימו סיבים מיאלינים צפופים המופרדים על ידי תהליכים דקים של תאי גלייה ומיקרוטובולים אקסונליים ונוירופילמנטים ניכרים.

לעומת זאת, לאחר שלושה ימים של יתר לחץ דם עיני, נצפו כמה סיבים מנוונים, vacuolation ציטופלזמי בתהליכים של תאי גלייה, וכרומטין מעובה בגרעין תאי גלייה. לאחר שבעה ימים, חלה עלייה בסיבים אקסונליים מנוונים ובתהליכים היפרטוניים של תאי גלייה. ואחרי 14 יום, נצפתה אי הסדר נוסף של סיבי עצב הראייה הקשורים לפלישה של תהליכי תאי גלייה בין האקסונים.

יתר על כן, צפיפות תאי גנגליון הרשתית ירדה עם הזמן בעיקר ברביע הרשתית הגבי והרקתי. בעת ביצוע הליך זה, נסה לגעת בעדינות בכלי הגפיים עם קצה צוואר, חוסך את הפריפריה הטבור ולהבטיח סימני צריבה רציפים נצפים סביב הלימבוס הסקלרלי. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מגוון שיטות, כגון הערכה ביוכימית תפקודית ואימונוהיסטוכימית של מבני עיניים ושיטות אחרות שעשויות להכיר בפיזיופתולוגיה של גלאוקומה.