זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA
3 בפברואר 2022
כאן אנו מתארים שני שינויים של בדיקת סיבי הדנ"א כדי לחקור פערי דנ"א חד-גדיליים בשכפול דנ"א לאחר אינדוקציה של נגע. בדיקת הסיבים S1 מאפשרת זיהוי של פערים לאחר שכפול באמצעות אנדונוקלאז S1 ספציפי ל-SSDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפער מאפשרת הדמיה וכימות של תיקון פערים.
הפרוטוקול שלנו פותח אפשרויות חדשות לחקור כיצד שכפול מתרחש על דנ"א פגום. הטכניקות יכולות לזהות היווצרות ותיקון של פערי דנ"א חד-גדיליים, מול נגע הדנ"א. הנוקלאז S1 מבקע את הדנ"א החד-גדילי ומאפשר זיהוי של פערים לאחר שכפול.
גישה זו שימשה לראשונה את ד"ר מנג'יני וד"ר קורדיירו-סטון בשנות ה-70 בברזיל, ולאחרונה הותאמה על ידינו לבדיקת סיבי הדנ"א. שימוש בטכניקה המתוארת כאן כדי לחקור את היווצרותם ותיקוןם של פערים לאחר שכפול יכול לספק תובנות לגבי המנגנון של תיקון דנ"א ותגובת שכפול עקה השומרת על שלמות הגנום. עבור שני הפרוטוקולים המתוארים כאן, סיב S1 ומבחני מילוי הפערים, חיוני לכלול את כל הבקרות כדי להבטיח פרשנות מדויקת של הנתונים.
ההליך יודגם על ידי דבי ג'יי מרטינס, דוקטורנט מהמעבדה שלנו, וד"ר אנאבל קווינט, משתפת פעולה שפיתחה בעבר את הטכניקות הללו כשעבדה בקבוצה שלנו. ראשית, שאפו למדיית התרבית והוסיפו מיד את מדיית התרבית עם 20 מיקרומולר של מדיה IDU לתאים. הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 דקות בדיוק.
לאחר מכן, לשטוף במהירות את התאים עם PBS מחומם מראש פעמיים ולהקרין אותם עם 20 ג'אול למטר UV-C מרובע. השתמש בתאים לא מטופלים כבקרות. מיד להוסיף את המדיה עם 200 מיקרומולר CldU לתאים ולדגום אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 60 דקות בדיוק.
לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS מחומם מראש פעמיים ולחלחל אותם עם חיץ CSK 100 במשך שתיים עד 10 דקות על פי קו התא בטמפרטורת החדר. לאחר חלחול CSK, ניתן לראות את הגרעינים שכמעט ללא ציטופלסמה ניתן לראות בהשוואה לאלה שלפני החדירה. יש לשפוך בזהירות את PBS לצד של כל באר כדי לשטוף את הגרעינים עם PBS.
לאחר מכן, לשטוף את הגרעינים עם חיץ S1. דגירה של הגרעינים במאגר S1 עם 20 יחידות למיליליטר S1 נוקלאז, וללא נוקלאז S1, למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו למאגר S1 והוסיפו 0.1% BSA ב-PBS.
לגרד את הגרעינים ולהעביר אותם לצינור 1.5 מיליליטר מבואר בערך. שמור את הצינורות על קרח כל הזמן. צנטריפוגה של הגרעינים בסביבות 4, 600 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בצעו החייאה של הכדורים ב-PBS בריכוז של כ-1, 500 תאים למיקרוליטר. הניחו את הצינורות על הקרח והמשיכו מיד להכנת סיבי DNA על ידי פרוטוקול התפשטות. הביאו את שקופיות המיקרוסקופ בעיפרון פחמן והניחו אותן שטוחות על מגש.
הקש על החלק התחתון של הצינור כדי להבטיח הומוגניזציה והוסף שני מיקרוליטרים של תאים בחלק העליון של השקופית המתאימה. מוסיפים שישה מיקרוליטרים של מאגר הליזיס ומניחים את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה כחמש פעמים. השתמשו בקצה הפיפטה כדי למשוך את הטיפה מעט לכיוון תחתית המגלשה ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקר את הגרעינים.
הטה את השקופית בערך 20 עד 40 מעלות ואפשר לירידה להתפשט לתחתית המגלשה במהירות נמוכה קבועה. אפשרו למגלשה להתייבש בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, טבלו אותם בצנצנת המכילה את תמיסת התיקון שזה עתה הוכנה ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הדנ"א על השקופיות.
שטפו את המגלשות עם PBS פעמיים במשך חמש דקות ופענחו את הדנ"א עם חומצה קלורידרית 2.5-טוחנות שהוכנה לאחרונה למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות ולחסום עם 5% BSA התחמם בעבר במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הקש בעדינות על הנייר כדי להסיר את הנוזל העודף מהשקופיות.
הוסיפו 30 מיקרוליטרים של נוגדנים ראשוניים לשקופיות באופן טיפתי והניחו החלקת כיסוי על גביה. דגירה למשך שעה עד שעה וחצי בטמפרטורת החדר בחדר חשוך ולח. מניחים את השקופיות בצנצנת עם PBS למשך דקה עד שתי דקות ולאחר מכן מסירים בזהירות את תלושי הכיסוי.
יש לשטוף עם PBST בצנצנת שלוש פעמים במשך חמש דקות ולהניח את השקופיות ב-PBS. הסר את הנוזל העודף על ידי הקשה עדינה על נייר והוסף 30 מיקרוליטרים של הנוגדנים המשניים לשקופיות באופן טיפתי. מניחים פתק כיסוי למעלה.
דגירה למשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח. חזור על השלבים לשטיפת השקופיות והסרת ה- PBS העודף פעם נוספת והוסף 20 מיקרוליטרים של ריאגנט ההרכבה באופן טיפתי לשקופיות. הניחו את החלקת הכיסוי על גביה והימנעו מבועות.
הניחו טיפה של שמן טבילה ליד החלקה העליונה של המגלשה שבה התאים היו מונחים. השתמש בערוץ הירוק וחפש את הנקודות הירוקות ברקע כדי למצוא את המוקד. פתח את תוכנת חבילת היישומים של Leica, לחץ על רכישה ובחר את הערוץ הירוק.
התאם את ההגדרות של הערוץ הירוק לפני הניתוח. לאחר מכן, שנה לערוץ האדום והתאם את ההגדרות. מצא את הריכוז העיקרי של סיבים ועבור לקצוות כדי למצוא את הסיבים הבודדים המפוזרים היטב, שאינם חופפים.
השתמש בערוץ אחד בלבד כדי לבחור את האזורים עבור התמונות ולהימנע מהטיה פוטנציאלית. לחץ על סמל רכישת שכבת-על והתאם את התוכנה להגדלה הנכונה של המיקרוסקופ. צלם כ-15 עד 20 תמונות לכל שקופית לצד השקופית כולה בערוץ הירוק ולאחר מכן בערוץ האדום.
שני הערוצים ממוזגים כעת והכיסוי שנוצר מועבר לתיקיה ייחודית. ניתן לראות את הסיבים עם צבעים אדומים וירוקים. פתח את תוכנת ImageJ, לחץ לחיצה ימנית על הסמל החמישי, בחר באפשרות השנייה ולאחר מכן בחר בכלי קו מפולח.
לחץ לחיצה שמאלית כדי לצייר את הנתיב המדויק של הדרך האדומה או הירוקה ולחץ לחיצה ימנית כדי לעצור את הציור. לחץ על לחצן M במקלדת כדי למדוד את האורך. עבור סיבי S1, עקוב אחר מדידות דרכי האדמה האדומות והירוקות עבור כל סיב ומדוד את אורכי דרכי האדמה האדומים והירוקים מלפחות 150 סיבים מתמונות שונות.
סיב S1 מוצג בתמונות מייצגות אלה. מערכת דנ"א מתהווה-בקרה ללא הפערים ואטומה לביקוע על ידי נוקלאז S1 מוצגת כאן. מערכת דנ"א חיובית לפערים שנבקעו על ידי הנוקלאז S1 הביאה לקיצור אורך דרכי ה-CldU.
ניתן לבצע סכמת תיוג דיפרנציאלית המתוארת בהרחבה בכתב היד של הטקסט כדי לתייג אירועים למילוי פערים. במבחן זה, שנקרא מבחן מילוי פערים, רצועות IDU ארוכות יותר עם לפחות תיקון CldU אחד או פחות תיקוני CldU מתאימים לצפיפות מילוי פער נמוכה. דרכי IDU קצרות יותר, עם לפחות תיקון CldU אחד, ודרכי IDU ארוכות יותר עם יותר טלאי CldU, תואמות לצפיפות מילוי פער גבוהה.
שלב החדירה של פרוטוקול זה הוא חיוני עבור נוקלאז S1 כדי לפעול על הפערים שנוצרו במהלך שכפול של דנ"א פגום. ניתן להשתמש בנוקלאז S1 גם בפרוטוקול בדיקת השביט כדי לזהות את הפערים שנוצרו במהלך שכפול הדנ"א הפגום שנמשך לאחר הטיפול. בדיקת סיבי S1 סללה את הדרך לפרדיגמה החדשה שלפיה פערים לאחר שכפול עלולים לגרום לפגיעות לסרטן, במיוחד בסרטן השד והשחלות הנושא מוטציות בגנים BRCA1 ו-2.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שני שינויים בבדיקת סיבי ה-DNA למחקר של פערים ב-DNA חד-גדילי ב-DNA משתכפל לאחר השראת נגעים. בדיקת סיבי S1 מזהה פערים פוסט-רפליקטיביים באמצעות אנדונוקלאז S1 הספציפי ל-ssDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפערים (gap-filling assay) מאפשרת ויזואליזציה וכמותיות של תיקון הפערים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מנגנוני תיקון DNA
- תגובה למעקה השכפול
- שלמות גנומית
רקע
- היווצרותם ותיקונם של פערים של DNA בעלי גדיל יחיד הם קריטיים לשמירה על שלמות הגנום.
- עבודות קודמות משנות השבעים הניחו את היסודות לבדיחות אלו.
- הבנת תהליכים אלו יכולה לספק תובנות לגבי שכפול DNA על גבי DNA פגום.
- ביקורות מדויקות הן חיוניות לצורך פרשנות של תוצאות מבדיחות אלו.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד מתרחשת רפליקציה על DNA פגום.
- לזהות את ההיווצרות והתיקון של פערים ב-DNA גדיוליים בודדים.
- להעמיק את ההבנה של מנגנוני תיקון DNA ותגובות למעקה רפליקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת סיבי S1 לגילוי פערים לאחר שעתוק (post-replicative gaps).
- בדיקת מילוי פערים לוויזואליזציה וכימות של תיקון פערים.
- הכללת בקרות נחוצות לצורך פרשנות מדויקת של הנתונים.
- התאמה של טכניקות היסטוריות לבדיקות מודרניות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של פערים ב-DNA רצוף-חוט באמצעות בדיקת S1 fiber.
- כימות של תיקון פערים באמצעות בדיקת gap-filling.
- תובנות לגבי מנגנוני תיקון DNA ותגובה למעקה שחזור (replication stress).
- הדגמה של חשיבותן של ביקורות בתכנון ניסויי.
מסקנות
- בדיקות סיבי DNA משוערות מספקות כלים בעלי ערך לחקר שכפול DNA על תבניות פגומות.
- הבנת פערים ב-DNA בעל גדיל יחיד יכולה לתרום למחקרי שלמות גנומית רחבים יותר.
- טכניקות אלו עשויות להוביל להתקדמויות בתחום המחקר של תיקון DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי וכימות של פערים ב-DNA חד-גדילי לאחר שכפול הם קריטיים להפחתת סיכונים בתוכניות גילוי מוקדמות המכוונות לנתיבי יציבות הגנום ותיקון DNA. בדיקת סיבי DNA (DNA fiber assay) משופרת עם נוקלאז S1 מאפשרת מדידה ישירה של תגובות למעקה שכפול ודינמיקת תיקון, ובכך מספקת מידע לצורך תיקוף מטרה וביטחון מנגנוני בפורטפוליו של אונקולוגיה ותחזוקת הגנום. יכולת זו תומכת בהערכה חזויה של ליאביליות בתיקון DNA ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות-סיכון להמשך קידום במחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מנגנוני תיקון DNA במזלגות שעתוק תחת עקה גנוטוקסית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות המעורבות ביצירה ובתיקון של פערים פוסט-רפליקטיביים.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מטרות מועמדות במסלולים של שלמות הגנום.
- מקל על הגברת הביטחון הניבויי בשינוי מסלולים ובאסטרטגיות של לטאלות סינתטית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מבסס קריאות כמותיות חסונות עבור דינמיקה של מזלג שכפול ואירועי תיקון פערים.
- מנרמל את הזיהוי של פערים ב-ssDNA לצורך סריקה ואפיון הדירים הניתנים לשחזור.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה ושימוש חוזר בפלטפורמה להערכת מודולטורים של תיקון DNA.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על עקה של שכפול ודיוק התיקון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של עקה של שכפול, במיוחד בסרטנים עם חסר ב-BRCA.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של סוכנים המכוונים לתיקון DNA.
- מאפשר קבלת החלטות go/no-go מותאמות לסיכון, המבוססות על פנוטיפים כמותיים של תיקון.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים עבור חתימות של חוסר יציבות גנומית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת סיבי ה-DNA משופרת זו משתלבת ברצף הפיתוח משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני עבור תוכניות של תחזוקת הגנום ואונקולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את היווצרותם ותיקונם של פערים לאחר השכפול, ובכך מבהיר את מסלולי התגובה לנזקי DNA.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור מחקרים של תרכובות ושיבושים גנטיים.
- אנליזה: מספק מדידות של אורך המסלול וכמותן של מילוי הפערים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים מכניסטיים של תיקון לבין מודלים של מחלות ואסטרטגיות של סמני ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה למחקר מתמשך על תיקון DNA ועקה של שכפול.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות של תיקון DNA ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה של הבדיקה, את השחזוריות ואת היכולת להרחבה (scalability) בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) ואת יעילות ההון בתוכניות ליציבות הגנום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות תיקון DNA ועקה של שכפול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביצוע בדיקת סיבי DNA (DNA fiber assay) ובניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולתשתית לעיבוד תמונות.
- נדרש שימוש קפדני בביקורות לצורך פירוש מדויק של הנתונים ויכולת השוואה בין צוותים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של תאים אנושיים, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור כל מערכת.
- הרזולוציה מוגבלת לגילוי פערים הגדולים ממאות בסיסים בודדות; נגעים קטנים יותר עשויים להישאר ללא זיהוי.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
S1 Fiber Experimental Setup
3:51
DNA Fiber Preparation by Spreading
4:58
Immunostaining of DNA Fibers
6:45
Image Acquisition and Analysis
8:39
Results: Post-Replicative ssDNA Gaps on Ongoing Forks by S1 Fiber Assay and Post-Replicative Repair by Gap Filling
9:42
Conclusion
