שימוש בספקטרומטר ניידות יונים מחזורי לניסויי ניידות יון דו-מושבית
January 20th, 2022
ספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) היא השלמה מעניינת לספקטרומטריית מסה לאפיון ביומולקולות, בעיקר משום שהיא רגישה לאיזומריזם. פרוטוקול זה מתאר ניסוי IMS (IMS/IMS) דו-מושבי, המאפשר בידוד של מולקולה ויצירת פרופילי הניידות של שבריה.
הפרוטוקול מתאר כיצד להקליט פרופיל ניידות יונים עבור השברים המיוצרים עם הפעלת מולקולה בספקטרומטר המסה, ולהבדיל בין מבנים איסומריים. הפרוטוקול מאפשר לסווג את הגליקנים ל -11 קבוצות לגבי כמה מהמאפיינים המבניים העיקריים שלהם, ובכך לספק מידע שאחרת קשה להשיג. זה יכול לשמש לבניית רשתות מולקולריות שהן גנריות ביותר ומותאמות למשפחות מולקולריות רבות, כגון מטבוליטים או תרופות מעניינות בתחומי מחקר רבים.
הגישה מפיקה את המרב ממושג חדש בספקטרומטריית ניידות היונים, ותהיה שימושית כאשר ספקטרומטריית המסה לבדה לא תצליח להפלות בין שני מבנים. הניסוי דורש שליטה טובה בספקטרומטריית מסה וניידות יונים. עם זאת, הנסיין צריך להיות מוצלח ביישום השיטה אם אחד עוקב בזהירות כל אחד מהשלבים.
מי שידגים את ההליך יהיה סיימון אוליבייה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הגדר רצף IMS של מעבר יחיד מהדף כוונון, מקם את הכלי במצב ניידות ופתח את החלון בקרת רצף מחזורי. בחר מצב מתקדם מהכרטיסיה פונקציות מחזוריות של חלון חדש זה, בחר הוסף חבילה ולאחר מכן יחיד/מרובה מעברים.
המתן עד שרצף של אירועי ניידות יופיע בכרטיסיה רצף של אותו חלון. התאם את הרצף כך שכל היונים הקליברנטיים יבצעו מעבר יחיד סביב מסלול המרוצים המחזורי של IMS. עם זאת, אל תשנה את זמן ההזרקה או את זמן ההוצאה והרכישה, הפחת את הזמן הנפרד לאלפית השנייה.
אם יונים מסוימים של תערובת הכיול אינם מתאימים בחלון זמן ההגעה המוצג, שנה את הסינכרון של ה- IMS עם דוחף מנתח TOF התאוצה האורתוגונלית על-ידי הגדלת מספר הדחיפות לסל בכרטיסיה הגדרות ADC. כדי להקליט רכישה של שתי דקות בחלון בקרת רצף מחזורי, לחץ על רכישה כדי לפתוח את החלון המוקפץ הגדרות רכישה, הזן את שם הקובץ, תיאור ואורך הרכישה, דקות ולחץ על שמור. העבר את הכלי למצב TOF מהדף כוונון MS כדי לבדוק את יציבות האות.
הקלט רכישת טרשת נפוצה מלאה של המדגם למשך דקה אחת, אשר יהיה שימושי כדי לבדוק את התבנית האיזוטופית ואת נוכחותם של מזהמים פוטנציאליים. מקם את הכלי במצב MSMS מהכרטיסיה פרופיל Quad/MS של דף הכוונון הראשי. בחר את המסה של הברזל הממוקד בשדה המסה של MSMS לבידוד ברביעייה.
רשום רכישה של דקה אחת כדי לבדוק את בידוד המבשר בעת עיבוד הנתונים. כדי לבצע בחירה מבוססת ניידות של איזומר העניין, העבר את המכשיר למצב ניידות בחלון בקרת רצף מחזורי, מהכרטיסיה פונקציות מחזוריות, בחר הוסף חבילה ולאחר מכן חתך. המתן להופעת רצף מורכב של אירועי ניידות בכרטיסיה רצף.
מקם את האירוע 'הוצא ורכוש' מיד לאחר האירוע הנפרד הראשון ולאחר מכן לחץ על הפעל. חפש את תוצאות ההפרדה הראשונית שיוצגו בזמן אמת. הגדל את משך הזמן של האירוע הנפרד הראשון עבור הפרדה מרובת מעברים על-ידי שינוי ערך הזמן עבור אירוע זה ברצף עד שהרזולוציה של פסגות IMS תהיה משביעת רצון.
הקלט רכישה של דקה אחת לעיון. לחץ על השהה, מקם את האירוע 'הוצא ורכוש' מתחת לאירועי 'הוצא', 'הוצא' ל'חנות מקדימה' ו'חסימה והוצאה'. התאם את משך האירועים כך שהשיא הממוקד יהיה באזור 'הוצא אל טרום-חנות', וכל יון אחר נמצא באזור 'הוצא' או 'החזק' ו'הוצא'.
מקם את האירוע 'הוצא ורכוש' בסוף הרצף מתחת להוצאה מחדש מקדם-חנות והאירועים הנפרדים השניים. לחץ על הפעל כדי להציג את האוכלוסיה שנבחרה. בדוק את איכות הבידוד.
הקלט רכישה של דקה אחת לעיון. בכרטיסיה רצף, בעמודה לצד זמני האירוע המוגדרים על-ידי המשתמש, חפש את הזמנים המסוכמים של כל האירועים. שימו לב לשרירי הבטן של הזמן שנמצאו על קו האירוע Reinject מקדם-חנות לביצוע כיול CCS.
הגדר את משך הזמן של האירוע נפרד ישירות בהמשך ההוצאה והרכישה לאלפית שנייה אחת. בשורה הוצא מחדש מקדם-חנות, סמן את התיבה אפשר הפעלה ומטב את הפיצול עם הפקד המוכלל. אם הפיצול אינו משביע רצון עם הפקד המובנה, בטל את הסימון בתיבה אפשר הפעלה והמשיך לייעל באופן ידני את מתחי החזרה, להגדיל את מעבר הצבע לפני המערך ולהוריד את מתח היסט המערך עד שהתוצאות יהיו משביעות רצון.
כדי להקליט רכישה של שתי דקות בחלון המוקפץ רכישה, סמן את האפשרות שמור על זמן דריפט כדי ליצור קובץ המכיל רק את זמני ההגעה, לעומת M חלקי Z המסומן כ_dt.raw. לאחר ביצוע ניתוח טרשת נפוצה של תערובת פנטאסכריד arabinoxylan, הספקטרום הציג דפוס איזוטופי עם שיא יחיד ב M מעל Z 685.24 מציע כי שתי התרכובות הן isomeric בטבע. התוספות של pentasaccharides הופרדו באמצעות תא IMS מחזורי, ושלוש פסגות הופרדו עם זמני הגעה שונים.
XA3XXX טהור מציג את הפסגות ב 83 ו 90 אלפיות השנייה, בעוד XA2XX מציג שיא ב 94 אלפיות השנייה. לאחר השלב הראשון של הפרדת IMS, נפלטו יונים השייכים ל- XA3XX, והשיא ב- 94 אלפיות השניה נבחר לניתוח IMS-IMS. הפרדה של שלושה מעברים בוצעה לאחר הזרקה מחדש של היון ללא הפעלה, ושיא עבור XA2XX הושג ב 199 אלפיות השניה.
נתוני ה- IMS-IMS MS שנוצרו בוטלו באמצעות זמן ההגעה וממדי M חלקי Z, ויצרו את ספקטרום IMS-IMS- IMS. הפסגות מעל 0.2% עוצמה יחסית יוצאו לכיול CCS, וכתוצאה מכך ספקטרום IMS-IMS-IMS מכויל CCS. תמיד חשוב לבדוק את הבידוד של יון מבשר, אחרת, הספקטרום עשוי לבוא מתערובת של דריבית הריבית והמזהמים.
השתמשנו בעבר בספקטרום IMS-IMS-IMS כדי לבנות רשתות ולסווג תרכובות, אך ניתן להשתמש בהן גם כדי לחפש במסדי נתונים זיהויים מורכבים. טכניקה זו היא מאוד לאחרונה, אבל אנו מצפים שזה יהיה מאוד שימושי בגליקומיקה, כמו גם בכל הקשר שבו אנליסטים מתמודדים עם מולקולות isomeric.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר ניסוי ספקטרומטריית ניידות יונים טנדם (IMS/IMS) לביצוע אפיון של ביו-מולקולות, עם התמקדות מיוחדת בהבחנה בין איזומרים. הוא מאפשר סיווג של גליקנים לקבוצות מבניות שונות, ומקל על בניית רשתות מולקולריות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אפיון ביו-מולקולרי
- ספקטרומטריית ניידות יונים
- ספקטרומטריית מסה
רקע
- ספקטרומטריית ניידות יונים משלימה את ספקטרומטריית המסה.
- היא רגישה לאיזומריות, ומסייעת בניתוח מבני.
- השיטה חלה על משפחות מולקולריות שונות.
- גליקנים ניתנים לסיווג על סמך מאפיינים מבניים חשובים.
מטרת המחקר
- בידוד מולקולות וניתוח פרופילי ניידות השברים שלהן.
- להבחנה יעילה בין מבנים איזומריים.
- לספק מידע שקשה להשיג באמצעות ספקטרומטריית מסה בלבד.
שיטות ששימשו
- הקלטת פרופילי ניידות יונים של מולקולות מופעלות.
- הבחנה בין מבנים איזומריים על סמך נתוני ניידות.
- סיווג גליקנים ל-11 קבוצות.
- בניית רשתות מולקולריות ליישומי מחקר שונים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבודד ומנתח בהצלחה שברים מולקולריים.
- הוא מאפשר סיווג יעיל של גליקנים.
- השיטה משפרת את היכולת להבחנה בין מבנים דומים.
- היא מתאימה למספר משפחות מולקולריות, כולל מטבוליטים ותרופות.
מסקנות
- גישת ה-IMS/IMS הטנדם היא כלי חשוב בניתוח ביו-מולקולרי.
- היא מספקת תובנות שספקטרומטריית מסה מסורתית עשויה להחמיץ.
- השיטה נגישה עם הקפדה על צעדי הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Cyclic ion mobility spectrometry (IMS/IMS) enables high-resolution structural discrimination of isomeric biomolecules, addressing a critical gap in analytical confidence for glycomics and complex metabolite profiling. This capability strengthens early discovery and target validation by providing molecular fingerprints that mass spectrometry alone cannot resolve, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The method's reproducibility and structural specificity position it as a strategic asset for biopharma R&D pipelines confronting isomeric complexity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise structural classification of isomeric glycans and metabolites, supporting mechanistic de-risking.
- Provides molecular fingerprints for pathway clarification and target validation in complex biological samples.
- Facilitates confident triage of candidate molecules based on structural features not accessible by MS alone.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, CCS-calibrated spectra for assay standardization and downstream screening workflows.
- Supports the development of validated reference datasets for high-throughput compound evaluation.
- Improves screening readiness by enabling discrimination of structurally similar compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular classification with disease-relevant biomarker discovery when isomeric resolution is required.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing robust structural data for candidate selection.
- Reduces translational risk by confirming molecular identity in complex biological matrices.
Pipeline & Workflow Integration
Cyclic IMS/IMS integrates into the analytical discovery continuum, bridging early discovery, lead identification, and preclinical workflows where isomeric discrimination is essential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by resolving isomeric structures in candidate pools.
- Screening: Provides quantitative, reproducible mobility profiles and CCS-calibrated outputs for assay development.
- Analytics: Enables multidimensional data analysis, including molecular networking and database searching for structural annotation.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and molecular identity confirmation in translational studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for diverse molecular families, including glycans, metabolites, and drugs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in molecular characterization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for high-resolution structural analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of structurally complex candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust structural evidence for candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and ion mobility operation and data interpretation.
- Demands access to advanced cyclic IMS instrumentation and CCS calibration standards.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible acquisition and analysis.
- Adaptation across molecular classes may require protocol optimization for specific sample types.
- Isolation quality and contaminant control are critical for reliable structural assignments.
