גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid
9 במרץ 2022
ציברידים טרנסברוכונדריאליים הם תאים היברידיים המתקבלים על ידי התמזגות של תאים מיטוכונדריאליים מיטוכונדריאליים (mtDNA) מדולדלים (תאי rho0 ) עם ציטופלסטים (תאים מלוכדים) שמקורם בחולים הסובלים מהפרעות מיטוכונדריאליות. הם מאפשרים לקבוע את המקור הגרעיני או המיטוכונדריאלי של המחלה, הערכה של פעילות ביוכימית, ואישור של התפקיד הפתוגנטי של גרסאות הקשורות ל- mtDNA.
יצירת סייבר היא עדיין הפרוטוקול המשוכלל להבנת התפקיד הפתוגני של כל מוטציה חדשה בדנ"א המיטוכונדריאלי ולתאמות את אחוז האטריפלסמיה לחומרת המחלה. טכניקה זו מאפשרת ביצוע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית, שבה נעדרת תרומת הרקע הגרעיני של המטופל. טכניקה זו מאפשרת לאמת את הפתוגניות של מוטציה של הדנ"א המיטוכונדריאלי.
ומאפשר לחקור את השפעתו ברמה הביוכימית לשטוף את הכלים 35 מילימטר המכילים את הפיברובלסטים פעמיים באמצעות שני מיליליטרים של 1X PBS ללא סידן ומגנזיום. מנקים את המשטח החיצוני של הכלים עם 70% אתנול, ומחכים עד שהאלכוהול יתאדה. מוציאים את המכסים מהכלים ואת פקקי הברגים מהבקבוקים.
מניחים כל מנה ללא המכסה הפוך בתחתית כל בקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר. לאט לאט מוסיפים 32 מיליליטרים של מדיום נוקלאציה לכל בקבוק ומאפשרים למדיום להיכנס לצלחת ולבוא במגע עם התאים. מוציאים את כל הבועות מהכלים באמצעות פיפטת מרעה ארוכה מזכוכית, ומעוגלים את הקצה בלהבת בונזן.
סגור כל בקבוק עם פקק הבורג, והעביר אותם לצנטריפוגה. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 8, 000 x G.לשאוף את המדיום מן הבקבוקים ולהשליך אותו. מוציאים את הכלים על ידי היפוך הבקבוקים על גזה סטרילית שרוססה בעבר ב-70% אתנול.
נקו את המשטח החיצוני של הכלים והמכסים שלהם ב-70% אתנול, וסגרו את הכלים לאחר שהאתנול מתאדה. לפני שנמשיך לבדוק היווצרות ציטופלסט באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור תאים חיים. חפשו פיברובלסטים מוארכים במיוחד עקב שחול של הגרעינים שלהם המושרה על ידי ציטוכלאסין.
לכל מנה של 35 מילימטר מוסיפים 1, 000, 143 שורות אפס תאים. מושעה מחדש בשני מיליליטרים של מדיום תרבית בתוספת 5% FBS. השאירו את הכלים במשך שלוש שעות באינקובטור פחמן דו-חמצני לח כדי ליישב את 143 תאי האפס בשורה על רוחות הרפאים.
לאחר שלוש שעות של דגירה, לשאוף ולהשליך את המדיום. לשטוף את תאי הדבקות פעמיים עם שני מיליליטרים של מדיום גלוקוז גבוה DMEM ללא סרום או MEM, ואז לשאוף ולהשליך את המדיום. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת פוליאתילן גליקול לתאים ודגירו למשך דקה אחת בדיוק.
לשאוף ולהשליך את תמיסת הפוליאתילן גליקול. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של DMEM גלוקוז גבוה ללא סרום או עם MEM. מוסיפים שני מיליליטרים של מדיום היתוך, ומחממים לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
נסו את התאים במנות התרבית הנותרות ספרו אותם וזרעו אותם לצלחות פטרי אחת או יותר הוסיפו 50 עד 100 תאים למנה בתרבית התוסף עד להופעת שיבוטים. אז תן להם לגדול במשך כמה ימים. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, הרימו את השיבוטים מצלחת פטרי עם גלילי שיבוט או קצה פיפטה.
נסו להימנע מאגום שיבוטים שונים ולהעביר אותם לצלחת 96 באר, שכל באר מכילה 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית משלים. Cybrids נוצרו החל מפיברובלסטים שמקורם בחולה שנשא את M2343A2G ההטרופלסמי אחת ממוטציות הדנ"א המיטוכונדריה הנפוצות ביותר הקשורות למיופתיה מיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה חומצה לקטית ואפיזודות דמויות שבץ. ניתוח של מספר משתנה של חזרות טנדם הראה כי דנ"א סייבר זהה לתאי האפס בשורה המאשרים את החלפת הדנ"א הקיברנטי של המטופל בגנום 143 B.
ניתן להשתמש בפולימורפיזם של אורך מקטע הגבלה, או בניתוחי ריצוף, כדי להעריך את נוכחותה של מוטציית הדנ"א המיטוכונדריאלי ואת אחוז ההטרופלזמה. כאשר מנסים פרוטוקול זה חשוב לאמת את הנכס הגנטי הנכון של הדנ"א הנוקליאון והמיטוכונדריאלי, כמו גם את כמות הדנ"א המיטוכונדריאלי בציברידים המאוכלסים מחדש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ציברידים טרנס-מיטוכונדריאליים הם תאים היברידיים שנוצרים על ידי היתוך תאים דלים ב-mtDNA עם ציטופלסטים מחולים עם הפרעות מיטוכונדריאליות. גישה זו מסייעת בקביעת מקורן של מחלות ובהערכת פעילויות ביוכימיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה מיטוכונדריאלית
רקע
- ציברידים טרנס-מיטוכונדריאליים חיוניים לחקר הפרעות מיטוכונדריאליות.
- הם מאפשרים את ניתוח התרומה הגרעינית והמיטוכונדריאלית למחלה.
- טכניקה זו קריטית לתיקוף הפתוגניות של מוטציות ב-mtDNA.
- הבנת ההשפעה הביוכימית של מוטציות חיונית לניהול המחלה.
מטרת המחקר
- לחקור את התפקיד הפתוגני של מוטציות חדשות ב-DNA מיטוכונדריאלי.
- להקריל בין אחוז ההטרופלזמיה לבין חומרת המחלה.
- לבצע בדיקות ביוכימיות בסביבה גרעינית מבוקרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- היתוך של תאי rho 0 עם ציטופלסטים ללא גרעין.
- בדיקות ביוכימיות להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי.
- תיקוף של מוטציות ב-mtDNA באמצעות אנליזת ציבריד (cybrid).
- שימוש ב-PBS ובאתנול להכנת תאים.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של סיברידים טרנס-מיטוכונדריאליים.
- זיהוי פעילויות ביוכימיות הקשורות למוטציות ב-mtDNA.
- ביסוס מתאם בין רמות ההטרופלסמיה לבין תוצאות המחלה.
- אישור התפקיד הפתוגני של וריאנטים ספציפיים ב-mtDNA.
מסקנות
- ציברידים טרנס-מיטוכונדריאליים יעילים למחקר של מחלות מיטוכונדריאליות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של מוטציות ב-mtDNA והשפעותיהן.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו לפיתוח טיפולים ממוקדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של ציברידים טרנס-מיטוכונדריאליים מאפשרים ניתוח מדויק של התרומות הגנטיות המיטוכונדריאליות לעומת הגרעיניות לליקויים ב-OXPHOS, נקודת מפנה קריטית במחקר של מחלות מיטוכונדריאליות. גישה זו מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית ותיקוף של מטרות עבור מוטציות ב-DNA מיטוכונדריאלי, ובכך היא תומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של גילוי ומחקר תרגומי. היכולת של מערכת הציברידים לבודד ולאפיין פתוגניות מהווה בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכונים עבור תיקי פרויקטים של תוכניות למחלות מיטוכונדריאליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של הפתוגניות של מוטציות ב-DNA מיטוכונדריאלי ברקע גרעיני מבוקר.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין פגמים ב-OXPHOS המונעים על ידי mtDNA לבין כאלו המונעים על ידי nDNA.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים עבור וריאנטים מיטוכונדריאליים חדשים לפני השקעה בשלבים הבאים.
- מספק פלטפורמה למציאת קורלציה בין רמות ההטרפלזמיה לבין פנוטיפים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- הקמה של שורות cybrid שעברו תיקוף עבור בדיקות ביוכימיות וגנטיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר מדידה כמותית של פעילות OXPHOS והשפעת מוטציות.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ובשחזור בין מעבדות למחקר מיטוכונדריאלי.
- הכנת מערכות תאיות חסונות לסריקת תרכובות המכוונות לתפקוד מיטוכונדריאלי לקוי.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאימה מודלים של ציברידים (cybrids) הרלוונטיים למחלה לפיתוח ביומארקרים תרגומיים.
- מספק רצף מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מיטוכונדריאליות.
- מאפשר קידום של התערבויות מועמדות המותאם לסיכון, על בסיס ראיות מכניסטיות.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) עבור פורטפוליו של מחלות מיטוכונדריאליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל הציבריד (cybrid) משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות, תיקוף מטרות והבהרה מכניסטית של הפרעות מיטוכונדריאליות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערת האפס עבור פתוגניות של מוטציות ב-mtDNA ומבהיר גורמים גנטיים לתפקוד לקוי של OXPHOS.
- סריקה: מספקת שורות cybrid סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור בדיקות ביוכימיות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של heteroplasmy ופעילות OXPHOS לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים גנטיים לתיקוף מודלים פרה-קליניים והתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לגילוי מתמשך של מטרות וסמנים ביולוגיים מיטוכונדריאליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות מיטוכונדריאליות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של יצירת ואפיון סיברידים (cybrids) לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של ניסויים (go/no-go) וניהול תיק פרויקטים יעיל מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות למחלות מיטוכונדריאליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיתוך תאים, גנטיקה של מיטוכונדריה ופיתוח בדיקות ביוכימיות.
- דורש גישה לתשתית ייעודית לתרביות תאים, צנטריפוגה ואנליזה מולקולרית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לפרוטוקולים של יצירת cybrid ותיקוף.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי תאים שונים או לרקעים גנטיים הרלוונטיים למחלה.
- אימות של המשאבים הגנטיים הגרעיניים והמיטוכונדריאליים חיוני לצורך דיוק המודל.
