Name: בדיקת הימנעות מקונפליקט מכני למדידת התנהגות כאב בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למדו את שיטת בדיקת ההימנעות מקונפליקט מכני למדידת רגישות לכאב בעכברים. שיטה זו מעריכה מוטיבציות מורכבות המשפיעות על התנהגות הקשורה לכאב ומסייעת בשיפור התרגום של מחקר טרום-קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GM נתמכת על ידי מלגת בוגר NDSEG. VLT נתמכת על ידי מענק NIH NIGMS #GM137906 וקרן ריטה אלן. AJS נתמך על ידי מענקי משרד ההגנה W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197, וקרן ריטה אלן. אנו מודים לד"ר Alexxai Kravitz בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על תכנון והפיכת קבצי המדפסת התלת-ממדית לזמינים באופן חופשי עבור רצפת החדר 2 וצלחת הבדיקה.

כל הניסויים שכללו שימוש בעכברים והנהלים שבוצעו בהם אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים של מרכז הסרטן MD Anderson ואוניברסיטת סטנפורד, בהתאם קפדנית למדריך של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. בניית MCA
<ol><li>מבנה תא 1 עם הממדים הבאים: 125 מ"מ x 125 מ"מ x 125 מ"מ (רוחב x עומק x גובה) מתוך אקריליק לבן אטום בעובי 3 מ"מ המשמש לדפנות, לרצפה, לתקרה. השתמשו באקריליק שקוף בעובי 3 מ"מ לקיר הפונה לחזית. הדביקו את כל הצדדים יחד זמן רב מראש באמצעות דבק אקרילי ייעודי. אזהרה: דבק אקרילי נחשב לחומר מסוכן (דליק, אדים מזיקים, עלולים להזיק אם נבלעים, עלולים לגרות את העור או העיניים). יש להשתמש בדבקים כאלה רק בהתאם להוראות היצרן (כלומר, עם PPE מתאים באזור מאוורר היטב).</li>
	<li>חברו את המכסה של תא 1 עם ציר, כך שניתן יהיה להכניס את העכברים בקלות לתוכם ולשלוף אותם מהתא. חברו סרט דיודה פולט אור (LED) הדבקה עצמית למשטח הפנימי של המכסה כדי לספק תאורה של כ-4800 לוקס.</li>
	<li>סגור את תא 1 משאר ה- MCA על ידי החלקת יריעת אקריליק אטומה לתוך ומחוץ למקומה.</li>
	<li>בנה את תא הבדיקה של MCA, תא 2, כתא לא מואר באורך 270 מ"מ המיוצר מאקריל אדום כהה שקוף (בעובי 3 מ"מ) מכל הצדדים, עם מכסה צירי למעלה. הניחו רשת של 13 על 31 של חורים בקוטר 2 מ"מ על רצפת תא 2 שדרכה ניתן לבלוט מערך של בדיקות קהות עם קצוות בקוטר 0.5 מ"מ (למשל, סיכות מפה קהות). הערה: סיכות קהות עם בלוק נייר זכוכית של 120 חצץ או דומה. נקו אותם במים חמים עם חומר ניקוי לפני שהם מחוטאים בחומר חיטוי ספוריצידלי.</li>
	<li>התאימו את גובה הגשושיות על ידי הצבת יריעות אקריליות נוספות מתחת ללוח הבסיס של הגשושית (איור 1). באמצעות גישה זו, להגדיר את המכשיר עם שלוש הגדרות: 0 מ"מ, 2 מ"מ, ו 5 מ"מ גובה בדיקה.</li>
	<li>כחלופה לסיכות מפה קהות או חומרים דומים, השתמש בקבצי המדפסת התלת-ממדית כדי להדפיס את רצפת תא 2 ואת לוחית הבדיקה (ראה קובץ משלים 1: SpikeBed-MCA.stl המתייחס לבדיקות המכניות, וקובץ משלים 2: MCA_baseplate.stl המהווה את רצפת תא 2). הערה: אם הדפסה תלת-ממדית אינה זמינה, הדביקו סיכות מפה ליריעה אקרילית באמצעות אותו דבק אקרילי המשמש לבניית דפנות המכשיר.</li>
	<li>הדפס עם חומר רחיץ וניתן להתאמה ביולוגית, כגון ניילון 12 פלסטיק או דומה (מומלץ).</li>
	<li>מבנה תא 3 עם הממדים הבאים: 125 מ"מ x 125 מ"מ x 125 מ"מ כקופסת אקריליק אדומה כהה שקופה לא מוארת (מכל הצדדים), הממוקמת בקצה הנגדי לחדר 1. מניחים מכסה ציר על החדר, בדומה לתאים 1 ו-2. תא זה משמש כאזור מילוט חשוך מהגשושיות המכניות בתא 2.</li>
</ol>2. הרגלה ובדיקה של MCA בעכבר
<ol><li>כמו בכל הניסויים הכוללים תוצאות התנהגותיות בבעלי חיים, הקפידו על אקראיות וסנוור מתאימים לאורך כל הדרך כדי למזער את ההטיה הפוטנציאלית. הערה: התוצאות הייצוגיות נוצרו על ידי שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים ונקבות בני 8-12 שבועות (מספר הזן של מעבדות ג'קסון 000664). העכברים שוכנו חברתית, עד 5 לכל כלוב, עם גישה למזון ולמים ad libitum ומחזור אור של 07:00 שעות עד 19:00 שעות. MCA התקיים בתקופת האור, בין השעות 09:00 ל-12:00.</li>
	<li>יום אחד לפני הבדיקה הבסיסית המתוכננת, התאקלמו בעכברים ליחידת ה-MCA למשך 5 דקות (מינימום) עד 15 דקות (מקסימום) עם בני זוגם בכלוב כדי להקל על החקירה החברתית של המכשיר כולו.</li>
	<li>לאורך כל התהליך, יש לוודא כי נוריות ה-LED בתא 1 כבויות, המחסום בין תאים 1 ו-2 נותר פתוח, והגששים מוגדרים לגובה של אפס (כלומר, לא בולטים דרך רצפת תא 2).</li>
	<li>בצע בדיקה בסיסית של עכברים (אופציונלי) אם המחקר משלב חיות בקרה שליליות (כלומר, ניתוח בושה או בקרות הזרקה לרכב). אם תרצה בכך, השתמש במבחן בסיסי כדי לא לכלול חריגות שלא טופלו שלעולם אינן חוצות לתא 2, אם כי זה לא הוכח כהכרחי. אם נעשה בהם שימוש, דווח על כל הקריטריונים להחרגה ועל מספר העכברים שאינם נכללים.<ol>
<li>לפני תחילת הבדיקה, הגדר מצלמת וידאו המסוגלת להקליט קטעי וידאו של 1080p על חצובה עם מבט הצידה של כל מכשיר ה- MCA. התאם את שדה הראייה כך שה- MCA ימלא את התמונה המוקלטת.</li>
		<li>לאחר תחילת ההקלטה, החזק לוח מחיקה יבש כף יד בשדה הראייה של המצלמה כדי לתייג את תחילת הסרטון עם מידע מזהה על ריצת הניסוי של החיה (למשל, מזהה עכבר, גובה בדיקה, תאריך, נקודת זמן וכו ').</li>
		<li>עבור הריצה הראשונה, הגדר את גובה הגשושית לאפס. העבירו את העכבר לבדיקה מהכלוב הביתי שלו לתא 1 עם דלת המחסום במקומה. הפעל טיימר הנראה בצילומים המוקלטים. הערה: הטיימר מבטיח שהמרווחים בין החלקים השונים של הבדיקה יהיו עקביים בין הריצות.</li>
		<li>לאחר 10 שניות, הפעל את התא 1 נוריות. לאחר שהעכבר נמצא בתא המואר במשך 20 שניות, משכו את המחסום בין התאים 1 ו-2.</li>
		<li>התבונן בבעל החיים במשך 2 דקות. מדוד את העיכובים ו/או זמני השהייה באמצעות שעון עצר בזמן שהבדיקה נמשכת. לחלופין, ניתן לנתח את קטעי הווידאו לאחר השלמת הבדיקה. הערה: מסיבות של תפוקה והימנעות מחשיפה ממושכת לגירויים מרתיעים, הניתוק נקבע על 2 דקות.</li>
		<li>מדוד אחת או יותר מכמה תוצאות שימושיות שזוהו (ראה להלן; איור 1). מומלץ לנתח את כל 5 מדדי התוצאה בעת תחילת הבדיקה, על מנת לוודא אילו היבטים של התנהגות שונים במערך ניסוי נתון.<ol>
<li>אפשרות I: הקלט את ההשהיה לערך הראשון לתא 2. אפשרות II: הקלט את ההשהיה כדי לחצות יותר ממחצית הדרך על פני תא 2. אפשרות ג': רשום את זמן השהייה הכולל בתא 2. אפשרות IV: הקלט את ההשהיה כדי להגיע לתא 3 (בריחה). אפשרות V: בדומה לאפשרות II, רשמו את זמן השהייה הכולל בכל תא תוך 2 דקות והמירו אותם לפרופורציות. הערה: מכיוון שכל ניסוי הוא ייחודי ועשוי להיות מושפע מגורמים ביולוגיים ומשינויים התנהגותיים הייחודיים למודל המחלה, חוקרים יכולים להתנסות במדדים אלה ואחרים בידיהם.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר השלמת הבדיקה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו, נקו את תאי ה-MCA עם 70% אתנול ואפשרו לו להתייבש לחלוטין. הערה: בדרך כלל ניתן לנקות בולי צואה מהתא בקלות יחסית עם מגבות נייר לפני אתנול / חומר חיטוי. אם יש צורך בניקוי יסודי יותר, ניתן לפרק את התאים 2 ו-3 ולשקוע במי סבון חמים.</li>
		<li>לאחר הפעלת כל העכברים בקבוצה כאשר גובה הבדיקה מוגדר לאפס, הכנס יריעה של 3 מ"מ של אקריליק מתחת ללוח הבסיס של הבדיקה המכנית וחזור על שלבים 2.4.2 עד 2.4.7 עם גובה בדיקה של 2 מ"מ.</li>
		<li>לאחר הפעלת כל העכברים עם גובה הבדיקה מוגדר ל -2 מ"מ, הכנס יריעה שנייה של 3 מ"מ של אקריליק מתחת ללוח הבסיס של הבדיקה וחזור על צעדים 2.4.2 עד 2.4.7 עם גובה בדיקה של 5 מ"מ. הערה: ניתן לבדוק קבוצה של 8 עכברים תוך כ-2 שעות באמצעות גישה זו. השתמש בגדלים של קבוצות קטנות יותר אם נדרש תזמון מדויק יותר לאחר התרופה (למשל, לניסוי קורס בזמן סמים).</li>
		<li>בצעו ניקוי סופי עם חומר חיטוי בסוף בדיקת הבדיקה.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקה חוזרת לאחר גרימת רגישות יתר לכאב ו/או עם טיפול תרופתי.</li>
	<li>השווה את הביצועים של כל עכבר בנקודת ההתחלה לביצועים שלו לאחר ההשריה של הכאב. להעריך את ההשפעה של התערבות פרמקולוגית על ידי השוואת בעלי חיים שטופלו ברכב עם בעלי חיים שטופלו בתרופות באותה נקודת זמן.</li>
	<li>בצע ניתוח סטטיסטי לא פרמטרי (לדוגמה, מבחן Mann Whitney U) אם בעלי חיים מגיעים לניתוק של 2 דקות מבלי לספק את מדד התוצאה הרצוי, וכתוצאה מכך נתונים לא רציפים.</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32 (1), 77-88 (1988).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Sheahan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+nerve+injury+minimally+affect+mouse+voluntary+behaviors+proposed+as+indicators+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain.</a> Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).</li>
<li>Wodarski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-centre+replication+of+suppressed+burrowing+behaviour+as+an+ethologically+relevant+pain+outcome+measure+in+the+rat%3A+a+prospective+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study.</a> Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).</li>
<li>King, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+the+tonic-aversive+state+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain.</a> Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).</li>
<li>Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Conflict+System%3A+A+Novel+Operant+Method+for+the+Assessment+of+Nociceptive+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior.</a> PLoS One. 11 (2), 0150164(2016).</li>
<li>Pahng, A. R., Edwards, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pain+Avoidance-Like+Behavior+in+Drug-Dependent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53(2018).</li>
<li>Odem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sham+surgeries+for+central+and+peripheral+neural+injuries+persistently+enhance+pain-avoidance+behavior+as+revealed+by+an+operant+conflict+test%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test.</a> Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+test+paradigm+to+measure+the+aversive+quality+of+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats.</a> Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+and+gabapentin+decrease+mechanical+hyperalgesia+and+escape%2Favoidance+behavior+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).</li>
<li>Vichaya, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motivational+changes+that+develop+in+a+mouse+model+of+inflammation-induced+depression+are+independent+of+indoleamine+2%2C3+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase.</a> Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).</li>
<li>Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+light-dark+paradigm%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The mouse light-dark paradigm: a review.</a> Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).</li>
<li>Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+validation+of+voluntary+gait+and+mechanical+sensitivity+assays+associated+with+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice.</a> Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).</li>
<li>Huck, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Contribution+of+Myeloid-Lineage+TLR4+to+the+Transition+to+Chronic+Pain%3A+A+Focus+on+Sex+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences.</a> Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).</li>
<li>Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+neuropathic+pain+conditions+do+not+primarily+evoke+anxiety-like+behaviours+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice.</a> European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).</li>
<li>Sieberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain+drives+anxiety+behavior+in+mice%2C+results+consistent+with+anxiety+levels+in+diabetic+neuropathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients.</a> Pain Reports. 3 (3), 651(2018).</li>
<li>Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+and+Tonic+Spinal+Cord+Stimulation+in+the+Mechanical+Conflict-Avoidance+System%3A+Cognitive-Motivational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects.</a> Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים רלוונטיים לחשוף.

כמו בכל המבחנים ההתנהגותיים, טיפול נכון, אקראיות ועיוורון לטיפול בבעלי חיים הם חיוניים לאורך כל הדרך. בהתחשב בתשומות הרב-גורמיות להתנהגויות מורכבות ולקבלת החלטות, חובה על בעלי חיים להיות מטופלים, מורגלים ונבדקים באופן עקבי ככל האפשר תוך מזעור המצוקה. יש להקפיד גם לשחזר את תזמון מיקום העכבר בתא 1, הדלקת נורות ה-LED והסרת המחסום, שכן ההבדלים כאן עלולים להשפיע על ההתנהגות הבאה. 
יש לציין כי מדדי התוצאה השונים המתוארים באיור 1A קשורים זה בזה. לדוגמה, עכבר הנכנס לחדר 2...

כאב הוא חוויה מורכבת עם מרכיבים חושיים ורגשיים. הפחתה בסף תפיסת הכאב ורגישות יתר לגירויים תרמיים ו/או מכניים הם מאפיינים מרכזיים של חוויה זו, שמבחני התנהגות כאב מעוררי גירוי יכולים ללכוד (כמו מבחן רגישות החום של Hargreaves ומבחן פון פריי של רגישות מכנית)1,2. למרות שמבחנים כאלה נותנים תוצאות חזקות וניתנות לשחזור, הם מוגבלים על ידי הסתמכותם על נסיגה רפלקסיבית מגירוי מרושע נתפס. זה הטיל ספק בהסתמכות מתמשכת של מחקרי כאב על בדיקות אלה בלבד. לשם כך, חוקרי כאב בוחנים כבר מספר שנים מבחנים התנהגותיים חלופיים/משלימים לשימוש במודלים של כאב מכרסמים במאמץ ללכוד יותר מהמרכיבים הרגשיים ו/או המוטיבציוניים של הכאב. אמצעים לא מעוררים, רצוניים או לא רפלקסיביים אלה (למשל, ריצת גלגלים, פעילות מחילה, העדפת מקום מותנית 3,4,5) מיושמים בניסיון לשפר את יכולת התרגום של מחקר כאב פרה-קליני.
הבדיקה למניעת קונפליקט מכני (MCA) תוארה במקור על ידי Harte et al. בשנת 20166, משמשת בעיקר בחולדות 7,8, ומייצגת שינוי של גישה קודמת - פרדיגמת ההימנעות ממקום בריחה. בגישה זו, גירוי מזיק של הכפה האחורית מבוצע בתא רצוי (כהה) אחרת כדי להניע התנהגות תכליתית של החיה כדי לברוח / למנוע גירוי כזה 9,10. במקום להסתמך על גירוי ידני של הכפה האחורית על ידי משקיף, מבחן ה-MCA מאלץ את העכברים לנהל משא ומתן על גירוי שעלול להיות מזיק כדי להימלט מסביבה מרתיעה ולהגיע לתא החשוך. הקונפליקט/ההימנעות שמעניקים לבדיקה את שמה נובעת משני המניעים המתחרים הללו: לברוח מאזורים מוארים היטב ולהימנע מגירוי מרושע של כפות הרגליים. בדיקת MCA גם חולקת תכונות עם בדיקות העדפת מקום מותנות, שבהן השילוב של שיכוך כאבים עם רמזים סביבתיים מניע שינויים בהתנהגות המשקפים העדפה להקשר משכך הכאבים/מתגמל11.
ביסודו של דבר, כל המבחנים הללו חולקים גישה דומה: שימוש בשינוי בהעדפתו של בעל חיים לסביבה מרתיעה אחת על פני אחרת כאינדיקטור למצב הרגשי/מוטיבציוני שלהם. מבחן MCA הוא פרדיגמה של 3 תאים המורכבת מתא מואר בהיר ואחריו תא אמצעי כהה עם בדיקות גובה מתכווננות ותא שלישי כהה ללא כל גירויים מרתיעים. עכבר לא מרוסן הוא בדרך כלל מוטיבציה לברוח לחדר חשוך, בהתחשב בסלידה המולדת של מכרסמים מאור בהיר12. בדוגמה זו, המוטיבציה הטבעית לברוח מסביבה מוארת בבהירות מתגברת על חוסר ההתאמה להיתקל בגירוי כפות אחוריות (בדיקות הגובה המתכווננות), המתרחש אך ורק בסביבה החשוכה. לעומת זאת, עכבר החווה כאב (עקב דלקת או נוירופתיה, למשל) עשוי לבחור לבלות זמן רב יותר בסביבה המוארת, שכן יש מוטיבציה להימנע מחוויית המישוש הלא נעימה של הגשושיות המכניות בהגדרת רגישות יתר מתמשכת למישוש.
מאמר זה מתאר גרסה שונה של בדיקת MCA. התאמנו את השיטה המקורית (שבוצעה בחולדות6) לשימוש בעכברים. כמו כן, הפחתנו את מספר גבהי הגשושית שנבדקו משישה לשלושה (0, 2 ו-5 מ"מ מעל גובה הרצפה) על מנת לייעל את איסוף הנתונים. גישה זו נבדקה על פני מודלים רבים של כאב, ואומתה באמצעות משככי כאבים ידועים, מה שמצביע על כך שרגישות יתר לכאב ו/או השינויים הרגשיים והמוטיבציוניים הנלווים מניעים שינויים אלה בהתנהגות. גישה זו מהירה יחסית לניצוח וניתנת להתאמה בהשוואה לאמצעים אחרים שאינם רפלקסיביים, שיכולים לקחת ימים רבים של הרגלה ואימון 1,2. בשילוב עם מדדים אחרים של כאב, MCA יכול לייצר תובנות חשובות על ההיבטים הרגשיים והמוטיבציוניים של הכאב.

<table><tbody><tr><td>32.8ft 3000K-6000K נורות LED לבנות מתכווננות, נורות קלטת LED סופר בהירות הניתנות לעמעום עם 600 SMD 2835 נוריות</td><td>Lepro</td><td>מק"ט: 410087-DWW-US</td><td>לתא תאורה 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html</td></tr><tr><td>'מיטת דוקרן' מודפסת בתלת מימד ו'תא 2 קומה'</td> <td>Shapeways</td><td>N/A</td><td>אופציונלי, לבדיקות מכניות כחלופה לסיכות מפה קהות.</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>N</td><td>/A</td> שונים <td>לניקוי MCA בין עכברים.</td></tr><tr><td>ציר אקרילי 2</td><td>TAP פלסטיק</td><td>N/A</td><td>לחיבור מכסי תא לקירות האחוריים. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122</td></tr><tr><td>יריעת אקריליק יצוקה של Chemcast, פלסטיק שקוף</td><td>TAP</td><td></td><td>בעובי 3 מ"מ. לקיר הקדמי של תא 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510</td></tr><tr><td>Chemcast יצוק אקריליק בצבע שקוף, שקוף אדום כהה - 50%</td> <td>פלסטיק TAP</td><td>בעובי 3</td><td>מ"מ. 50% העברת אור. לקירות ומכסים של תאים 2 ו -3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519</td></tr><tr><td>Chemcast שקוף & אקריליק יצוק בצבע אטום, שלט לבן אטום - 0.1%</td> <td>פלסטיק TAP</td><td></td><td>בעובי 3 מ"מ. לקירות צד ומכסה תא 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341</td></tr><tr><td>חומר חיטוי (למשל קווטלי קוואט)</td><td>מעבדות מחקר פרמקליות, בע"מ</td><td>65020F</td><td>לחיטוי MCA בסוף מפגש בדיקה.</td></tr><tr><td>מחיקה יבשה של טושים ולוח</td><td>N/A</td><td>שונים</td><td>כדי להוסיף מידע ניסיוני לתחילת קטעי הווידאו.</td></tr><tr><td>סיכות מפה</td><td>שונות</td><td>N/A</td><td>אופציונלי, לבדיקות מכניות. השתמש בנייר זכוכית כדי להקהות נקודות חדות לפני השימוש. ניתן להשתמש במקום חלקים מודפסים בתלת מימד.</td></tr><tr><td>מגבות נייר</td><td>שונות</td><td>N/A</td><td>לניקוי/חיטוי MCA.</td></tr><tr><td>SCIGRIP Weld-On #3 אקריליק צמנט</td><td>TAP פלסטיק</td><td>N/A</td><td>להרכבת יריעות אקריליות לתאים והדבקת צירים. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131</td></tr><tr><td>שעון עצר</td><td>שונים</td><td>N/A</td><td>להקלטת זמני שהייה / זמני שהייה בזמן אמת או מווידאו מוקלט.</td></tr><tr><td>טיימר</td><td>שונים</td><td>N/A</td><td>כדי להבטיח הפעלת LED, הסרת מחסום והשלמת הבדיקה מתוזמנים באופן עקבי.</td></tr><tr><td>מצלמת וידאו</td><td>שונות</td><td>HDRCX405 מצלמת וידיאו Handycam</td><td>כדי להקליט את התנהגות העכבר במכשיר MCA. ניתן להחליף בכל מצלמת וידאו ברמה צרכנית המסוגלת לרזולוציית 1080p.</td></tr><tr><td>חצובה</td><td>Famall</td><td>N/A</td><td>כל חצובה שיכולה להחזיק את המצלמה בגובה הספסל להקלטת קטעי MCA מקובלת.</td></tr></tbody></table>

בדיקת הימנעות מקונפליקט מכני למדידת התנהגות כאב בעכברים

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

הכאב מורכב הן מממדים חושיים (nociceptive) והן מממדים רגשיים (לא נעימים). במודלים פרה-קליניים, כאב הוערך באופן מסורתי באמצעות מבחנים רפלקסיביים המאפשרים מסקנות לגבי המרכיב הנוציפטי של הכאב, אך מספקים מידע מועט על המרכיב הרגשי או המוטיבציוני של הכאב. פיתוח מבחנים הלוכדים את מרכיבי הכאב הללו הם אפוא חשובים מבחינה תרגומית. לפיכך, חוקרים צריכים להשתמש במבחנים התנהגותיים לא רפלקסיביים כדי לחקור את תפיסת הכאב ברמה זו. הימנעות מקונפליקט מכני (MCA) היא בדיקת התנהגות לא רפלקסיבית מרצון מבוססת, לחקר תגובות מוטיבציה לגירוי מכני רעיל בפרדיגמה של 3 תאים. שינוי בהעדפת המיקום של העכבר, כאשר הוא מתמודד עם גירויים רעילים מתחרים, משמש כדי להסיק את אי הנעימות הנתפסת של אור בהיר לעומת גירוי מישושי של כפות הרגליים. פרוטוקול זה מתווה גרסה שונה של בדיקת MCA שבה חוקרי כאב יכולים להשתמש כדי להבין תגובות רגשיות-מוטיבציוניות במגוון מודלים של כאב עכברים. אף על פי שלא תוארו כאן באופן ספציפי, נתוני ה-MCA לדוגמה שלנו משתמשים באדג'ובנט התוך-פלנטרי השלם של פרוינד (CFA), בפגיעה עצבית שנחסכה (SNI) ובמודל שבר/יציקה כמודלים של כאב כדי להמחיש את הליך ה-MCA.

בדיקת MCA שימשה בהצלחה עם מספר מודלים של כאב עכברים שונים מבחינה מכניסטית. איור 2 מציג נתונים שבהם מדד התוצאה של הבחירה היה חציית נקודת האמצע של תא 2 (איור 2A). הנתונים המתקבלים על ידי שימוש בנקודת אמצע הדרך לעומת הבריחה לחדר 3 דומים מאוד, ~ 40 שניות למחצית הדרך לעומת ~ 45 שניות לבריחת תא 3 במודל פגיעה עצבית (SNI) של כאב נוירופתי עם גובה בדיקה 5 מ"מ13.
במודל הכאב הדלקתי המושרה על-ידי CFA, הזרקת כפה אחורית מבוקר...

הבדיקה המכנית למניעת קונפליקטים משמשת כקריאה לא רפלקסיבית של רגישות לכאב בעכברים, שבה ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר תגובות רגשיות-מוטיבציוניות במגוון מודלים של כאב עכברים.

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות על מצב יעיל או מוטיבציה של בעלי חיים בתנאי כאב שונים. זהו צעד חשוב בשיפור התרגום של המחקר הפרה-קליני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה וקלה יחסית לביצוע, אך עדיין מעריכה מניעים מורכבים המשפיעים על התנהגות הקשורה לכאב.התחילו בבניית הדפנות, הרצפה והתקרה של החדר הראשון באמצעות אקריליק לבן אטום בעובי שלושה מילימטרים. עבור הקיר הפונה לחזית, השתמש באקריליק שקוף בעובי שלושה מילימטרים. חברו את המכסה של החדר עם ציר, כך שניתן יהיה להכניס עכברים בקלות לתוכה ולאחזר אותם מהתא.לאחר מכן חברו סרט דיודה פולט אור דבק עצמי למשטח הפנימי של המכסה כדי לספק תאורה של כ-4, 800 לוקס. החלק יריעת אקריליק אטומה לתוך ומחוץ למקומה כדי לסגור את תא אחד משאר מכשיר ה- MCA. לאחר מכן, בנו תא לא מואר באורך 270 מ"מ, תא הבדיקה MCA, תוך שימוש באקריליק אדום כהה שקוף מכל הצדדים עם מכסה צירי למעלה.לאחר מכן מניחים רשת בגודל 13 על 31 עם שני חורים מילימטרים על רצפת התא שדרכם יכול לבלוט מערך של בדיקות קהות עם קצוות בקוטר 0.5 מילימטר. התאימו את גובה הגשושיות על ידי הצבת יריעות אקריליות נוספות מתחת ללוח הבסיס של הגשושית. באמצעות גישה זו, הגדר את המכשיר בגבהי בדיקה אפס, שניים וחמישה מילימטרים.כחלופה לסיכות מפה קהות או חומרים דומים, השתמש בקבצי המדפסת התלת-ממדית כדי להדפיס את רצפת החדר השני ואת לוחית הבדיקה עם חומר רחיץ וניתן להתאמה ביולוגית כגון ניילון 12 פלסטיק. לבסוף, בנו תא כהה שלושה באמצעות אקריליק אדום כהה שקוף מכל הצדדים עם מכסה ציר הדומה לתאים אחד ושניים. הניחו אותו בקצה הנגדי של תא אחד כדי שישמש כאזור מילוט חשוך מהגשושיות המכניות בתא השני.יום אחד לפני תזמון הבדיקה הבסיסית, התאקלמו בעכברים ליחידת ה-MCA למשך 5 עד 15 דקות עם חבריהם לכלוב כדי להקל על חקירה חברתית של המכשיר כולו. יש לוודא כי נוריות ה- LED בתא אחד כבויות, המחסום בין תאים אחד ושניים נשאר פתוח והגששים אינם בולטים דרך רצפת התא השני. לאחר מכן, הגדר מצלמת וידאו המסוגלת להקליט קטעי וידאו של 1080 פיקסלים על חצובה עם מבט פונה הצידה של כל מכשיר ה- MCA.התאם את שדה הראייה כך שה- MCA ימלא את התמונה המוקלטת. לאחר תחילת ההקלטה, החזיקו לוח מחיק יבש כף יד בתצוגת השדה של המצלמה כדי לתייג את תחילת הסרטון במידע מזהה על ריצת הניסוי של החיה. בהפעלה הראשונה, הגדר את גובה הגשושית לאפס והעביר את העכבר לבדיקה מהכלוב הביתי שלו לתא אחד עם דלת המחסום במקומה.הפעילו טיימר שנראה לעין בקטעים המוקלטים. לאחר 10 שניות, הפעל את התא נוריות LED אחד. לאחר שהעכבר נמצא בתא המואר במשך 20 שניות, משכו את המחסום בין תאים אחד ושניים.התבוננו בבעל החיים במשך שתי דקות ומדדו את העיכובים או את זמני השהייה באמצעות שעון עצר בזמן שהבדיקה נמשכת. רשמו את ההשהיה לכניסה הראשונה לתא השני, את ההשהיה לחצות יותר ממחצית הדרך על פני תא שני, את זמן השהייה הכולל בתא השני, את ההשהיה כדי להגיע לתא השלישי ואת זמן השהייה הכולל בכל תא תוך שתי דקות ולהמיר אותם לפרופורציות. לאחר השלמת הבדיקה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.נקו את תאי ה-MCA עם 70% אתנול ואפשרו לו להתייבש לחלוטין. לאחר הרצת כל העכברים בקבוצה כאשר גובה הבדיקה נקבע לאפס, הכנס יריעה של שלושה מילימטרים של אקריליק מתחת ללוחית הבסיס של הגשושית המכנית וחזור על הריצה עם גובה בדיקה של שני מילימטרים. לאחר הפעלת כל העכברים עם גובה הגשושית המוגדר לשני מילימטרים, הכניסו עוד יריעת אקריליק של שלושה מילימטרים מתחת ללוח הבסיס של הגשושית וחזור על הריצה עם גובה בדיקה של חמישה מילימטרים.בצעו ניקוי סופי עם חומר חיטוי בסוף הבדיקה. במודל הכאב הדלקתי השלם של פרוינד המושרה על ידי אדג'ובנט, הזרקה מלוחה אינה משנה את חביון הבריחה בהשוואה לנקודת ההתחלה. עכברים שהוזרק להם האדג'ובנט הראו עלייה משמעותית בהשהיית מילוט ארבעה ימים לאחר ההזרקה, אך רק כאשר גובה הגשושית הועלה לחמישה מילימטרים.ההשהיה המוגברת הזו לא נראתה בעכברים שקיבלו קרפרופן 90 דקות לפני תחילת הבדיקה. מודל הפגיעה העצבית שנחסך של כאב נוירופתי הגדיל משמעותית את ההשהיה כדי לברוח לעומת קו הבסיס כאשר גובה הבדיקה נקבע לחמישה מילימטרים. עלייה זו נמנעה על ידי מתן של בופרנורפין משכך כאבים אופיואידי 90 דקות לפני הבדיקה.חביון מילוט מוגבר נצפה גם בעכברים שלא עברו סבב בסיסי של בדיקות MCA לפני פגיעה עצבית. ההשהיה המוגברת של הבריחה בעכברים שנחסכו מפגיעה עצבית בחמישה מילימטרים נמנעה על ידי גאבאפנטין שניתן 90 דקות לפני הבדיקה. במודל השבר או היציקה, ההשהיה לברוח מתא אחד עלתה באופן פרופורציונלי לגובה הגשושית לפני הפציעה.לאחר הפציעה, ההשהיה נותרה ללא שינוי ברמה של אפס מילימטרים, אך עלתה משמעותית בגובה הגשושית של שני מילימטר וחמישה מילימטרים לזכרים ובגובה הגשושית חמישה מילימטרים לנקבות בהשוואה לקו הבסיס. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא לוודא שכל העכברים מורגלים למכשיר MCA, ולשמור על אקראיות וסנוור נאותים לאורך כל המחקר. ניתן להשתמש בשיטה זו לצד מדדים אחרים של רגישות לכאב, כולל פון פריי או העדפת מקום מותנית.

mechanical-conflict-avoidance-assay-to-measure-pain-behavior-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

אנו מתארים פרוטוקול לבחון את התפתחותם של hyperalgesia מושרה אופיואידים וסובלנות בעכברים. המבוסס על המדידה של תגובות nociceptive תרמיים ומכאניות של בעלי חיים תמימים וטופל במורפיום, היא מאפשרת לכמת את העלייה ברגישות לכאב (hyperalgesia) ולהפחית בכאבים (סובלנות) הקשורים לממשל אופיום כרוני.

הערכה של סובלנות hyperalgesia ומשככי כאבים הנגרם מורפיום בעכברים באמצעות שיטות nociceptive תרמיים ומכאניות

אוסטיאוארתריטיס (OA), או מחלת מפרקים ניוונית, הוא מצב מתישה הקשורים כאב נשאר רק מבוקרת חלקית משככי כאבים זמינים. במודלים של בעלי חיים מפותחים כדי לשפר את ההבנה שלנו של מנגנוני הכאב הקשורות OA. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה מודל monoiodoacetate כאב OA בתוך העכבר.

מודל Monoiodoacetate של אוסטיאוארתריטיס כאב העכבר

במאמר זה אנו מספקים פרטים עבור שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון רקומביננטי פיוז'ן IL4-10. אנו גם מראים כיצד לבחון את היעילות של חלבון זה כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאבים דלקתיים.

פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני

בדרך כלל, מודל הזרקת הצוואר של העכבר משמש להערכת התנהגויות שריטות הנובעות מהפרוריטוגן. עם זאת, המודל מספק מידע רק על גירוד, לא כאב. כאן, מודל הזרקת הלחי הוא הציג בעכברים אשר ניתן להשתמש בו זמנית למדוד כאב והתנהגויות הקשורות בגירוד.

הזרקת הלחי מודל עבור מדידה בו של כאב התנהגויות הקשורות בגירוד

יש פיתח מדד עורר של כאבי מפרקים ואנו יחד זה עם שיטה סטנדרטית למדידת ספונטנית קוץ מאתר מודלים שונים של דלקת מפרקים כימית המושרה. אמצעים אלה הם רגישים לשחזור עבור סוגים שונים של כאבי פרקים.

אמצעי ספונטנית עורר הכאב במודלים מאתר של כאבי ברכיים Monoarticular

כדי לפתח התערבויות טיפוליות חדשניות למניעה וניהול של כאבי גב, נדרשים מודלים של בעלי חיים לבחון את המנגנונים והיעילות של טיפולים אלה מנקודת מבט תרגומית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בדיקת BMS, שיטה סטנדרטית להערכת רגישות מכנית אחורית בחולדה.

הערכת רגישות מכנית של הגב בחולדה לחקירה מכניסטית של כאבי גב כרוניים

שיטות להשראת מודל כאב גב פשוטה ומהירה בעכברים ניתנות כאן באמצעות הזרקה תוך רצועה של מפעיל פלסמינוגן בשתן.

מודל כאב גב עכבר הנגרם על ידי מפעיל אורוקינאז

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של רגישות יתר מכנית במודל חולדה של כאב אורופציאלי נוירופתי באמצעות מכשיר הערכת כאב אורופציאלי מבוסס אופרנט.

הערכה של רגישות יתר מכנית הנגרמת על ידי פגיעה עצבית בחולדות באמצעות בדיקת כאב אופרנטית אורופציאלית

כאן, אנו מציגים מודל כאב דלקתי שונה עם הזרקת קרגינן שתי כפות אחוריות כדי להעריך את אפקט משכך הכאבים.

מודל כאב דלקתי שונה כדי ללמוד את אפקט משכך כאבים בעכברים

הפרוטוקול מתאר כיצד למדוד היפרלגזיה בברך בעכברים. אנו מראים דוגמאות במודלים של עכברים לכאבי ברכיים חריפים כמו גם במודלים של דלקת מפרקים ניוונית (OA).

הערכת היפרלגזיה בברך בעכברים באמצעות מדידת יישום לחץ

למדו את שיטת בדיקת ההימנעות מקונפליקט מכני למדידת רגישות לכאב בעכברים. שיטה זו מעריכה מוטיבציות מורכבות המשפיעות על התנהגות הקשורה לכאב ומסייעת בשיפור התרגום של מחקר טרום-קליני.

בדיקת הימנעות מקונפליקט מכני למדידת התנהגות כאב בעכברים

גלה סרטונים נוספים