ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה

באמצעות שיטת ציטומטריה של זרימת כמות זו חוקרים יכולים לחשב את המנהגים הקינטיים ושיווי המשקל של אינטראקציה עם ממברנה ולהעריך את מספר החלבון המובא על ידי אתרים על ממברנת PPH. היתרונות של שיטה זו הם הפשטות והזמינות של ריאגנטים וציוד. שיטה זו מיועדת אך ורק למחקר בסיסי.

הפרוטוקול פותח כדי לחקור אינטראקציות של שומנים בחלבונים בחישוב הדם, וניתן להשתמש בו באזורים אחרים כדי לאפיין את האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות שומנים שונות. השיטה יכולה לשמש להערכת כמות של דינמיקת קשירת ליגנד על התאים השונים וסוגי הליגנד. התחילו את ניסויי הקשירה הקינטית על ידי דילול שלפוחיות פוספוליפידים בחיץ של טירוד לריכוז של מיקרומולר אחד ונפח כולל של 250 מיקרוליטרים.

לאחר מכן ערבבו את גורם הקרישה הפלואורסצנטי X או FX FD וריכוז של 500 ננומולרים עם שלפוחיות הפוספוליפיד ביחס של אחד לאחד כדי לקבל נפח כולל של 500 מיקרוליטרים. מיד להזריק 500 microliters של ההשעיה המעורבת לתוך ציטומטר הזרימה. בקצב זרימה עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ומסנן פליטה של 585 ננומטר;ברוחב של 42 לערוץ FL 2.

לאחר מכן למדוד את הפלואורסצנציה הממוצעת בערוץ FL 4 עם עירור ב 633 ננומטר ומסנן פליטה ב 660 ננומטר עם רוחב של 20. כאשר הרוויה של הקשירה מושגת, דיללו במהירות את הדגימה פי 20 עם החיץ של טירוד, ועקבו אחר הדיסוציאציה עד שמגיעים לפלואורסצנציה בסיסית, או מישור. עבור ניסויים קושרי שיווי משקל, דגירה של חמישה בועיות פוספוליפידים מלאכותיות מיקרומולריות עם ריכוזים משתנים של FX FD מאפס עד 1000 ננומולארים במאגר של Tyrode למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה דיללו כל דגימה פי 20 לנפח סופי של 200 מיקרוליטרים עם המאגר של טירוד ואז נתחו את הדגימה המדוללת על ידי ציטומטריית זרימה תוך 30 שניות. כדי לנתח את הנתונים, יש לייצא את הניסויים בפורמט FSC מתוכנת רכישת נתונים ציטומטריה לתוכנת ציטומטר לניתוח נתונים. על-ידי בחירת הקובץ ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיות ייצוא וקבצי FSC.

לאחר שתסיים לפתוח את קבצי FCS לתוכנת ציטומטר על-ידי בחירת הקבצים במחשב וגרירת הקבצים לסביבת העבודה של התוכנית. עבור gating microvesicles, לזהות את האזור של microvesicles על ידי פלואורסצנציה של צבע lipophilicic, DIC 16 שלוש. לאחר מכן השתמש בלחצן העלילה בגליון העבודה כדי ליצור תרשים נקודה SSC מ- FL שני D I C 16 בקואורדינטות יומן.

לאחר מכן בחר את לחצן השער המלבני כדי לצייר אזור גידור. כדי לנתח את הניסויים הקינטיים ליצור תרשים נקודה באמצעות הקואורדינטות של פלואורסצנציה לאורך זמן עבור האזור של הבועיות. לאחר מכן, ייצא את הנתונים על השינוי בפלואורסצנציה לאורך זמן בתבנית CSV;על ידי לחיצה לדוגמה וימינה על כרטיסיית הייצוא, ולאחר מכן בחירת FL ארבע פעמים בפרמטרים, בחר ספריה לשמירה לפני לחיצה על פורמט CSV בחר ולחיצה על כרטיסיית הייצוא.

לאחר ההעברה, פתח את קובץ ה- CSV בתוכנה סטטיסטית כדי לחשב את הממוצע הנע הפשוט פלואורסצנציה וזמן עבור כל 1000 אירועים בקירוב גרף של התלות של הפלואורסצנציה הממוצע הנע הבודד בזמן תחת ההנחה של תלות מעריכית והשתמש בערך כדי לחשב את קבוע הקשר הקינטי באמצעות משוואה. לאחר מכן חשב את קבוע הדיסוציאציה הקינטית באמצעות המשוואה כפי שתואר קודם לכן. כדי לנתח את תאריך בדיקת קשירת שיווי המשקל, קבעו את הפלואורסצנציה הממוצעת של FX FD באזור הבועיות עבור כל ריכוז נבחר של FX FD ולאחר מכן העריכו את התלות של הפלואורסצנציה של הגורם המאוגד מריכוז הגורם הנוסף בהנחה של קשירת אתר יחיד.

חישוב הפרמטרים המחייבים הממוצעים באמצעות משוואה משלוש חזרות בלתי תלויות לכל הפחות. המשך להכין חרוזים מכוילים על ידי דגירה של טסיות ג'ל מסוננות עם סידן IANA 4A עשרים ושלוש, מאה ושמונים ושבע בנוכחות 2.5 מילימולאר סידן כלוריד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. האם הטסיות המופעלות מוסיפות את הריכוזים השונים של FX FD ומדגירות את הטסיות עם שני נפחים אחוזי פורמלדהיד.

לאחר שעה אחת, יש להפסיק את התגובה על ידי דגירה של טסיות הדם עם שלושה גליצין טוחנים ו-5% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לטהר את התערובת מהצבע שלא שוחזר עם צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את הסופר-נייט לפני שימוש חוזר בכדור במאגר של Tyrode המכיל 0.5% BSA.

לאחר מכן, מדוד את רמת הפלואורסצנציה של חרוזי הכיול בכל דגימה באמצעות ספקטרופלואורומטר ולאחר מכן השתמש בציטומטר הזרימה. קבע את מספר החרוזים בכל דגימה בעזרת מונה תאים. המר את עוצמת הפלואורסצנציה של כל דגימת חרוזים מתאימה לריכוז של צבע פלואורסצנטי מסיס באמצעות ספקטרופלואורומטר וחשב מחדש את ריכוז הצבע הפלואורסצנטי עבור מספר מולקולות הספקטרופלואורומטר.

צור גרף תלות של הפלואורסצנציה הממוצעת של החרוזים בציטומטר זרימה על מספר מולקולות הפלורופורה עבור כל דגימה. לאחר מכן הערך את התלות לפי מידתיות קו באמצעות התאמת הניתוח והתאים לכרטיסיות ליניאריות לפי הסדר. מהקירוב במשוואה, חשב את מקדם ההמרה של הפלואורסצנציה הממוצעת לאתרים מחייבים.

מאוחר יותר לחשב את המספר הנראה לעין של אתרי הקשירה לכל שלפוחית של ריבית. הניתוח הייצוגי מראה גידור של שלפוחיות השומנים הזרחניים המלאכותיים שגודלן הוא מיקרומטר אחד בגודלו עם הצבע הפלואורסצנטי הליפופילי המשולב, צבע I C 16, השער נקבע על סמך דגימה המכילה בועיות ליפידים מלאכותיות באותו גודל ללא הצבע הפלואורסצנטי. הקינטיקה של קשירת החלבון לבועיות נותחה בשלב הראשון על ידי איסוף הדגימה ברציפות.

הנתונים שהתקבלו נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. המדידות הציטומטריות של הזרימה צריכות להתחיל בהקדם האפשרי לאחר ערבוב הפתרונות ודילול עם המאגר של טירוד. ניתן להשלים את השיטה המוצעת עם תהודת פלזמה על פני השטח לחקר אינטראקציות ממברנה מובאות שהיא רגישה מאוד עם רזולוציה זמנית טובה ואינה דורשת הבאת אספקה היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הנגישות והפשטות שלה.