מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

כאן סיפקנו פרוטוקול למדידת התוכן שאינו Heme ברקמות בעלי חיים. באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות. ה-Bathophenanthroline מבוסס Colorimetric Assay אינו דורש מיומנויות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד וניתן להתאים אותו לפורמט מיקרו-לוחית לתפוקת מדגם גבוהה יותר ויעילות עלות.

פרוטוקול זה מתאים לגילוי שינויים ברמות הברזל ברקמות במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומסי ברזל או יעילות ברזל. התחל על ידי חיתוך דגימת רקמה במשקל 10 עד 100 גרם עם להב אזמל. שקול את זה במדויק באיזון אנליטי על חתיכה קטנה של parafilm.

השתמש פינצטה פלסטיק למקם את חתיכת הרקמה בצלחת 24 באר. תן לו להתייבש על אינקובטור סטנדרטי ב 65 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לחלופין, מניחים את חתיכת הרקמה באמצעות פינצטה מקל בכוס טפלון ללא ברזל ומייבשים אותה בתנור העיכול של מיקרוגל המעבדה.

מניחים כל פיסת רקמה מיובשת על פיסת פרפורם קטנה בתוך איזון אנליטי ושוקלים אותה במדויק. מעבירים כל פיסת רקמה מיובשת לצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. מוסיפים ליטר מתערובת החומצה לצינור וסוגרים אותו.

הכן חומצה ריקה באותו אופן אלא שהרקמה מושמטת כאן. לדגור את הצינורות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות כדי לעכל את הרקמה. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר השתמש במיקרו פיפטה המצוידת בעצות פלסטיק כדי להעביר 500 מיקרוליטרים של תמצית החומצה הברורה לצינור צנטריפוגה מיקרו חדש של 1.5 מיליליטר.

הכן תגובות כרומוגן ישירות לתוך התחתון השטוח 96-well, ברור פוליסטירן מיקרו לוחות מיקרו מטופלים. טמפרטורת חדר דגירה במשך 15 דקות. מדוד ספיגת מדגם בקורא לוחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד התייחסות למים שעברו דה-יוניזציה.

קביעה של ברזל שאינו heme על ידי cuvette ו 96-well microplate מבוסס בדיקות צבעוניות מוצגות כאן. המתאם בין רמות ברזל מבוססות cuvette ומיקרו צלחת המבוססת על חצי ליטר ב -55 דגימות רקמה משחור זכר בן שישה חודשים, שישה עכברים, כולל כבד, טחול, לב, ריאות ומח עצם מוצגים כאן. המתאם הגבוה בין שתי המתודולוגיות מציין כי השיטה המבוססת על צלחת מיקרו היא חלופה חוקית לשיטה המקורית המבוססת על קובט.

לבסוף, רמות ברזל שאינן heme היו מכמתים בשיטה המבוססת על צלחת מיקרו לאחר עיכול חומצי של מדגם נגזר מאותן רקמות עם תערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית או חומצה הידרוכלורית בלבד. המתאם הגבוה מראה כי חומצה טריכלורואצטית יכולה להיפלט מעיכול החומצה. התמונה הייצוגית מציגה את רמות הברזל שאינן heme בכבד, בטחול, בלב ובלבלב של עכברי בר שחורים זכרים שישה עכברי בר ועכברי נוקאאוט hepcidin זכר על רקע גנטי שש שחור נמדד עם בדיקת צבע מבוסס Bathophenanthroline.

ההפרעה של hepcidin מוביל hemochromatosis כמו פנוטיפ תצהיר ברזל עם כבד חמור, הצטברות ברזל הלבלב והלב דלדול ברזל טחול. רמות ברזל כבדיות שאינן heme בבס ים אירופאי נקבה לנוער בעקבות אפנון ברזל ניסיוני מוצגים כאן. רמות הברזל בכבד עלו באופן מאסיבי בבעלי חיים שטופלו בברזל.

בעוד אנמיה גרמה לירידה קלה בחנויות הברזל בכבד. התמונות הייצוגיות מראות את רמות הברזל שאינן heme ב Drosophila בן חודש אחד נמדד עם בדיקת צבע מבוסס Bathophenanthroline. התוצאות מראות את תכולת הברזל שאינה heme בכל בריכה של 20 זבובים או את תכולת הברזל המשוערת של כל זבוב.

בהתחשב במשקל ממוצע של 0.64 מיליגרם לזבוב. בעת ניסיון הליך זה יש לזכור לנקות ביסודיות את כל בלאי הזכוכית ולא לאפשר לחומרי המעבדה המתכתיים לבוא במגע עם כל ריאגנט או פתרון בשל הסיכון לזיהום.