חיתוך גזע המוח השמיעתי של העוף העוברי להערכת שיפועים טונוטופיים ומיקרו-מעגלים

שיטה זו רוכשת פרוסות חיות של גזע המוח השמיעתי של התרנגולת, הכוללות שיפוע גדול יותר של אזור התדר באותה פרוסה. פרוסות אלה מתאימות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים ואנטומיים בעלי ציר טונוטופי גדול יותר. מתודולוגיה זו תסייע להבין את התפתחות המיקרו-מעגלים בגזע המוח השמיעתי.

בעוד שהאנטומיה היא ספציפית לתרנגולת, למיני עופות אחרים כמו שליו וציפורי שיר יש אנטומיה דומה. כדי להתחיל, לעקר את הביצים עם 70% אתנול לדגור אותם ב 38 מעלות צלזיוס ו 50% לחות. לאחר מכן, להגדיר את קצב מבעבע עבור ACSF כך ה- pH הוא 7.2 עד 7.4 עם osmolality בין 300 ל 310 milliosmolar לליטר.

ואז לערבב חמישה גרם של agarose ב 100 מיליליטר של dACSF. ממיסים את האגרוז לחלוטין בעזרת אמבט מים או מיקרוגל עד שהאגרוז מתחיל לבעבע. יוצקים את האגרוז המומס לתוך צלחת פטרי עד עובי של חמישה מילימטרים ושומרים על טמפרטורת החדר כדי לקבוע.

לאחר ההגדרה, אוטמים את צלחת הפטרי ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. חותכים את האגרוז לגושי תא לשימוש בזמן הנתיחה. ראשית, נקה את אזור הדיסקציה באמצעות 70% אתנול.

הדביקו את גוש האגרוז התומך או הזוויתי על מגש הוויברטום. מניחים את הביצה תחת אור בהיר ומאתרים את החלל המלא באוויר בצד הגדול או העגול יותר של הביצה, ואז מפצחים את הקליפה מעל החלל המלא באוויר וחושפים את שק הממברנה. לעשות חתך עדין בשק כדי לחשוף את המקור.

בעזרת אזמל, משכו בעדינות את הצוואר והראש מתוך הביצה. לאחר עריפת ראש, לנקות את הראש עם dACSF מצונן. החזיקו את הראש יציב ב-dACSF מצונן ובצעו חתך רוסטרוקאודלי.

מתחילים את החתך מאחורי ובין העיניים ועוקבים אחר אורך הצוואר שנקטף. להפריד את העור כדי לחשוף את הגולגולת. חותכים את הגולגולת מאחורי העין בקו האמצע לכיוון לרוחב.

חזור על הפעולה עבור שתי ההמיספרות. פורסים את החלק הרוסטרלי של הגולגולת על ידי הנחת הלהב מאחורי העיניים וביצוע חיתוך מהיר. ואז לטבול את הראש בצלחת של dACSF צונן.

באמצעות זוג מספריים קטנים, בצע חתכים בקו האמצע לרוחב באזור הקאודאלי של הגולגולת כדי להפריד את המוח מבלי לגרום נזק לרקמות. חשוף בעדינות את גזע המוח ואת המוח הקטן. לסגת את האזור הגבי של הגולגולת כולה.

הסר את גזע המוח וחשוף אותו על ידי הברשה עדינה באמצעות מברשת צבע עדינה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לנקות את גזע המוח מחיבור רקמות וכלי דם. להפריד את גזע המוח מהמוח הקטן על ידי חיתוך peduncles והסרת כלי הדם בזהירות.

לקצץ את גזע המוח של כלי דם נוספים. ראשית, מניחים את להב הוויברטום לאורך הציר האופקי. עבור פרוסות קורונליות, הדביקו את גזע המוח על מגש חיתוך בצד הרוסטרלי, תוך שמירה על הציר הרוסטרוקאודלי אנכי.

לפרוסות סגיטליות, שמרו על הציר המדיאלי הצדדי אנכי. עבור פרוסות אופקיות, הדביקו את הצד הגחוני ושמרו על ציר הגחון הגבי אנכי. כדי להשיג את המישור האופקי הסגיטלי הזוויתי החריף, הדבק את הצד הגחוני של גזע המוח כך שהציר הגבי הגחוני הוא אנכי על גוש האגרוז של משטח היפוטנוז.

הדביקו את המשטח הנגדי של גוש האגרוז הפונה למגש החיתוך ושמרו על ציר הרוסטרוקאודל במקביל לקצה הלהב. כחלופה לחיתוך ויברטום, טבלו את גזע המוח המבודד בנקודת התכה נמוכה ב-4% ב-40 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטר. לאחר שהאגרוז מתמצק, חותכים את גוש האגרוז של התא באמצעות סכין גילוח חדה.

הדביקו את גוש האגרוז על צדו הרוסטרלי תוך שמירה על הציר הרוסטרוקאודלי של גזע המוח אנכי. קח פרוסות קורונל עד אזור NM נראה. הסר את בלוק agarose מן הדבק עם להב חד.

בעזרת מחט עדינה, הניחו בעדינות 0.5 מיקרוליטרים של צבע כחול טולוידין על ה-NM כדי לזהות את הגרעינים. טען מחדש בלוק זה במגש החיתוך לקבלת פרוסות סגיטליות או אופקיות. זהה את הגרעינים ביחס לאזור המוכתם וחתך את גזע המוח.

לאחר החתך, מניחים את הפרוסות שנאספו ברצף של 200 עד 300 מיקרון בתא פרוס המכיל ACSF לשיווי משקל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. מקטעים קורונליים של רקמת גזע המוח מעובר עוף E19 עד 21 מייצגים את אזורי האיזופריות היחסיים של גרעיני גזע המוח השמיעתיים מאזור השמיעה הנמוך ביותר לאזור השמיעה של התדר האופייני הגבוה ביותר. סיבי עצב השמיעה האפרנטיים והביפורקציה של אקסונים NM היו גלויים.

גרעין זוויתי נצפה גם הוא. בקטעים רוסטרליים, גרעין האוליברי העליון ממוקם לאורך האזור הצדדי הגחוני של הפרוסה הקורונלית. בקטעים סגיטליים זוהו NM וגרעין למינריס או NL שבהם סיבי עצב השמיעה נכנסו לאשכול הנוירונים.

גרעין האוליברי העליון זוהה באזור הרוסטרולטרלי. נצפו אזורי שמיעה בתדירות אופיינית נמוכה וגבוהה מ-NM ו-NL לאורך הציר הרוסטרוקאודלי. הפרוסה המדיאלית ביותר הראתה את הצינורות האקסונליים האיפסילטרליים והקונטרלטרליים ואת נקודת הסיום של אזור השמיעה.

בפרוסות האופקיות זוהו NM ו-NL לכיוון קו האמצע, ותאי עצב התפשטו לאורך הציר המדיאלי הלטרלי. פרוסות של רקמת גזע המוח בזווית חדה ממישור אופקי הראו את גרעיני גזע המוח השמיעתיים על פני התפשטות אלכסונית גדולה. תמונות מוגדלות הראו את הציר הטונוטופי של גרעיני השמיעה לאורך הציר הרוסטרומדיאלי עד הקאודולטרלי.

ודאו שהתהליך כולו מבוצע ב-dACSF מקורר קרח המבעבע ברציפות בחמצן פחמימות. פרוטוקול זה משמש חוקרים החוקרים תכונות אנטומיות וביופיזיות של מיקרו-מעגלים מתפתחים בגזע המוח, במיוחד את הקשר בין גרעיני השמיעה העיקריים.