Name: תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: חקור תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה מקורטקס חולדות לחקר טרשת אמיוטרופית צידית. הפרוטוקול מאפשר ניתוח אותות סידן תוך-תאיים ואפיון התנהגות תאית במחלות נוירואינפלמטוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך מדע ופיתוח טכנולוגי הרפובליקה של סרביה חוזה מס '451-03-9/2021-14 / 200178, FENS - NENS חינוך והכשרה אשכול הפרויקט "קורס משולש על גליה בדלקת עצבית", ואת EC H2020 MSCA RISE מענק #778405. אנו מודים למריה אדז'יץ' ומינה פריץ' על אספקת תמונות האימונוהיסטוכימיה ולדניאלה באטאבליץ' על העזרה בכתיבת נייר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים למטרות מדעיות ובאישור הוועדה האתית של הפקולטה לביולוגיה, אוניברסיטת בלגרד (אישור מספר EK-BF-2016/08). לגבי חומר המטופל (sera עבור IgGs), הוא נאסף לבדיקה קלינית שגרתית בהסכמת המטופל מדעת בהתאם לקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצהרת הלסינקי) לניסויים בבני אדם. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של המרכז הקליני של סרביה (מס '850/6).
1. הכנת תרבית תאים ראשונית
<ol><li>בידוד רקמת המוח הערה: בידוד צריך להתבצע על קרח, באמצעות פתרונות קרים כקרח.<ol><li>השתמשו בגורים שזה עתה נולדו בני 1-3 ימים לתרבית תאי יילודים ראשונית33. הערה: עבור המחקר המוצג כאן, Sprague Dawley hSOD1G93A וחולדות לא מהונדסות שימשו. לצורך גנוטיפ, זנבות חולדות שימשו למיצוי DNA מאוחר יותר ול-PCR.</li>
		<li>מפזרים את ראשו של הגור ב-70% אתנול ומיד מפרקים אותו במהירות באמצעות מספריים.</li>
		<li>חותכים את העור באמצעות מספריים קטנים זוויתיים כדי לחשוף את הגולגולת. פתח את הגולגולת על ידי ביצוע חתך מהפורמן מגנום לכיוון המסלולים. לאחר מכן, בצע חתך קו אמצע מאונך. הוציאו את המוח מהגולגולת והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח עם מאגרי פוספט (PBS). הערה: נקו את הכלים בין גורים כדי למנוע זיהום צולב בין גורים מהונדסים לגורים שאינם מהונדסים. בידוד של קליפת המוח משאר המוח צריך להיעשות תחת סטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות קצה המלקחיים, לקרוע את הקשרים בין שתי ההמיספרות. לאחר מכן, הפרד את ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים על ידי דחיפה עדינה של חצי הכדור מהמרכז לצד.</li>
		<li>הסר את קרומי המוח על ידי קריעתם בזהירות עם מלקחיים ישרים ומעוקלים.</li>
		<li>הסר את ההיפוקמפוס על ידי צביטה עם מלקחיים מעוקלים. השליכו את ההיפוקמפוס או השתמשו בו להכנת תרבית תאים אחרת. הערה: יש לבצע צעדים נוספים מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית כדי להבטיח תנאים סטריליים.</li>
	</ol></li>
	<li>הומוגניזציה ודיסוציאציה של רקמות<ol><li>העבירו קליפת מוח אחת לצינור של 15 מ"ל מלא ב-3 מ"ל של PBS קר. מעכבים את המתלים למעלה ולמטה עם קצה של 1 מ"ל, ומשלימים 10-15 משיכות עד שהמתלה הופך הומוגני. הערה: היזהר מאוד לא לייצר בועות בתהליך זה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהשהות את הכדור ב 3 מ"ל של PBS קר על ידי pipetting אותו למעלה ולמטה עם קצה 1 מ"ל. חזור על שלב הצנטריפוגה. הערה: יש לחמם מראש את כל הפתרונות המשמשים מנקודה זו ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות את הכדור ב-2 מ"ל של ה-Modified Eagle Medium (DMEM) השלם של דולבקו, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין). העבר את ההומוגנט לצינור 2 מ"ל.</li>
		<li>מעבירים את ההומוגנט דרך 21 G ו-23 G מחטים (שלוש פעמים כל אחת) כדי ליצור השעיה של תאים בודדים. הערה: היזהר מאוד לא לייצר בועות בתהליך זה.</li>
	</ol></li>
	<li>יוצקים את תרחיף התאים שהוכן מקליפת מוח אחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ או בקבוק T25 (כאשר המשטח מטופל מראש בציפוי פוליפפטיד לצמיחת תאים דבקים) המכיל 3 מ"ל של DMEM שלם. נערו קלות את צלחת הפטרי כך שהמתלים יחולקו באופן אחיד.</li>
	<li>לגדל את התאים באינקובטור באטמוספירה לחה של 5% CO2/95% אוויר ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש להחליף את המדיום 48 שעות לאחר הבידוד ולהחליף את המדיום כל 3 ימים.</li>
	<li>כדי לקדם את צמיחת האסטרוציטים, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%, שטפו אותם עם PBS שחומם מראש כדי להסיר את תאי הגליה המחוברים באופן רופף ואת עקבות ה-FBS בתווך.<ol><li>טריפסין את השכבה הבסיסית של אסטרוציטים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין שחוממה מראש (0.25% טריפסין, 0.02% EDTA ב- PBS, מסונן סטרילי).</li>
		<li>מניחים את המנה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.</li>
		<li>בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. כאשר הם מתחילים להתנתק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM שלם.</li>
		<li>לאסוף את ההשעיה התא ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>השליכו את הסופר-נטנט והניחו מחדש את הכדור ב-1 מ"ל של מדיום שלם. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
		<li>סידור מחדש של התאים בצפיפות של 104 תאים לס"מ2 ב-5 מ"ל של DMEM שלם טרי.</li>
	</ol></li>
	<li>שנה את המדיום כל 3 ימים. כדי למזער את נוכחותם של סוגי תאי גליה אחרים, לאחר שהאסטרוציטים מגיעים למפגש של 50% ולפני כל החלפת מדיה, שטפו את התאים ב-DMEM מלא.<ol><li>שאפו את המדיום העל-טבעי עם פיפטה של 1 מ"ל ופזרו אותו בעדינות על שכבת התאים מספר פעמים. ודא שכל פני השטח של שכבת התא מכוסים במהלך שלב כביסה זה.</li>
	</ol></li>
	<li>ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80% (בדרך כלל לאחר 14 יום), חזור על הטריפסיניזציה ועל איסוף האסטרוציטים כמתואר בשלב 1.6.</li>
	<li>זרע 5 × 103 של אסטרוציטים על מכסה זכוכית עגול בקוטר 7 מ"מ המצופה בפולי-ל-ליזין (50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.</li>
	<li>כדי לקדם מיקרוגליה, לאחר שלב 1.7, אפשרו לתאי הגליה להגיע לשכבה מקבילה34. כאשר תאים מיקרוגליאליים מופיעים על גבי שכבת האסטרוציטים (לאחר 10-15 ימים, המוכרים על ידי גופם הקטן והאליפטי יותר ותהליכים קצרים יותר), נערו את צלחת הפטרי על שייקר מסלולי במשך שעתיים ב-220 סל"ד.</li>
	<li>פיזור וזריעה של תאים מיקרוגליאליים<ol><li>שטפו קלות את התאים המנותקים והמחוברים באופן רופף על ידי שאיפת המדיום הסופר-נטנטי עם קצה פיפטה של 1 מ"ל ופזרו אותו בעדינות על שכבת התאים מספר פעמים. הקפד לכסות את כל פני השטח של שכבת התא במהלך שלב שטיפה זה, לאסוף את המדיום עם התאים מנותקים, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור ב-1 מ"ל של מדיום.</li>
		<li>מעבירים את מתלה התא דרך מחט של 21 גרם כדי לקבל השעיה חד-תאית. הערה: רוב השיטות שפורסמו משתמשות בטריפסין או בפפאין כדי לנתק את הרקמה; עם זאת, 21 G מחטים יש את היתרון של מניעת עיכול יתר של תאים, המאפשר דיסוציאציה עדינה יותר.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer. זרעים 5 × 103 תאים מיקרוגליאליים על מכסה זכוכית עגול בקוטר 7 מ"מ המצופה בפולי-ל-ליזין (50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות. הערה: קשה להשיג תרבית מיקרוגליאלית טהורה על ידי טלטול, מכיוון שתאי מבשר אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים עדיין עשויים להיות נוכחים במספר משתנה בהתאם לניסיון של הנסיין. הפרוטוקול האימונוציטוכימי המשמש להערכת נוכחותן של אוכלוסיות תאים שונות בתרביות גליה תואר במקומות אחרים35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. אימונוציטוכימיה
<ol><li>שטפו את התאים המצופים על כיסויים ב-PBS, 2 x 1 דקות.</li>
	<li>תקן את התאים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף PBS 3 x 5 דקות.</li>
	<li>דגירה בתמיסת חסימה המכילה 10% סרום חמור רגיל (NDS)/1% אלבומין בסרום בקר (BSA)/0.1% Triton X-100 למשך 45 דקות ב-RT.<ol><li>הוסף 50 μL של תמיסה חוסמת לכל מכסה בקוטר 10 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן נוגדנים ראשוניים ב-1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100 בדילולים הבאים: עכבר אנטי-GFAP 1:300, עז אנטי-Iba1 1:500. לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים בלילה ב +4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף ב-PBS, 3X10 דקות</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים עם פלואורופור: חמור נגד עכבר (עירור 488 ננומטר [1:200)) או חמור נגד עז (נרגש ב 647 ננומטר [1:200)). דגירה של התאים במשך שעתיים ב-RT בחושך.</li>
	<li>לשטוף PBS, 7 x 5 דקות.</li>
	<li>דגרו על התאים עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, 1:4,000) למשך 10 דקות ב-RT.</li>
	<li>לשטוף PBS 5 x 5 דקות.</li>
	<li>הרכב את הכיסויים על מגלשות מיקרוסקופ באמצעות פתרון הרכבה; יש להשתמש בטיפה אחת ממנו לכל כיסוי. הערה: דילולי הנוגדנים עשויים להשתנות בהתאם ליצרן. על המשתמשים לקבוע דילולים אופטימליים לניסויים שלהם.</li>
</ol>3. הדמיית וידאו בהילוך מהיר
הערה: יש להגן על תמיסות המכילות את הצבע הפלואורסצנטי מפני אור ישיר. לפני תחילת ניסוי ההדמיה, ודא שכיסוי הזכוכית אינו זז בעת הפעלת הזילוף.
<ol><li>הכנת פתרונות ותאים<ol><li>הכן תמיסה חוץ-תאית (ECS) להדמיה: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-גלוקוז ו-10 mM HEPES. התאם את ה- pH ל- 7.4. ודא שהאוסמולריות היא 280-300 mOsm/kg והכן ECS ללא Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-גלוקוז, 10 mM HEPES ו- 0.1 mM EGTA.</li>
		<li>הכן את פתרונות הבדיקה: 100 μM ATP מומס ב- ECS, 1 μM Thg ב- ECS ללא Ca2+, ו- 0.1 מ"ג / מ"ל ALS IgG ב- ECS8.</li>
		<li>העבירו כיסוי אחד לצלחת עם ECS כדי לשטוף את ה-DMEM השלם. הכן את תמיסת טעינת הצבע על ידי דילול תמיסת מלאי של 1 mM של Fluo-4 AM עם ECS לריכוז הסופי של 5 μM Fluo-4 AM.<ol><li>הנח את הכיסוי עם תאים בתמיסת טעינת הצבע למשך 30 דקות ב-RT בחושך. לשטוף את התאים ב ECS במשך 20 דקות.</li>
		</ol></li>
		<li>אם התאים אינם טעונים כראוי (כלומר, אם הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה נמוכה מדי - <5% מהטווח הדינמי של המצלמה עם זמן חשיפה גדול מ-400 אלפיות השנייה), הגדל את זמן הטעינה לעד 45 דקות עד שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, ערבבו את תמיסת המלאי Fluo-4 AM עם נפח שווה של 20% (w/v) דטרגנט (פלורוני) ב-DMSO לפני דילול ב-ECS, מה שהופך את הריכוז הפלאורוני הסופי ~ 0.02%. הערה: הדוגמאות הניסיוניות של מחקר זה בוצעו עם IgG אנושי מבודד מדם סרה של חולי ALS כפי שתואר קודם לכן 4,5,11. כל ניסוי בוצע עם דגימות IgG של חולה יחיד.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיית וידאו הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הדמיית הווידאו שולבה עם מנורת קשת קצרה של קסנון, מערכת פוליכרומטורים ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במטרה לטבול מים, גליצרין ושמן. ההדמיה בהילוך מהיר בוצעה באמצעות מערכת מצלמות דיגיטליות.<ol><li>הפעל את רכיבי מערך ההדמיה 15 דקות לפני הניסוי כדי לאפשר למערכת להגיע לטמפרטורת העבודה.</li>
		<li>הנח את הכיסוי בתא ההקלטה עם 1 מ"ל של תמיסת עבודה (ECS או ECS ללא Ca2+).</li>
		<li>כדי לבחור את פרוטוקול ההדמיה הנכון, פתח את תוכנת ההדמיה ובחלונית Acquisition בחר את זוגות המסננים עבור Fluo4-AM עם אורך גל עירור ב-480 ננומטר, מראה דיכרואית באורך 505 ננומטר ואורך גל פליטה ב-535 ננומטר.</li>
		<li>בחר את שדה הראייה תוך הקפדה על מספר עקבי של תאים לאורך כל הניסוי. כוונן את זמן החשיפה ואת רווח הגלאי כראוי, באופן שהאות אינו רווי. בחר את מצב פסאודו-צבע לרכישה. לקבלת הוראות מפורטות יותר, עיין במדריך שסופק על-ידי היצרן.</li>
		<li>התאם את קצב הדגימה ל- 1 הרץ (פריים אחד לשנייה).</li>
		<li>התחל את ההדמיה על ידי רכישת הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה למשך 3-5 דקות לקביעת קו הבסיס (F0). ודא זרימה קבועה של פתרון העבודה.</li>
		<li>עצרו את זרימת התמיסה העובדת ועברו לתמיסת הבדיקה למשך הזמן הרצוי (ראו גם סרגלי זמן בדוגמאות של איור 2 ואיור 3). בין כל תמיסת בדיקה, לשטוף את התאים עם זרימה קבועה של פתרון עובד במשך 3-5 דקות.</li>
		<li>שמור על עוצמת הקול של התמיסה בתא ההקלטה על ~1 מ"ל על-ידי סידור יניקה קבועה מראש התמיסה (ראה איור 2E). הערה: כדי להחיל את הטיפול ישירות על התאים המצולמים, מערכת אספקה מותאמת אישית העשויה מפיפטה זכוכית (קוטר פנימי של 0.8 מ"מ) הוצבה במרחק של ~ 350 מיקרומטר ו~ 1 מ"מ מעל התאים, בזווית של 45° בשילוב עם מערכת חילופי התמיסה המכילה שסתומי כיווץ ובקר שסתום אלקטרוני (ראה איור 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>הגדר אזור עניין (ROI) המתאים לתא הבודד.<ol><li>בחר את המסגרת עם עוצמת האות הגבוהה ביותר (כלומר, מהיישום של ATP) והקף תא אחד באמצעות הכלי המצולע של היישום. חזור על הפעולה עבור כל התאים בשדה הנרכש. בחר חמישה ROIs ברקע באמצעות כלי העיגול.</li>
		<li>כדי למדוד את עוצמת האות הממוצעת של תא בודד ואת הרקע עבור כל מסגרת זמן, בחר את כל ה- ROIs והשתמש בפקודה Multi Measure ב- ROI Manager ב- ImageJ או בכל פקודה מקבילה בתוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>ייצא את ערכי עוצמת האות הממוצע של ה- ROIs כגיליון אלקטרוני.</li>
	<li>ממוצע של חמישה ROI ברקע והפחת את הרקע הממוצע של כל מסגרת מעוצמת ההחזר הממוצעת על ההשקעה של המסגרת שנרכשה בו-זמנית.</li>
	<li>כדי לנרמל את הנתונים המתקבלים לאות הבסיסי, השתמש במשוואה (1): ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) כאשר F היא עוצמת האות של כל מסגרת זמן לאחר חיסור הרקע, ו- F0 הוא פלואורסצנציית Fluo-4 הבסיסית. הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקוד מותאם אישית.</li>
	<li>כדי לנתח את פעילות הסידן, קבעו מספר פרמטרים4: המשרעת של שיא הסידן (ΔF/F 0), השינוי המשולב (אינטגרל זמן, משטח מתחת לרישום התגובה) של טרנזיט הסידן (ΔF/F 0 × שניות), זמן שחלף מזמן עד שיא מתחילת הגירוי ועד למקסימום של סידן חולף (s), זמן עלייה שחלף מתחילת הגירוי לערך של ΔF/F 0 שמגיע ל-50%-80% מהמשרעת המקסימלית (s), לרוחב חצי רוחב-מלא של ארעי במשרעת חצי מקסימלית (s), תדירות התגובות אם הן חוזרות על עצמן (Hz).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

מאמר זה מציג את השיטה של גידול תאים ראשוניים ככלי מהיר ו"על התקציב" לחקר היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא (פתו) כגון ALS במודל hSOD1G93A של חולדה. לפיכך, הטכניקה מתאימה למחקרים ברמת התא הבודד שניתן לבצע אקסטרפולציה ולחקור אותם ברמת ארגון גבוהה יותר (כלומר, בפרוסות רקמה או בחיה חיה). עם זאת, להתרבות תאים כטכניקה יש כמה אזהרות. זה הכי קריטי לעשות את בידוד רקמת המוח ואת הדיסוציאציה של תאים על הקרח ולבצע את השלבים הבאים של בידוד והכנה בזמן הקצר ביותר האפשרי. זיהום הוא מכשול תמידי שניתן להתגבר עליו על ידי שימוש בצ...

טכניקות של תרביות תאים הולידו התקדמות רבה בתחומים מגוונים של נוירופיזיולוגיה תאית בבריאות ובמחלות. במיוחד, תרביות תאים ראשוניות, שבודדו זה עתה מרקמה עצבית של חיית מעבדה, מאפשרות לנסיין לחקור מקרוב את התנהגותם של תאים מגוונים במדיות ביוכימיות שונות ובמערכים פיזיולוגיים שונים. שימוש באינדיקטורים פיזיולוגיים פלואורסצנטיים שונים כגון הצבעים הרגישים ל-Ca2+ בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו בהילוך מהיר מספק תובנה טובה יותר לגבי התהליכים הביופיזיים והביוכימיים של התאים בזמן אמת.
ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית הרסנית המשפיעה על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים1. למחלה יש פתוגנזה מורכבת מהסוג המשפחתי אך בעיקר של הצורה הספורדית (90% מהמקרים)2. ידוע שמנגנונים אוטונומיים שאינם תאיים תורמים לפתופיזיולוגיה של ALS, בעיקר בשל התפקיד החיוני של תאי גליה3. ALS מאופיינת היטב גם כמחלה נוירו-דלקתית עם מעורבות של גורמים הומורליים ותאיים של דלקת.
אימונוגלובולין G נמצא בשימוש נרחב כסמן מולקולרי ב- ALS ובמחלות נוירודגנרטיביות אחרות. לימוד רמת הסרום של סמן זה יכול להצביע על נוכחות ושלב של דלקת עצבית במחלה 4,5,6, בעוד נוכחותו בנוזל המוח והשדרה יכולה להצביע על הפרה של מחסום הדם במוח7. IgGs זוהו גם כמשקעים בתאי העצב המוטוריים של חוט השדרה של חולי ALS7. עם זאת, גישה זו הראתה כמה חוסר עקביות במתאם של רמת IgGs עם השלב והמאפיינים של המחלה6.
IgG שבודד מהסרה של חולי ALS (ALS IgG) יכול לגרום לתגובת סידן באסטרוציטים נאיביים8 ושחרור גלוטמט בתאי עצב, מה שמצביע על אפקט אקסיטוטוקסי - סימן היכר של פתולוגיה של ALS9. עם זאת, מחקרים על מודל החולדות hSOD1G93A ALS (המכיל עותקים מרובים של מוטציית SOD1 האנושית 10) הראו מספר סמנים של עקה חמצונית בתאי נוירוגליה בתרבית 11, רקמות 12,13,14, או חיותחיות 13. ראוי לציין כי האסטרוציטים שגודלו בתרבית ממודל חולדות ה-ALS היו מועדים יותר לעקה חמצונית הנגרמת על-ידי חמצן מאשר האסטרוגליה של חברי המלטה שאינם מהונדסים11.
תאים מיקרוגליאליים בתרבית מושפעים מ-ALS IgG בצורה פחות נראית לעין. כלומר, קו תאים מיקרוגליאליים מסוג BV-2 הציג עלייה באות מסמנים פלואורסצנטיים של עקה חמצונית בתגובה ליישום של דגימות 4/11 בלבד של חולי ALS IgG15. ידוע כי מיקרוגליה משתתפת בפאתולוגיות נוירו-דלקתיות רבות, מה שמוסיף לעקה חמצונית ולשלב התקדמות מאוחר במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS16,17. עם זאת, הנתונים עם ALS IgGs הצביעו על כך שתאים אלה עשויים להיות לא תגובתיים כמו אסטרוציטים לגורמים הומורליים אלה של דלקת ALS. מספר מחקרים נערכו עם אסטרוציטים ראשוניים ממודלים של ALS murine, לא רק בגורים אלא גם בבעלי חיים סימפטומטיים, על המוח או על חוט השדרה 18,19,20,21. זה נכון גם לגבי תרביות ראשוניות מיקרוגליות, אם כי במידה פחותה מאשר אסטרוציטים ובעיקר מאזורי מוח בשלב העוברי22,23,24.
אנו משתמשים בהדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ על תאים בתרבית בעיקר כאמצעי לעקוב אחר מעברים תוך-תאיים של יון זה כסמן פיזיולוגי של אקסיטוטוקסיות. לפיכך, על ידי אפיון ביופיזי של ארעיות אלה (משרעת, שטח תחת חולף, זמן עלייה, תדירות) החוקר יכול לקבל פרמטרים אבחוניים ניסיוניים ממודלים תאיים מגוונים של ניוון עצבי. טכניקה זו מציעה אפוא יתרון של הערכה פיזיולוגית כמותית של IgGs כסמנים ביולוגיים של מחלות. יש גוף גדול של ספרות על התפקיד של IgGs ו Ca2 + באינדוקציה של ALS. רוב המחקרים הללו בוצעו על ידי גרימת ALS על ידי הזרקת IgGs של מטופלים לחיות ניסוי 25,26,27,28,29, אשר לאחר מכן הראו עלייה תוך תאית Ca 2+ ותצהירי IgG. שורה של מחקרים בחנו את ההשפעה של ALS IgGs על הסינפסה המוטורית במבחנה30,31,32. בהקשר הנ"ל, הטכניקה המוצגת כאן שמה את הדגש על תאי הגליה כשחקנים חשובים במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS ומכמתת את התגובה האקסיטוטוקסית הפוטנציאלית שלהם ל- IgGs כגורמים הומוריסטיים של דלקת עצבית. לגישה זו עשוי להיות יישום רחב יותר בבדיקת גורמים הומוריסטיים אחרים כגון סרה שלמה, CSF או ציטוקינים במערכות תרביות תאים שונות ובמודלים תאיים של דלקת כללית.
מאמר זה מתאר כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי, וכיצד להמשיך להשתמש בתאים אלה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של ALS עם IgG שמקורו בסרה. פרוטוקולים מפורטים עבור טעינת צבע של תאים בתרבית (איור 1) והקלטות של שינויים של Ca2+ בניסויי דימות וידאו בהילוך מהיר. דוגמאות להקלטות וידאו יראו כיצד תאי גליה מגיבים ל-ALS IgG בהשוואה ל-ATP, כשהאחרון מפעיל קולטני ממברנה פורינרגיים. מוצגת לראשונה דוגמה לאופן שבו אסטרוציטים שבודדו ממוח החולדה hSOD1G93A ALS מגיבים עם תגובת Ca 2+ בולטת יותר ל-ALS IgG בהשוואה לבקרות שאינן מהונדסות, וכיצד לקשר את התהליך הזה להבדלים בפעולת המאגר של Ca2+. כמו כן מוצגת דוגמה להדמיית סידן בתאים מיקרוגליאליים המאותגרים באופן חריף עם ALS IgG, עם תגובה צנועה בלבד של סידן תוך תאי.

<table><tbody><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>Sarstedt, גרמניה</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>צינור 2 מ"ל</td><td>Sarstedt, גרמניה</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>21 G מחט</td><td>Nipro, יפן</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>23 G מחט</td><td>Nipro, יפן</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 5 מ"ל</td><td>Nipro, יפן</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול 6 מ"מ</td><td>Menzel Glasser, גרמניה</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>ThermoFisher Sientific, ארה"ב</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>חמור-אנטי עז AlexaFluor 647 נוגדן IgG</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>חמור-אנטי עכבר AlexaFluor 488 נוגדן IgG</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 מערכת מצלמות</td><td>דיגיטליות פוטומטריות, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, ארה"ב</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Software</td><td>קוד פתוח תחת הרישיון</td><td></td><td></td>הציבורי הכללי של GNU</tr><tr><td>סט מסנני FITC</td><td>Chroma Technology Inc., ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>בדיקות מולקולריות, ארה"ב</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, ארה"ב</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, צרפת</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>מערכת החלפת פתרונות במהירות</td><td>גבוהה ALA Scientific Instruments, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Matlab</td><td>Math Works, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד GFAP</td><td>Merck Millipore, ארה"ב</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין ו Streptomycin</td><td>ThermoFisher Sientific, ארה"ב</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>קרלו ארבה ריאגנטס, ספרד</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>שייקר DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראט</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, UK</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor Imaging</td><td>System Visitron System Gmbh, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator System</td><td>Visitron System Gmbh, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView הגדרת ביצועים גבוהים</td><td>Visitron System Gmbh, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסנון מנורת קשת קצרה</td><td>Ushio, יפן</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

פרוטוקול זה מדגים כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי וכיצד להשתמש בתאים אלה לצורך חקר הפתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במודל hSOD1G93A של חולדה. ראשית, הפרוטוקול מראה כיצד לבודד ולתרבת אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות לאחר הלידה, ולאחר מכן כיצד לאפיין ולבדוק את הטוהר של תרביות אלה על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות סמן החלבון החומצי הגלי (GFAP) של אסטרוציטים וסמן המתאם הקושר סידן מיונן 1 (Iba1). בשלב הבא מתוארות שיטות להעמסת צבע (Fluo 4-AM הרגיש לסידן) של תאים בתרבית והקלטות של שינויים ב-Ca2+ בניסויי הדמיית וידאו על תאים חיים.
הדוגמאות להקלטות וידאו כוללות: (1) מקרים של Ca2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית שנחשפו באופן חריף לאימונוגלובולין G (IgG) שבודדו מחולי ALS, והראו תגובה אופיינית וספציפית בהשוואה לתגובה ל-ATP כפי שהודגם באותו ניסוי. דוגמאות מראות גם עלייה חולפת בולטת יותר בריכוז הסידן התוך-תאי שמעורר ALS IgG באסטרוציטים hSOD1G93A בהשוואה לבקרים שאינם מהונדסים; (2) Ca 2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית במהלך דלדול מאגרי הסידן על ידי thapsigargin (Thg), מעכב לא תחרותי של הרשתית האנדופלסמית Ca 2+ ATPase, ולאחר מכן ערך סידן המופעל על ידי אחסון הנגרם על ידי הוספת סידן בתמיסת ההקלטה, המדגימה את ההבדל בין פעולת Ca 2+ בחנות hSOD1G93A ובאסטרוציטים שאינם מהונדסים; (3) Ca 2+ הדמיה של המיקרוגליה התרבית מראה בעיקר חוסר תגובה ל-ALS IgG, בעוד שיישום ATP גרם לשינוי Ca2+. מאמר זה גם מדגיש אזהרות ואזהרות אפשריות לגבי צפיפות תאים קריטית וטוהר התרביות, תוך בחירת הריכוז הנכון של טכניקות צבע Ca2+ והעמסת צבע.

אפיון סוגי תאי גליה שונים בתרבית בדרך כלל לוקח 15-21 ימים לייצר אסטרוציטים לניסויים, בעוד שלתאים מיקרוגליאליים לוקח 10-15 ימים לגדול. החיסון בוצע כדי להעריך את טוהר התאים של התרבית. איור 1 מראה את הביטוי של תיוג כפול של הסמן האסטרוציטי GFAP והסמן המיקרוגליאלי Iba1 בתרבויות המתאימות.
הדמיית סידן ידועה כחושפת את ההבדלים בפיזיולוגיה של התא של אסטרוציטים בריאים וחולים. בעבר באסטרוציטים מסוג בר, הדגמנו כי ALS IgG משפיע על Ca2+ תאי על ידי ...

אנו מציגים כאן פרוטוקול כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות להדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ תוך-תאי למחקר על פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית במודל החולדות hSOD1G93A .

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

פרוטוקול זה מאפשר לחשוף דפוס איתות סידן בין-תאי המאפיין כל תגובה של סוג תא בבריאות כמו גם במחלה. טכניקה זו מאפשרת אפיון ביופיזי מהיר ומפורט של התנהגות תאית מורכבת. אנו מתכננים להשתמש באיתות סידן זה המושרה על ידי IgG כטביעת אצבע לרפואה מותאמת אישית של מחלות נוירו-דלקתיות.בסביבה של החיים האמיתיים, לא קל לראות ולעקוב אחר כל התהליכים והאירועים, במיוחד אלה המתרחשים תחת המיקרוסקופ. לפיכך, הנתונים החזותיים חשובים. לאחר עריפת גורים בני יום עד שלושה ימים, חשפו את הגולגולת על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים קטנים וזוויתיים.לאחר מכן פתח את הגולגולת על ידי חיתוך מגנום פורמן לכיוון המסלולים ובצע חתך קו אמצע מאונך. הוציאו את המוח מהגולגולת, והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS. השתמש בקצה המלקחיים כדי לקרוע את הקשרים בין שתי ההמיספרות, והפרד את ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים על ידי דחיפה עדינה של חצי כדור מהמרכז לצד.השתמשו במלקחיים ישרים ומעוקלים כדי להסיר את קרומי המוח על ידי קריעתם בזהירות. לאחר מכן להסיר את ההיפוקמפוס על ידי צביטה אותו עם מלקחיים מעוקלים, ולהשליך, או להשתמש בו להכנת תרבית תאים אחרת. לאחר מכן, להעביר את קליפת המוח לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של PBS קר הומוגניזציה של הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים עם קצה של מיליליטר אחד.צנטריפוגה התאים ב 500 גרם במשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את הכדור בשלושה מיליליטר של PBS קר על ידי פיפטינג עם קצה של מיליליטר אחד. צנטריפוגה שוב, ולהחזיר את הכדור בשני מיליליטר של DMEM שלם בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה.לאחר העברת ההומוגנט לצינור של שני מיליליטר, מעבירים את ההומוגנט דרך מחטים של 21 ו-23 כדי לבצע השעיה של תאים בודדים. יוצקים את תרחיף התאים שהוכן מקליפת המוח האחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של DMEM שלם, ומנערים קלות את צלחת הפטרי, כך שהמתלה מופץ באופן אחיד. לדגור את התאים באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר ב 37 מעלות צלזיוס.כדי לקדם את צמיחת האסטרוציטים, הסר את המדיה הישנה, ושטוף את התא עם PBS שחומם מראש כדי להסיר את תאי הגליה המחוברים באופן רופף ואת עקבות ה- FBS ברגע שהם מגיעים למפגש של 70% עד 80%. לאחר מכן נסו את השכבה הבסיסית של האסטרוציטים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין שחוממה מראש ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם התאים מתחילים להתנתק, והוסף ארבעה מיליליטר של DMEM שלם.לאסוף את ההשעיה התא, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 500 גרם במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולהשהות את הכדור במיליליטר אחד של מדיום שלם.לספור את התאים באמצעות hemocytometer. לאחר מכן, הכינו את מנת התרבות והוסיפו מדיום תרבותי. סידור מחדש של התאים בצפיפות של 10 עד 4 לסמ"ר בחמישה מיליליטרים של DMEM שלם טרי ושטף את התאים ב-DMEM מלא לפני כל החלפת מדיה.לאחר הגעה למפגש של 70% עד 80%, חזור על טריפסיניזציה, וזרע חמש פעמים 10 לאסטרוציטים השלישיים על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם לצרף במשך 10 דקות, ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.לאחר הכנת תרביות המיקרוגליה, כדי לקדם את המיקרוגליה, אפשרו לתאי הגליה להתמזג והמיקרוגליה תופיע על גבי שכבת האסטרוציטים לאחר 10 עד 15 ימים. נערו את צלחת הפטרי על שייקר אורביטלי במשך שעתיים במהירות של 220 סל"ד. כעת, שטפו קלות את התאים המנותקים והמחוברים באופן רופף על ידי שאיפת הסופרנטנט עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד.יש לטפטף בעדינות את הסופר-נטנט על שכבת התאים מספר פעמים, תוך הקפדה על כיסוי כל משטח שכבת התא במהלך שלב שטיפה זה. לאסוף את המדיום עם תאים מנותקים, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה, החייאה וספירת התאים כפי שהוכח קודם לכן.זרע חמש פעמים 10 למיקרוגליה השלישית על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם להתחבר במשך 10 דקות ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.כדי לשטוף את ה-DMEM השלם, העבירו כיסוי אחד לצלחת עם תמיסה חוץ-תאית. הכן את תמיסת העמסת הצבע על ידי דילול מילימולר אחד Fluo-4 AM עם תמיסה חוץ-תאית כדי להשיג את הריכוז הסופי של חמישה מיקרומולר. מניחים את המכסה עם תאים בתמיסת העמסת הצבע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ושוטפים את התאים בתמיסה חוץ-תאית למשך 20 דקות.הנח את תלוש הכיסוי בתא ההקלטה עם מיליליטר אחד של פתרון עבודה. בחר את שדה הראייה עם מספר עקבי של תאים לאורך כל הניסוי. התחל את ההדמיה וקבע את הבסיס על ידי רכישת הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה למשך שלוש עד חמש דקות.לאחר מכן הפסק את זרימת פתרון העבודה, ועבור לפתרון הבדיקה למשך הזמן הרצוי. בין כל תמיסת בדיקה, לשטוף את התאים עם זרימה קבועה של הפתרון עובד במשך שלוש עד חמש דקות. שמור על עוצמת הקול של התמיסה בתא ההקלטה במיליליטר אחד על ידי סידור יניקה קבועה מראש התמיסה.בחר במסגרת עוצמת האות הגבוהה ביותר, והקף תא אחד באמצעות יישום הכלי מצולע. לאחר כיתור כל התאים בשדה הנרכש, בחר חמישה אזורי עניין ברקע באמצעות הכלי מעגל. לאחר מכן מדוד את עוצמת האות הממוצעת של תא בודד ואת הרקע עבור כל מסגרת זמן.בחר את כל אזורי העניין והשתמש בפקודה Multi-Measure ב-ROI Manager ב-ImageJ, או בכל פקודה מקבילה בתוכנה מסחרית. לאחר ייבוא הנתונים בתוכנת MATLAB, ממוצע של חמישה ROI ברקע והפחת את הרקע הממוצע של כל מסגרת מעוצמת ההחזר הממוצעת על ההשקעה של המסגרות שנרכשו בו זמנית. מאוחר יותר, נתחו את פעילות הסידן על ידי קביעת המשרעת של שיא הסידן, השינוי המשולב של ארעי הסידן, זמן לשיא, זמן עלייה, חצי רוחב ותדירות.GFAP משמש כדי לדמיין אסטרוציטים ו- Iba1 כדי לדמיין microglia. אסטרוציטים hSOD1G93A מגיבים לאימונוגלובולין G של ALS עם משרעת גדולה יותר של הסידן החולף, שינוי משולב כולל משמעותי יותר, וזמן קצר יותר לשיא מאשר אסטרוציטים שאינם מהונדסים. התגובה לאימונוגלובולין G של ALS ניתנת להבחנה מהתגובה ל-ATP.לאסטרוציטים hSOD1G93A הייתה רמה גבוהה יותר של יוני סידן בחנויות, כפי שהתגלה על ידי דלדול החנות, מה שמעיד על עומס יתר של יון זה. המיקרוגליה עברה תרבית, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת הופקה עם הזמן. עקבות הסידן של שלושה תאים ייצגו שרק תא אחד הגיב לאימונוגלובולין G של ALS, בעוד שכל התאים הגיבו ל-ATP.התמונות הפסאודו-צבעוניות ייצגו את עוצמת הפלואורסצנציה ואת קו הבסיס בתגובה ל-ALS, IgG ו-ATP. התאים צריכים להיות נטענים כראוי ואת הפרמטרים של מערכת ההדמיה צריך להיות מותאם כראוי, כך האות לא מופרד במהלך הניסוי. יחד עם פליטת סידן, ניתן לבצע הידוק מדבקה.לפיכך, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של המתאם בין זרמי יונים שונים של הממברנה לבין פליטת סידן. ההבנה של הומאוסטזיס סידן תוך תאי היא בעלת חשיבות חיונית לחקר מספר תגובות לגירויים טבעיים, כמו גם לגירויים מלחיצים וחיצוניים.

primary-cultures-rat-astrocytes-microglia-their-use-study-amyotrophic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

הסרטון מדגים טכניקה לתרבית אסטרוציטים ראשוניים מקליפת המוח של החולדה. קליפת המוח מנותקת מכנית כדי לקבל תרחיף תאי גליה הומוגני, אשר לאחר מכן מצופה על לוחות מצופים פוליפפטיד כדי לקדם התרבות סלקטיבית של אסטרוציטים. לאחר מכן, האסטרוציטים מנותקים אנזימטית מהלוחות ומועברים למדיה חדשה, המאפשרת תרבית של אסטרוציטים טהורים.

יצירת תרבית ראשונית של אסטרוציטים ממוחו של גור חולדה

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד וטיפוח תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות. זה כרוך בהפרדת מיקרוגליה מתאים עצביים ולא עצביים אחרים באמצעות לוחות המצופים בנוגדן חד שבטי ספציפי למיקרוגליה.

בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

חקור תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה מקורטקס חולדות לחקר טרשת אמיוטרופית צידית. הפרוטוקול מאפשר ניתוח אותות סידן תוך-תאיים ואפיון התנהגות תאית במחלות נוירואינפלמטוריות.

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

גלה סרטונים נוספים