Name: בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנא אינטרוניים בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: למדו שיטה לבדיקת השפעת חלבוני קישור RNA רגולטוריים על הביוגנזה והבשלות של מיקרו-רנ"א בתאי יונקים. הפרוטוקול משתמש בזוהר לוציפראז כדי לכמת אינטראקציות בין miRNA למטרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים ל- E. Makeyev (האוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג, סינגפור) על תאי HeLa-Cre ופלסמידים pRD-RIPE ו- pCAGGS-Cre. אנו מודים לעדנה קימורה, קרולינה פרסל גוסס, גיזלה ראמוס, לוסיה רוזטי לופס ואנסלמו מוריסקוט על תמיכתם.

סקירה כללית של הפרוטוקול המתואר כאן מתוארת באיור 1.
1. בנייה פלסמידית
<ol><li>pCAGGS-Cre: פלסמיד זה סופק על ידי ד"ר א. מקייב21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>הגבר pre-miR-17-92 על ידי PCR באמצעות 0.5 μM של כל פריימר ספציפי (טבלת חומרים), 150 ננוגרם של cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR buffer, ו 5 U של פולימראז DNA Taq בנאמנות גבוהה. בצע תגובת PCR ללא תבנית (השתמש במים במקום cDNA) כדי לבדוק אם יש זיהום DNA.</li>
		<li>הפוך את מוצר ה-PCR ל-pRD-RIPE (באדיבות ד"ר א. מקייב, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפור)21 בתוך האינטרון בין אתרי ההגבלה EcoRI ו-EcoRV באמצעות ליגאז DNA, ליצירת pRD-miR-17-92. אשר את שלמות הרצף על-ידי ריצוף Sanger.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>עיצוב פריימרים קדימה ואחורה לצד אתרי הגבלה של XhoI/XbaI ועם אתר הגבלה אחד של NotI בפנים. מערבבים כמויות שוות של פריימרים קדימה ואחורה ומדגרים את התערובת בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מעבירים ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כפקדים, השתמש בפריימרים עם רצפי מטרה מקושקשים (טבלת חומרים).</li>
		<li>בקעו את השברים הנישולים באמצעות אנזימי הגבלה של XhoI/XbaI והעבירו אותם במורד הזרם של רצף luc2 לתוך pmiR-GLO, תוך יצירת pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) ו-pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). אשר קשירה עם מחשוף NotI. הערה: ודא שהשלוחות הנוצרות לאחר חישול פריימר משלימות את הווקטור לאחר תגובת המחשוף.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>כדי ליצור פלסמיד עם ביטוי יתר של HuR, הגבר את רצף HuR באמצעות פריימרים ספציפיים. יש לערבב 300 ננוגרם של cDNA, 0.5 מיקרומטר מכל פריימר ספציפי, תערובת dNTPs של 1 mM, מאגר PCR אחד ו-5 U של פולימראז Taq DNA באיכות גבוהה.</li>
		<li>יש ללפות את מוצר ה-PCR ל-pGEM-T ולאשר את שלמות רצף הדנ"א על ידי ריצוף סנגר. הסר את מקטע ה- HuR מ- pGEM-T והחלף אותו לווקטור ביטוי יונקים pFLAG-CMV-3 כדי ליצור את וקטור ה- pFLAG-HuR.</li>
	</ol></li>
</ol>2. תרבית תאים
הערה: קו התאים HeLa-Cre היה מתנה מד"ר א. מקייב21, והתא הפפילרי של סרטן בלוטת התריס (BCPAP) סופק בחביבות על ידי ד"ר מאסימו סנטורו (אוניברסיטת "פדריקו השני", נאפולי, איטליה). תאי HeLa, תא סרטן פפילרי של בלוטת התריס (BCPAP) ו-HEK-293T שימשו לביטוי יתר של HuR.
<ol><li>שמור על התאים ב-DMEM/עתירת גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1 mM נתרן פירובט, 200 mM L-גלוטמין, ו-1x פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בצלחות פטרי 100 מ"מ, אלא אם כן צוין אחרת. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם אטמוספירה מבוקרת (5% CO2).</li>
	<li>דגירה של תאים דביקים עם טריפסין/EDTA (תערובת תמיסה של 0.5%) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. תנו להם להתנתק מהצלחת (תקופת הדגירה יכולה להשתנות בהתאם לסוג התא).</li>
	<li>בצע טרנספקציה עם מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים בהתאם להוראות היצרן. ודא כי תרביות התאים הן כ 70% נפגש. השתמש בכמויות דומות של דנ"א עבור כל צירופי הטרנספקציה, כמתואר להלן, על-ידי הוספת הדנ"א המתאימים. בצע ניסויי טרנספקציה בשכפולים.<ol><li>ערבבו 200 ננוגרם של דנ"א ו-1.25 מיקרוגרם של ריאגנט טרנספקציה ב-100 מיקרוגרם של מדיום התרבית. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים. דגירה של התאים עם תערובות transfection במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום המכיל 10% FBS, ודגרה במשך 24 שעות נוספות לפני הוספת האנטיביוטיקה לבחירה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ביטוי יתר של HuR
<ol><li>טרנספקט pFLAG-HuR ו- pFLAG ריק לתוך HeLa. בחר תאים על ידי הגדלת ריכוז הגנטיצין (G418) (1 מיקרוגרם/מ"ל) מ-100 מיקרוגרם/מ"ל ל-1000 מיקרוגרם/מ"ל, מה שיוצר קווי תאים יציבים.</li>
	<li>אשר ביטוי יתר עם PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים עבור HuR mRNA, כמתואר בשלב 7.</li>
</ol>4. בידוד RNA מוחלט
<ol><li>השתמש בתאים שנאספו זה עתה. טריפסיניזציה של 70% תרביות תאים קונפלואנטיות (לצורך בדיקה זו נעשה שימוש בתאי HeLa-Cre), כמתואר בשלב 2.2.</li>
	<li>לאסוף את כדור התא על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותו עם 1x PBS (מלח חוצץ פוספט); חזור על הצנטריפוגה.</li>
	<li>השהה את כדור התא ב-1 מ"ל של PBS 1x והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שקלו את כדור התא היבש, והתאימו את נפחי וגודל הצינורות בהתאם. 1 מ"ג תאים מניב כ-1 מיקרוגרם של רנ"א כולל.</li>
	<li>במכסה המנוע, הוסיפו 500-1,000 μL של פנול/כלורופורם לכדור התא (באופן אידיאלי 750 μL לכל 0.25 גרם תאים) והפכו אותו להומוגני על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וערבוב עם המערבולת.</li>
	<li>לדגום את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (20 °C עד 25 °C) כדי לאפשר דיסוציאציה מלאה של קומפלקסים nucleoprotein.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסיפו 200 מיקרו-ליטר של כלורופורם לכל 1 מ"ל של פנול:כלורופורם בשימוש. כסו היטב את צינורות הדגימה.</li>
	<li>מערבבים במרץ במשך 15 שניות (ביד או בקצרה מערבולות במהירות נמוכה יותר) ודוגרים בטמפרטורת החדר (20°C עד 25°C) למשך 2 דקות עד 3 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בדוק נוכחות של שלב פנול-כלורופורם אדום תחתון, שלב ביניים ופאזה מימית עליונה חסרת צבע. הרנ"א נשאר בשלב המיימי העליון. במכסה המנוע, לאסוף את השלב המיימי, הימנעות ממגע עם השלב המתווך, ולהעביר צינור טרי.</li>
	<li>זרז RNA על ידי ערבוב הפאזה המימית עם 400 μL של איזופרופנול בדרגה מולקולרית (יחס של 1:1 לפנול/כלורופורם בשימוש) ו-2 μL של גליקוגן בכל צינור (זה יעזור לדמיין את נוכחות הכדור).</li>
	<li>מערבבים במרץ ביד או הומוגניים עם הקצה במשך ~ 10 שניות. דגירה במשך 15 דקות או לילה ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימה ב 12,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.</li>
	<li>שטפו את כדור ה-RNA על ידי הוספת 3 נפחים של 100% אתנול (כ-1 מ"ל, מדולל באמצעות מי DEPC) וערבבו את הדגימה על ידי מערבולת עד שהכדור משתחרר וצף מלמטה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שוטפים את כדור ה-RNA פי 1 על ידי הוספת 1 מ"ל של 75% אתנול ומערבבים את הדגימה על ידי מערבולת עד שהכדור משתחרר וצף מלמטה. חזור על הצנטריפוגה כמתואר בשלב 4.17.</li>
	<li>בצע סיבוב צנטריפוגה נוסף של 5 שניות כדי לאסוף נוזל שיורי מצד הצינור ולהסיר כל נוזל שיורי עם פיפטה מבלי להפריע לכדור.</li>
	<li>ייבשו לזמן קצר את כדור ה-RNA באוויר על ידי פתיחת מכסה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות והמיסו את גלולת ה-RNA ב-20-50 μL של מים ללא RNase שטופלו ב-DEPC. דגירה של RNA במשך 10 דקות ב 55-60 מעלות צלזיוס כדי להקל על resuspension של גלולה.</li>
</ol>5. קביעת ריכוז ואיכות RNA כוללים
<ol><li>קבע את ריכוז הרנ"א על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. קבל נתונים ספקטרליים מלאים לפני השימוש בדגימות ביישומים במורד הזרם.</li>
	<li>שלוט באיכות הרנ"א על ידי פתרון 800-1000 ננוגרם על ג'ל אגרוז 1.5% באמצעות חיץ TBE 0.5X (בסיס טריס 45 mM, 45 mM חומצה בורית, 1 mM EDTA). סך כל הרנ"א מתפצל לשני פסים המתייחסים ל-28S ו-18S rRNA.<ol><li>הכינו את כל הריאגנטים ושטפו את כל הציוד המשמש להפעלת הג'ל במים שטופלו ב-DEPC. מים מטופלים DEPC מוכנים במכסה המנוע על ידי הוספת 1 מ"ל של diethylpyrocarbonate ל 1000 מ"ל של מים טהורים במיוחד. דגירה במשך ~ 2 שעות בטמפרטורת החדר או ב 37 °C (77 °F) ו autoclave. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד 10 חודשים. הערה: אלקטרופורזה של סך ה-RNA של יונקים מובילה להפרדה של 28S ו-18S rRNAs ביחס של כ-2:1. הרצועות צריכות להיות שלמות וגלויות כשתי רצועות חדות. RNA פגום יגרום לפסים מטושטשים.</li>
	</ol></li>
</ol>6. תמלול לאחור
<ol><li>הגדר את תגובת השעתוק ההפוכה באמצעות 1 מיקרוגרם של RNA כולל.</li>
	<li>בצע שעתוק הפוך (RT) באמצעות אנזים טרנסקריפטאז הפוך (ראה טבלת חומרים) ופריימרים אקראיים של 50 ng/μL.<ol><li>מערבבים RNA, פריימרים אקראיים ותערובת dNTP של 1 mM (10 mM) ב-10 μL. דגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ועל קרח למשך דקה אחת. הוסף את הריאגנטים הבאים: מאגר RT 1x, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U של מעכב RNase ו- 200 U של טרנסקריפטאז הפוך.</li>
		<li>דגירה במשך 10 דקות ב 25 °C (75 °F) ובמשך שעה אחת ב 50 °C (הטמפרטורות עשויות להשתנות אם נעשה שימוש באנזימים שונים). סיים את התגובה על ידי דגירה ב 85 °C במשך 5 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>7. PCR כמותי
<ol><li>כדי להרכיב את התגובה בנפח סופי של 15 μL, יש לערבב 3 μL של cDNA (100 ng/μL), 3.2 pmol של כל פריימר, 6 μL של תערובת מאסטר המכילה את dNTPs ואנזים, ו-2.8 μL של מים אולטרה-טהורים. הערה: השתמש בפריימרים עבור גנים מכוננים אנדוגניים כבקרות (גנים משק בית) כדי לנרמל את רמות הביטוי של mRNA HuR ו- miRNAs. β-אקטין ו-snRNA U6 (RNU6B) הן אפשרויות זמינות לנורמליזציה של mRNAs ו-miRNAs, בהתאמה, אך גם גנים אחרים עשויים להתאים בהתאם למקרה.</li>
	<li>כימות רמות הביטוי באמצעות שיטת דלתא-דלתא Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. מבחן הכתב
<ol><li>תאים המשמשים לבדיקה<ol><li>טרנספקט את הפלסמידים בתאי HeLa-Cre כדלקמן. טרנספקט עם pTK-רנילה (40 ננוגרם), לאחר מכן pRD-miR-17-92, יצירת HeLa-Cre-miR-17-92, ובחירה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.</li>
		<li>Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla עם pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR או pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, בנפרד. בחר באמצעות פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל). טרנספקציות אלה יוצרות את לוק-ראפ-1-B ולוק-מקושקשות.</li>
		<li>בצע טרנספקט של התאים באמצעות pFLAG-HuR או pFLAG ריק (שלב 3).</li>
		<li>המשך לתרבית תאים, כמפורט בשלב 2.2., עם HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR, ו- HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc עד כ-80% מהמפגש. השרה עם 1 μL של דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמו כן, שמור את כל התאים ללא doxycycline כמו בקרות, במשך אותה תקופה. הערה: הריכוז הסופי של דוקסיציקלין תלוי בקו התא המועדף. עודף של דוקסיציקלין יכול להיות רעיל לתאי יונקים.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת זוהר<ol><li>כדי לכמת ולהשוות עוצמות זוהר שונות, השתמש בערכת הבדיקה של כתב Dual-luciferase. הפשירו את תמיסות הבדיקה של לוציפראז והשאירו אותן בטמפרטורת החדר לפני תחילת הבדיקה.</li>
		<li>הכינו את התערובת סטופ וגלו (צינורות כובע כחול) על ידי ערבוב 200 מיקרון ליטר של המצע ב-10 מ"ל של לוציפראז Assay Buffer II. הכינו את התערובת LAR II (צינורות כובע ירוק) על ידי ערבוב 10 מ"ל של לוציפראז Assay Buffer II לתוך בקבוקון הענבר של לוציפראז Assay Substrate II ונערו היטב.</li>
		<li>העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל שזוהו בעבר ומוגנים מפני אור. הערה: כחלופה, ניתן להכין את הפתרונות בעבר ב-aliquots של 1-2 מ"ל ולהקפיא אותם בטמפרטורה של 80°C- מוגנים מפני אור ברדיד אלומיניום.</li>
		<li>לבצע את קריאות luminescence באמצעות ציוד כגון סינרגיה; מידה מבוטא לוציפראז כיחידות אור יחסיות (RLU).</li>
		<li>ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף.</li>
		<li>בצע נורמליזציה של פעילות גחלילית-לוציפראז על ידי הבקרה רנילה (לוציפראז/רנילה) והתווה זאת כיחידות אור יחסיות (RLU) בגרפיקה. חזור על כך עבור קבוצות עם ובלי אינדוקציה של דוקסיציקלין.</li>
		<li>חשב את הממוצע ואת שגיאת התקן של הממוצע (SEM). בצע מבחן t של סטודנט או ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן שלאחר Tukey כדי לאפשר השוואה קבוצתית. ניתוחים אלה זמינים בחבילה כגון GraphPad Prism. הבדלים בערכי p < 0.05 נחשבים משמעותיים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+by+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li>
<li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+devices+of+the+spliceosome%3A+Motors%2C+clocks%2C+springs%2C+and+things%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li>
<li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antigen+R+%28HuR%29+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li>
<li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtrons%3A+MicroRNA+biogenesis+via+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li>
<li>Michlewski, G., Cáceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li>
<li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li>
<li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtrons%2C+an+emerging+class+of+atypical+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li>
<li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m%286%29A-dependent+nuclear+RNA+processing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li>
<li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li>
<li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438(2016).</li>
<li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312(2014).</li>
<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

שחבור קדם-mRNA הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים, והבקרה שלו יכולה לגרום להשפעות חזקות על שינויים פנוטיפיים של תאים22,23. יותר מ-70% מה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים בבני אדם, והשערנו שניתן להקל על העיבוד וההבשלה שלהם על ידי שחבור חלבונים רגולטוריים24,25. פיתחנו שיטה לניתוח עיבוד ותפקוד של miRNA אינטרוני בתאים בתרבית. הבדיקה שלנו משתמשת בארבעה פלסמידים שונים ומאפשרת לנו לבחון את ההבשלה של miRNAs אנדוגניים וא...

שחבור mRNA מבשר הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים באאוקריוטים1. הסרת אינטרונים ואיחוד האקסונים ברנ"א בוגר מזורזים על ידי ה-spliceosome, קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין של 2 מגה-דלטון המורכב מ-5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 ו-U6) יחד עם יותר מ-100 חלבונים 2,3. תגובת השחבור מתרחשת באופן משותף, והשחבור מורכב בכל אינטרון חדש המונחה על ידי זיהוי אתרי שחבור משומרים בגבולות אקסון-אינטרון ובתוך האינטרון4. אינטרונים שונים עשויים להיות בעלי קצבי שחבור שונים למרות השימור המדהים של קומפלקס השחבור ומרכיביו. בנוסף להבדלים בשימור אתרי שחבור, רצפים רגולטוריים המופצים על אינטרונים ואקסונים יכולים להנחות חלבונים קושרי RNA (RBP) ולעורר או לדכא שחבור 5,6. HuR הוא RBP המבוטא בכל מקום והוא גורם חשוב לשליטה ביציבות mRNA7. תוצאות קודמות מהקבוצה שלנו הראו כי HuR יכול להיקשר לאינטרונים המכילים miRNAs, מה שמצביע על כך שחלבון זה עשוי להיות גורם חשוב המקל על עיבוד והבשלה של miRNA, מה שמוביל גם ליצירת איזופורמים חלופיים של שחבור 6,8,9.
מיקרו-רנ"א רבים (miRNAs) מקודדים מרצפים אינטרוניים. בעוד שחלקם הם חלק מהאינטרון, אחרים ידועים בשם "מיטרונים" ונוצרים על ידי כל האינטרון10,11. miRNAs הם רנ"א קצרים שאינם מקודדים, הנעים בין 18 ל-24 נוקלאוטידים באורך12. הרצף הבוגר שלהם מראה השלמה חלקית או מלאה עם רצפי מטרה ב-mRNA, ולכן משפיע על קצב התרגום ו/או הדעיכה של mRNA. השילובים של miRNAs ומטרות מניעים את התא לתוצאות שונות. מספר miRNAs יכולים להניע תאים לפנוטיפים פרו-או אנטי-גידוליים13. miRNAs אונקוגניים מתמקדים בדרך כלל ב-mRNA המעוררים מאפיין מדכא, מה שמוביל לשגשוג תאי מוגבר, נדידה ופלישה14. מצד שני, miRNAs מדכאי גידול עשויים להתמקד ב-mRNA אונקוגני או mRNA הקשורים לשגשוג מוגבר של תאים.
העיבוד וההבשלה של miRNAs תלויים גם במקורם. רוב miRNAs אינטרוניים מעובדים בהשתתפות המיקרו-מעבד, שנוצר על ידי ריבונוקלאז דרושה וקו-פקטורים של חלבון12. מיטרונים מעובדים עם פעילות של spliceosome ללא תלות Drosha15. בהתחשב בתדירות הגבוהה של miRNAs שנמצאים בתוך אינטרונים, שיערנו שחלבונים קושרי RNA המעורבים בשחבור יכולים גם להקל על העיבוד וההבשלה של miRNAs אלה. יש לציין כי ה-RBP hnRNP A2/B1 כבר נקשר למיקרו-מעבד ולביוגנזה של miRNA16. 
דיווחנו בעבר כי מספר חלבונים קושרי RNA, כגון hnRNPs ו-HuR, קשורים ל-miRNAs אינטרוניים על ידי ספקטרומטריית מסה17. הקשר של HuR (ELAVL1) עם miRNAs מהצביר הפנימי miR-17-92 אושר באמצעות מיצוי חיסוני ובניתוח סיליקו 9. miR-17-92 הוא אשכול miRNA אינטרוני המורכב משישה miRNAs עם ביטוי מוגבר בסוגי סרטן שונים18,19. אשכול זה ידוע גם בשם "oncomiR-1" והוא מורכב מ- miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b ו- miR-92 a. miR-19 a ו- miR-19 b הם בין ה- miRNAsהאונקוגניים ביותר של אשכול זה 19. הביטוי המוגבר של HuR מגרה את הסינתזה miR-19a ו-miR-19b 9. מאחר שאזורים אינטרוניים המקיפים את הצביר הזה קשורים ל-HuR, פיתחנו שיטה לחקור אם חלבון זה יכול לווסת את הביטוי וההבשלה של miR-19a ו-miR-19b. אחד התחזיות החשובות של ההשערה שלנו היה שכחלבון רגולטורי, HuR יכול להקל על ביוגנזה של miRNA, מה שמוביל לשינויים פנוטיפיים. אפשרות אחת הייתה ש-miRNAs עובדו על ידי גירוי של HuR אך לא יהיו בוגרים ומתפקדים, ולכן ההשפעות של החלבון לא ישפיעו ישירות על הפנוטיפ. לכן, פיתחנו בדיקת כתב שחבור כדי לחקור אם RBP כגון HuR יכול להשפיע על ביוגנזה והבשלה של miRNA אינטרוני. על ידי אישור עיבוד והבשלה של miRNA, הבדיקה שלנו מראה את האינטראקציה עם רצף המטרה ואת יצירת miRNA בוגר ומתפקד. בבדיקה שלנו, אנו משלבים את הביטוי של צביר miRNA אינטרוני עם פלסמיד לוציפראז כדי לבדוק אם יש קשירת מטרה של miRNA בתאים בתרבית.

<table><tbody><tr><td>DNA רקומביננטי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (Cre- מקודד פלסמיד)</td><td></td><td></td><td>מתנה נדיבה מ- E. Makeyev מ- Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-donor</td><td></td><td></td><td>מתנה נדיבה מ- E. Makeyev מ- Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr> <tr><td><נוגדנים חזקים> < חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-B אקטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-HuR</td><td>איתות תאים</td><td>mAb&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW עז נגד עכבר IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>><מודלים ניסיוניים: קווי תאים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>מתנה אדיבה מ- E. Makeyev מ- Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>נוצר במהלך עבודה זו</td></tr> <tr><td>כימיקלים ופפטידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/גלוקוז גבוה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>ביובייסיק</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוציפראז כפולה גלו</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>גנטיצין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 וקטור ביטוי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה טאק DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV ערכת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-LS מגיב</td><td>תרמו פישר</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>Promega</td><td></td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אוליגונוקלאוטידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קדימה RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>הפוך RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>קדימה מקושקשת pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>הפוכה מקושקשת pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>קדימה HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>הפוך HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>קדימה pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>הפוך pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>קדימה snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>הפוך snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>קדימה B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>הפוך B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>קדימה HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>הפוך HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>קדימה pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>הפוך pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 for Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>תמונהJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הן מולקולות רנ"א קצרות הנפוצות באאוקריוטים. רוב ה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים, וההבשלה שלהם מערבת חלבונים קושרי RNA שונים בגרעין. miRNAs בוגרים מתווכים לעתים קרובות השתקת גנים, וזה הפך לכלי חשוב להבנת אירועים שלאחר שעתוק. מלבד זאת, ניתן לחקור אותה כמתודולוגיה מבטיחה לטיפולים גנטיים. עם זאת, כיום חסרות שיטות ישירות להערכת ביטוי miRNA בתרביות תאים של יונקים. במאמר זה נתאר שיטה יעילה ופשוטה המסייעת בקביעת הביוגנזה וההבשלה של miRNA באמצעות אישור האינטראקציה שלה עם רצפי מטרה. כמו כן, מערכת זו מאפשרת הפרדה של הבשלת miRNA אקסוגנית מהפעילות האנדוגנית שלה באמצעות מקדם דוקסיציקלין-אינדוקטיבי המסוגל לשלוט על שעתוק miRNA ראשוני (pri-miRNA) ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה. כלי זה מאפשר גם אפנון עם חלבונים קושרי RNA בפלסמיד נפרד. בנוסף לשימוש בו עם מגוון של miRNAs שונים ואת המטרות שלהם בהתאמה, זה יכול להיות מותאם לקווי תאים שונים, בתנאי אלה מקובלים על transfection.

ההשערה הראשונית שלנו הייתה ש-HuR יכול להקל על ביוגנזה פנימית של miRNA על ידי קשירה לרצף הקדם-miRNA שלו. לפיכך, הקשר של ביטוי HuR וביוגנזה של אשכול miR-17-92 יכול להצביע על מנגנון חדש המסדיר את ההבשלה של miRNAs אלה. ביטוי יתר של HuR לאחר העברה של pFLAG-HuR אושר בשלושה קווי תאים שונים: HeLa, BCPAP ו-HEK-293T (איור 2). כבקרות, נעשה שימוש בתאים ובתאים לא מותמרים עם וקטורים ריקים של pFLAG. חשוב לציין שראינו שביטוי יתר של HuR בתאים אלה ממריץ את הביטוי של miR-19a (תוצאות ט...

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

הפרוטוקול שלנו מטפל בהשפעות של חלבונים קושרי RNA רגולטוריים על ביוגנזה והתבגרות של מיקרו-רנ"א, היישר מתרביות תאים. השיטה שאנו מתארים יכולה להתבצע עם ריאגנטים נפוצים של תרביות תאים והיא מהירה יחסית. שיטה זו יכולה להיות חשובה כדי לחקור את ההשפעות הפנוטיפיות של מיקרו-רנ"א ומטרותיהם בסוגים שונים של תאים אאוקריוטים.ניתן להשתמש בתאים רגילים או דמויי מחלה. חשוב לבחור קווי תאים הניתנים לטרנספקציה, לבצע טרנספקציה נאותה ובקרות אינדוקציה על מנת לבחון את השינויים באהדת המטרה באמצעות פעילות לוציפראז. כדי להתחיל, לשמור על התאים ב- DMEM, תוסף גלוקוז גבוה בצלחות פטרי 100 מילימטרים ולדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממת אטמוספירה לחה ומבוקרת עם 5% פחמן דו חמצני.כדי לנתק תאים דבקים, לדגור אותו עם תמיסת טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. כדי לבצע טרנספקציות, מערבבים 200 ננוגרם של דנ"א ו-1.25 מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה ב-100 מיקרוליטרים של מדיום התרבית ומוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים. לאחר מכן, לדגור על התאים עם תערובות transfection במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן החליפו את המדיום במדיום המכיל 10% FBS ודגרו במשך 24 שעות נוספות לפני הוספת האנטיביוטיקה לבחירה. כדי להמיר pFLAG-HuR ו- MT-pFLAG לתוך HeLa, בחר תאים על ידי הגדלת הריכוז של גנטיצין מ 100 מיקרוגרם למיליליטר

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כאן אנו מתארים assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם...

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

בסרטון זה אנו מדגימים כי בנוכחות מעכב פוספודיסטר, מחזור תאי הביצית נעצר בשלב I, שבמהלכו מאוחסנים mRNA משועתקים בהיעדר תרגום. לאחר שחרור המעכב, התבגרות הביציות מתחדשת, והתאים נכנסים למטאפאזה. האות של mRNA הכתב התמזג עם גן המטרה במטאפאזה-I מצביע על הפעלת מכונות תרגום וביטוי חלבונים.

The In Vitro Single Ovcyte Reporter Assay: טכניקה לחקר ויסות תרגום mRNA ממוקד במהלך הבשלת ביציות חוץ גופיות

בדיקת המדווח הגנטי היא כלי מבוסס ורב עוצמה לניתוח הקשר בין רצפי DNA לפעילויות ויסות הגנים שלהם. צימוד אלמנטים רגולטוריים מועמדים לגנים מדווחים הנושאים תגי רצף מזהים מאפשר הקבלה מסיבית של מבחנים אלה.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

כאן אנו מציעים אסטרטגיה לחקור את ההשפעה של גורם שעתוק מעניין על טרנסקריפטום המיקרו-RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתוני תפוקה גבוהה ממערכי מיקרו-RNA לאחר העברת תאים עם RNA קטן (sh)RNA המכוון לגורם שעתוק מעניין.

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

למדו שיטה לבדיקת השפעת חלבוני קישור RNA רגולטוריים על הביוגנזה והבשלות של מיקרו-רנ"א בתאי יונקים. הפרוטוקול משתמש בזוהר לוציפראז כדי לכמת אינטראקציות בין miRNA למטרות.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים