Name: מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: חקור מודל מכרסמים מושרה TNBS לחקר תפקיד המתח המכני בדלקת מעי כרונית. השיטה מאפשרת השוואה בין קטעים דלקתיים ללא דלקתיים ומדגימה את חשיבות המתח המכני בפתוגנזה של מחלת קרוהן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענקים מ- NIH (R01 DK124611 ל- XZS) וממשרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-20-1-0681 ל- XZS). עבודת ההיסטולוגיה נעשתה בעזרת המעבדה לפתולוגיה כירורגית UTMB.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של המחלקה הרפואית של אוניברסיטת טקסס (#0907051C). חולדות ספראג-דולי זכר או נקבה, ~ 8-9 שבועות, שימשו למחקר.
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>חולדות מהירות במשך 24 שעות ולטפל בהם עם משלשל (ניקוי מעיים, ראה טבלת חומרים) לילה.</li>
	<li>למחרת, להרדים חולדות באמצעות מערכת הרדמה (ראה טבלת חומרים) על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין יחד עם 1 ליטר / דקה של חמצן במהלך ניהול TNBS. בדוק אם קיימים רפלקסים או צבוט בהונות כדי לאשר הרדמה.</li>
	<li>הכן פתרון TNBS טרי על פי משקולות הגוף. הערה: TNBS - 65 מ"ג /ק"ג של משקל הגוף ב 250 μL של 40% אתנול שימש.</li>
	<li>שים חולדות בתנוחה סופית על שולחן ההרדמה. כדי לגרום קוליטיס, להכניס דרך פי הטבעת צנתר פוליאוריטן פתוח ברמה רפואית עבור ~ 7-8 ס"מ מן הסף אנאלי בעדינות להחדיר TNBS (מוכן בשלב 1.3) לתוך המעי הגס19. לנהל את חולדות שליטה מזויפת עם 250 μL של תמיסת מלח בלבד.</li>
	<li>לאחר החדרת TNBS או מלוחים, לשמור חולדות במצב supine ומעט ראש למטה (~ 30 °), עם פי הטבעת סגור במשך 2 דקות כדי לעזור הפצת TNBS ולמנוע דליפות.</li>
	<li>לספק חולדות עם מזון ומים ad libitum במשך 7 ימים ולבחון את החולדות מדי יום עבור משקל הגוף, ספיגת מזון, צואה, ומצב בריאותי כללי.</li>
</ol>2. הכנות לרקמות
<ol><li>ביום המתת חסד, המתת חסד החולדות באמצעות שאיפת CO2 ולאשר המתת חסד עם פריקת צוואר הרחם.</li>
	<li>פתח את בטן החולדה באמצעות מספריים ומלקחיים בדרגה כירורגית.</li>
	<li>הסר בזהירות את המעי הגס כולו (מעל התעלה האנאלית) והעבר את המעי הגס מיד למאגר HBSS 1x קר כקרח.</li>
	<li>יישר את נקודתיים במאגר ומדוד את אורך המעי הגס באמצעות סרגל. קח חוט ניילון ועיגול סביב המעי הגס כדי למדוד את ההיקף החיצוני של מקטעי המעי הגס בשליטה וחולדות שטופלו TNBS. קח רקמות בעובי מלא להיסטולוגיה.</li>
	<li>חותכים את המעי הגס לאורך הלוח המזנטרי ולנקות היטב את המעי הגס עם מאגר HBSS. להעריך את המעי הגס עבור ציון דלקת מקרוסקופית בהתבסס על הקריטריונים כפי שתואר בעבר19 עם שינויים מינימליים. הערה: 0 = רירית רגילה; 1 = היפרמיה מקומית אך ללא שחיקה או כיבים; 2 = כיב והיצרות (אזור מושפע < 5 מ"מ); 3 = כיב חמור, צלקת, היצרות (אזור מושפע > 5 מ"מ).</li>
	<li>לאסוף דגימות רקמה המעי הגס מאתר P (חלק 2-3 ס"מ לפני השוליים האוראליים של אתר דלקת), אתר I (אתר דלקת, בדרך כלל 4-6 ס"מ מסוף המעי הגס, שבו TNBS הוא החדיר), ואתר D (חלק 1-2 ס"מ דיסטלי לשוליים ביטול של אתר דלקת), בהתאמה מחולדות שטופלו TNBS. הערה: רקמת המעי הגס באורך של כ-1-2 ס"מ נלקחה מכל מקטע. בנוסף, רקמות המעי הגס שאורכן 2 ס"מ (כ-4-6 ס"מ מקצה המעי הגס) של החולדות שטופלו במלח נלקחו כשליטה מזויפת (S) (איור 1).</li>
	<li>קח דגימות רקמה מכל אתר להכנה בעובי מלא, ואם תרצה, רירית / submucosa ו muscularis externa שכבות, בהתאמה, כמו גם21,22.</li>
	<li>הקפאת דגימות רקמת חנקן נוזלי הראשון לפני אחסון אותם ב -80 °C (80 °F) לאחסון עד שנה אחת ולמטרות עתידיות (כלומר, הכנות RNA).</li>
</ol>3. הערכה היסטופתולוגית של דלקת במעיים ופיברוזיס
<ol><li>תקן את רקמות המעי הגס בעובי מלא ב 10% פורמלין עבור 48 שעות, ולאחר מכן להעביר 70% אתנול עבור 24-48 שעות.</li>
	<li>השתמש microtome לחתוך מקטעי פרפין של 5 מיקרומטר עובי עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) וכתמי טריכרום של מאסון 6,19,23 (ראה טבלת חומרים), בהתאמה.</li>
	<li>השג והצג תמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה עם תוכנה תואמת (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מדדי דלקת ופיברוזיס כיתה על ידי שני חוקרים עצמאיים, כולל פתולוג כירורגי במערכת העיכול על פי קריטריונים שתוארו בעבר 6,23 עם שינויים. ראה קובץ משלים 1 לקבלת הציונים.</li>
	<li>מדוד את העובי ומספרי התאים של שכבות השרירים המעגליות והאורך לכל חתך בארבע תצוגות של כל דגימה מוכתמת H&E וקח את הממוצע של ארבע המדידות עבור כל דגימה.</li>
</ol>4. מיצוי RNA וכמותי RT-PCR
<ol><li>Homogenize exced רקמות המעי הגס שהתקבלו מהבקרה המזויפת ושלושה אתרים (P, I, D) של חולדות קוליטיס TNBS בריאגנט החילוץ של ערכת מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לבודד RNA מכל מדגם ניצול הערכה. לרומם את גלולה RNA ב 30 μL של מים ללא RNase.</li>
	<li>לכמת ריכוז RNA ולבדוק טוהר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis microvolume (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש 1 מיקרוגרם של RNA הכולל כדי לסנתז cDNA21,22 באמצעות ערכת סינתזה RNA (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לנתח ולכמת את רמות ביטוי הגנים על ידי ביצוע PCR בזמן אמת עם 50 ננוגרם של cDNA כתבנית, בדיקות של IL-6 ו- CTGF באמצעות ערכת PCR מסחרית למערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש בגן בקרה 18S rRNA כדי לנרמל את הדגימות ולכמת ביטוי גנים יחסי תוך שימוש בערכי Cq שהושגו.</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטית (ראה טבלת חומרים) כדי להשוות שליטה מזויפת וחולדות קוליטיס TNBS.</li>
	<li>שקול ערך p < 0.05 להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית15,19.</li>
	<li>כדי לבדוק את ההבדלים בין שתי קבוצות, השתמש בניתוח t-test של סטודנט ובצע בדיקת ANOVA אם ההשוואות הן יותר משתי קבוצות15,19.</li>
</ol>

<ol><li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li>
<li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li>
<li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis%3A+Ready+to+be+reversed%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+management%2C+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Crohn%27s+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li>
<li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+hyperplasia%2Fhypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn%27s+fibrostenosing+bowel+strictures%3A+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li>
<li>Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+course+of+Crohn%27s+disease+after+ileocolic+resection%3A+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li>
<li>Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+is+a+pro-inflammatory+stimulus+in+the+gut%3A+In+vitro%2C+in+vivo+and+ex+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence.</a> PLoS One. 9, 106242(2014).</li>
<li>Gabella, G., Yamey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+collagen+by+smooth+muscle+in+the+hyertrophic+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine.</a> Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).</li>
<li>Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li>
<li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Role+of+stretch-induced+COX-2%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1%28I%29+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li>
<li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24(2012).</li>
<li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+the+Cyr61%2FCCN1+and+CTGF%2FCCN2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li>
<li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn%27s+colitis+and+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li>
<li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNBS-induced+colitis+animal+model%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li>
<li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists%3A+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li>
<li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li>
<li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease%3A+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li>
<li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350(2021).</li>
</ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגוד אינטרסים ואין להם מה לחשוף.

קוליטיס הנגרמת על ידי TNBS הוצגה בשנת 1989, שימשה כמודל ניסיוני של מחלת קרוהן מאז 19,20,23. מאפיינים משמעותיים של מודל זה במכרסמים כוללים התפתחות של דלקת טרנסמולרית הדומה מאוד לנגעים ההיסטופתולוגיים שפותחו במחלת קרוהן אנושית19,20. מחקרים קודמים על המודל התמקדו בעיקר בתגובה חיסונית חריגה בשכבת הרירית באתר של דלקת גלויה (האתר I)19,20,23<s...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD), מאופיינת בדלקת כרונית במערכת העיכול (GI). זה משפיע על ~ 1-2 מיליון אמריקאים1. העלויות השנתיות המשוערות לטיפול במחלת המעי הרגיז בארה"ב הן 11.8 מיליארד דולר. שלא כמו UC, התקליטור מאופיין על ידי דלקת transmural ו היווצרות קפדנית 2,3. היווצרות קפדנית (היצרות) מתרחשת בעד 70% מחולי CD3 ועשויה להיגרם על ידי דלקת טרנסמורלית (היצרות דלקתית) או פיברוזיס מעיים (היצרות פיברוטית)4,5. פיברוזיס מעיים מאופיין בתצהיר קולגן מוגזם ומטריצות חוץ-תאיות אחרות (ECM) עם תאי שריר חלקים (SMC) כאחד מסוגי התאים המזנכימליים העיקריים המעורבים בתהליך 3,4. היפרפלזיה חלקה של שרירים הקשורים להיפרטרופיה היא שינוי היסטולוגי משמעותי נוסף בהיצרות הפיברוטית ב- CD6. למרות היווצרות קפדנית בתקליטור קשורה עם דלקת כרונית, אין טיפול אנטי דלקתי יעיל, למעט טיפול כירורגי 2,6. עם זאת, הישנות לאחר הניתוח הם כמעט 100%, נתון מספיק זמן 2,7. כתגובה דלקתית, פיברוזיס והיפרפלזיה SMC עלולים להתפתח גם במצבים לא דלקתיים (כלומר, חסימת מעיים) במעיים 8,9; הוא האמין כי הן מנגנונים תלויי דלקת ועצמאיים מעורבים היווצרות קפדנית 3,4. בהתחשב בכך מחקר מקיף לתוך מנגנונים תלויי דלקת לא תורגם לכל טיפול יעיל להיווצרות קפדנית, מחקרים לתוך התפקיד האפשרי של מנגנונים עצמאיים דלקת פיברוזיס מעיים נדרשים.
כגורם לא דלקתי, מתח מכני (MS) הקשורים בצקת, חדירת תאים דלקתיים, עיוות רקמות, פיברוזיס, והיצרות 10,11,12,13 הוא נתקל בדרך כלל IBD, במיוחד CD, אשר מאופיין על ידי דלקת טרנסמורלית. מתח מכני הוא המדהים ביותר בתקליטור רגיש, שבו היצרות (דלקתית או פיברוטית) באתר הדלקת מציגה מתח מכני ברקמה המקומית ומובילה להתנפחות לומן במגזר הפרוקסימלי לאתר החסימה10,14. מחקרים קודמים במבחנה הראו כי מתח מכני משנה ביטוי גנים של מתווכים דלקתיים ספציפיים (כלומר, COX-2, IL-6)8,14,15 וגורמי גדילה (כלומר, TGF-β) ברקמות מערכת העיכול, במיוחד תאי שריר חלקים במעיים (SMC)16. מחקרים אחרונים מצאו גם כי הביטוי של מתווכים פרו-פיברוטיים ספציפיים כגון גורם גדילה רקמת חיבור (CTGF) רגיש מאוד ללחץ מכני17,18. ההשערה הייתה כי מתח מכני עשוי לשחק תפקיד פתוגניים עצמאיים דלקת הקשורים CD, פיברוזיס, ושיפוץ רקמות. עם זאת, המשמעות הפתוגנית של מתח מכני בדלקת מעיים, פיברוזיס והיפרפלזיה חלקה של שרירים בתקליטור נותרה במידה רבה לא נחקרה. זה יכול להיות בחלקו כי דלקת היא תהליך גלוי יותר למד טוב יותר מאשר מתח מכני. חשוב מכך, לא היה מודל בעלי חיים מוגדר היטב של IBD כדי להבחין את ההשפעה של מתח מכני מזה של דלקת.
העבודה הנוכחית מתארת מודל מכרסם של קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הזרקה intracolonic של ריאגנט הפטן 2,4,4,6-trinitrobenzene חומצה גופרתית (TNBS)19,20, אשר עשוי לשמש את המטרה ללמוד את התפקיד של מתח מכני בתקליטור. נמצא כי הטמעת TNBS גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (~ 2 ס"מ באורך) עם לומן היצרות (היצרות) במעי הגס הדיסטלי. היצרות מובילה להתנפחות מעיים מסומנת (מתח מכני)14,15 אך לא דלקת גלויה במגזר המעי הגס בסמיכות לאתר ההחדרה. להיפך, קטע המעי הגס דיסטלי לאתר היצרות מציג לא דלקת ולא מתח מכני. שינויים משמעותיים ספציפיים לאתר בביטוי גנים, דלקת, פיברוזיס, היפרפלזיה SMC נצפו בשלושת האתרים השונים. התוצאות מצביעות על כך שמתח מכני, במיוחד ביטוי גנים מכני המושרה מלחץ, עשוי לשחק תפקיד קריטי בפיתוח פיברוזיס והיפרפלזיה בקוליטיס של קרוהן.

<table><tbody><tr><td>ACT-1 בקרה תוכנה Ver2.63</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>C1000 מגע תרמי Cycler עם 96 בארות מודול תגובה מהירה</td><td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 מודול תגובה אופטית למערכות PCR בזמן אמת</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Dako Agilent Artisan Link Pro מכתים מיוחדים</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson's ערכת טריכרום ref# AR173</td><td>Dako</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200 מצלמת HR צבעונית דיגיטלית</td><td>Nikon</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA בקרה אנדוגנית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>E-Z הרדמה</td><td>E-Z Systems Inc.</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>לוחות PCR עם מעטפת קשיחה 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, לבן/שקוף</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של קורנינג האנק, 1x ללא סידן ומגנזיום)</td><td>CORNING</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey מערכת הדמיה דיגיטלית</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler עם לוח בקרה 5340 Thermal</td><td>Cycler Eppendorf</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>קטטר פוליאוריטן פתוח בדרגה רפואית</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E800 מיקרוסקופ זקוף</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז / כריכי נייר פילטר חבילה של 50, 0.45 &mu; מ', 7 x 8.5 ס"מ</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 3350, משלשל אוסמוטי</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>מינון: 17 גרם ב-226 מ"ל מים</td></tr><tr><td>ערכת מיני RNeasy (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, צינורות איסוף (1.5 מ"ל ו-2 מ"ל), ריאגנטים ומאגרים ללא RNase</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III מערכת סינתזה ראשונה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>מבחני ביטוי גנים של TaqMan Rn00573960_g1 בדיקת CTGF ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>מבחני ביטוי גנים של TaqMan Rn99999011_m1 בדיקת IL6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H& ערכת כתמים E #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus מכתש שקופיות אוטומטי</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS (תמיסת חומצה פיקרילסולפונית)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל מכרסמים המושרה על ידי tnbs לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

מחלות מעי דלקתיות (IBD) כגון מחלת קרוהן (CD) הן הפרעות דלקתיות כרוניות במערכת העיכול המשפיעות על כ -20 לכל 1,000,000 באירופה ובארה"ב. התקליטור מאופיין בדלקת טרנסמורלית, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת. למרות טיפולים אנטי דלקתיים עשויים לעזור לשלוט בדלקת, אין להם יעילות על פיברוזיס והיצרות בתקליטור. הפתוגנזה של התקליטור אינה מובנת היטב. המחקרים הנוכחיים מתמקדים בעיקר בתיחום מנגנוני התגובה החיסונית של המעיים. בעוד שדלקת טרנסמולרית הקשורה לתקליטור, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת מייצגים כולם מתח מכני על דופן המעיים, תפקיד הלחץ המכני בתקליטור אינו מוגדר היטב. כדי לקבוע אם מתח מכני ממלא תפקיד פתוגניים עצמאי בתקליטור, פותח פרוטוקול של מודל קוליטיס דמוי תקליטור המושרה TNBS במכרסמים. מודל זה של דלקת טרנסמורלית ופיברוזיס המושרה על ידי TNBS דומה לסימני היכר פתולוגיים של תקליטור במעי הגס. זה מושרה על ידי החדרה intracolonic של TNBS לתוך המעי הגס הדיסטלי של חולדות ספראג-דולי בוגרות. במודל זה, דלקת טרנסמורלית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS (אתר I). התנערות מכנית נצפתה בחלק הקרוב לאתר ההחדרה (אתר P), המייצג מתח מכני אך לא דלקת גלויה. חלק המעי הגס דיסטלי לדלקת (אתר D) אינו מציג דלקת ולא מתח מכני. שינויים ייחודיים של ביטוי גנים, תגובה חיסונית, פיברוזיס, וצמיחת שרירים חלקה באתרים שונים (P, I, ו- D) נצפו, המדגישים השפעה עמוקה של מתח מכני. לכן, מודל זה של קוליטיס דמוי תקליטור יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים הפתוגניים של התקליטור, במיוחד את התפקיד של מתח מכני וביטוי גנים מכני המושרה בלחץ מכני בדיסרגציה חיסונית, פיברוזיס מעיים, ושיפוץ רקמות בתקליטור.

מבט מקרוסקופי על קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הטמעה תוך-קולונית של TNBS כפי שניתן לראות באיור 1, הטמעה תוך-קולונית של TNBS בחולדות גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (באורך של כ-2 ס"מ) עם דופן מעי מעובה ולומן מצומצם (היצרות) באתר ההחדרה במעי הגס הדיסטלי (איור 1A). האתר של הטמעת TNBS מכונה אתר I. כתוצאה מדלקת טרנסמורלית והיצרות, הן דלקת והן מתח מכני נמצאים באתר I. היצרות באתר אני הובילה להתנפחות לומן מסומנת בקטע הקרוב לאתר של הטמעת TNBS (אתר P) ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של מודל קוליטיס דמוי קרוהן במכרסמים. דלקת טרנסמולרית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS, והגדלה מכנית נצפתה במגזר הפרוקסימלי להיצרות. שינויים אלה מאפשרים ללמוד מתח מכני בקוליטיס.

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

אז בפרוטוקול שלנו, הטמעה תוך-מעיונית של TNBS מובילה לדלקת טרנסמולרית באתר ההחדרה וההתנפחות המכנית במגזר הקרוב לדלקת. אז זה מחקה מחלת קרוהן קצרנית. כמו קטע פרוקסימלי הוא נפוח מכנית אבל לא מראה דלקת גלויה, מחקר השוואתי של קטע הפרוקסימלי ואתר הדלקת מסייע לקבוע אם מתח מכני ממלא תפקיד קוליטיס של קרוהן.מחקרים קודמים מתמקדים באתר הדלקת בלבד. הפרוטוקול שלנו עובד על אתרים שונים במודל מדגיש תפקיד קריטי של מתח מכני במחלת קרוהן, במיוחד במחלת קרוהן סטנוטית. כדי להתחיל, מניחים את החולדות על שולחן ההרדמה בתנוחה סופית.כדי לגרום קוליטיס, להכניס כיתה רפואית, פתוחה, קטטר פוליאוריטן דרך פי הטבעת במשך כשבעה עד שמונה סנטימטרים מן הסף אנאלי, בעדינות להחדיר TNBS לתוך המעי הגס. נהל את חולדות הבקרה המזויפות עם 250 מיקרוליטרים של תמיסת מלח. כדי לסייע בהפצת TNBS או מלוחים ולהימנע מדליפות, לשמור על החולדות בתנוחה עלובה עם הראש שלהם פונה כלפי מטה בזווית של כ 30 מעלות, עם פי הטבעת סגור במשך שתי דקות.פתח את בטן החולדה באמצעות מספריים ומלקחיים בדרגה כירורגית. הסר בזהירות את המעי הגס כולו מעל התעלה האנאלית, והעבר את המעי הגס מיד למאגר HBSS קר כקרח 1x. יישר את נקודתיים במאגר ומדוד את אורך המעי הגס באמצעות סרגל.קח חוט ניילון, והקף אותו סביב המעי הגס כדי למדוד את ההיקף החיצוני של מקטעי המעי הגס בשליטה וחולדות שטופלו ב- TNBS. קח רקמות בעובי מלא להיסטולוגיה. חותכים את המעי הגס לאורך הלוח המזנטרי, ולנקות את המעי הגס ביסודיות עם מאגר HBSS.להעריך את המעי הגס עבור ציון דלקת מקרוסקופית בהתבסס על הקריטריונים המוגדרים מראש עם שינויים מינימליים. לאסוף דגימות רקמה המעי הגס מחולדות שטופלו TNBS באתרים P, I, ו- D.Site P הוא החלק שניים עד שלושה סנטימטרים לפני השוליים האוראליים של אתר הדלקת. אתר I הוא אתר הדלקת שבו TNBS הוא החדיר, בדרך כלל ארבעה עד שישה סנטימטרים מקצה המעי הגס.לבסוף, אתר D הוא החלק אחד עד שני סנטימטרים דיסטלי לשוליים של ביטול של אתר הדלקת. הטמעה תוך-מעיונית של TNBS בחולדות גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית באורך של כשני ס"מ עם דופן מעי מעובה ולומן מצומצם באתר ההחדרה במעי הגס הדיסטלי. האתר של הטמעת TNBS כונה אתר I.As תוצאה של דלקת טרנסמולרית והיצרות, הן דלקת והן מתח מכני היו נוכחים באתר I.The היצרות באתר I.The היצרות באתר אני הובילה להתנפחות לומן ניכרת במגזר הקרוב לאתר של הטמעת TNBS, המכונה אתר P.The היקף המעי הגס גדל באופן משמעותי באתרים P ואני השווה נקודתיים שליטה מזויפת.בעוד נפוח מכנית, אתר P לא הראה דלקת גלויה. להיפך, קטע המעי הגס דיסטלי להחדרת TNBS המכונה אתר D הציג לא דלקת ולא התנפחות מכנית. הציון המקרוסקופי של דלקת באתר I בחולדות שטופלו ב- TNBS גדל באופן דרמטי בהשוואה לבקרות מזויפות באתרים P ו- D של חולדות קוליטיס.ציוני הדלקת באתרים P ו- D לא גדלו באופן משמעותי בהשוואה לזיוף. לכן חשוב ללמוד לא רק אתר I אלא אתרים P ו- D במודל, שכן זה עוזר לזהות את המשמעות הפתוגנית של מתח מכני במחלת קרוהן. כדי לקבוע עוד יותר אם מתח מכני הוא גורם פתוגניים בדלקת המעיים, אפשר גם לנסות לשחרר נפיחות מכנית על ידי האכלת בעלי החיים אך ורק עם דיאטה נוזלית ולראות אם זה עוזר עם דלקת ותפקוד המעיים.

a-tnbs-induced-rodent-model-to-study-pathogenic-role-mechanical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Dextran נתרן סולפט (DSS) מנוהל במי השתייה הוא מודל הוקמה Murine פגיעה דלקתית חריפה של קוליטיס. פרוטוקול זה מתאר את שיטת הטיפול DSS והכנת רקמות.

קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS)

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

קוליטיס המושרה DNBS / TNBS מציע אלטרנטיבה ושיטה זולה ללמוד pathobiology של מחלות מעי דלקתיות. הפרוטוקול שנדון במאמר זה מתאר את היישום המוצלח של DNBS כדי לגרום לדלקת מעי גסה בעכברים וחולדות ומאפשר לאדם ללמוד ביסודיות את תגובות מעיים בתיווך מארחת.

מודלים DNBS / TNBS קוליטיס: מתן תובנות מחלת מעי דלקתי והשפעות של התזונה שומן

מודלים של בעלי החיים הוכיחו להיות כלי רב ערך בהגדרת מנגנונים ספציפיים מארח ופתוגן שתורמים להתפתחות של דלקת כרונית. כאן אנו מתארים מודל עכבר של זיהום אוראלי עם הפתוגן האנושי Porphyromonas gingivalis ומתודולוגיות פרט כדי להעריך את ההתקדמות של דלקת באתרים מקומיים ומערכתיים.

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

במחקר זה, אנו מתארים הליך מפורט של פיברוזיס בתיווך מעיים של TNBS, אשר מציג הפתופסולוגיה המקבילה ל-פיברוזיס של קרוהן. אנו גם דנים גישה זו לאור של rapamycin הקלה השפעות מעכבות על סיסטיק מעיים.

תובנה מכניסטית לתוך פיתוח של מעיים TNBS-תיווך פיברוזיס והערכת השפעות העכבות של Rapamycin

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מודל חולדה של pouchitis. מודל השקית האיליאלית נוצר על ידי ביצוע ניתוח אנסטומוזה אנאלי (IPAA) באמצעות טכניקות מיקרוכירורגיות. לאחר הניתוח, החולדה טופלה ב-4% דקסטרן סולפט נתרן (DSS) במשך 4 ימים.

מודל חולדה של פאוצ'יטיס לאחר כריתת פרוקטוקולקטומיה ואנסטומוזה אנאלי של כיס איליאלי באמצעות דקסטרן סולפט נתרן

פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן להשתמש במודל העכבר חסר 5'-אינוזיטול פוספטאז (SHIP) המכיל 5'-אינוזיטול פוספטאז (SHIP) של דלקת איליאלית ופיברוזיס דמויי מחלת קרוהן (CD) לבדיקת טיפולים חדשים ל-CD.

הערכת התערבויות טיפוליות במודל העכבר חסר SHIP של אילייטיס ופיברוזיס דמויי מחלת קרוהן

חקור מודל מכרסמים מושרה TNBS לחקר תפקיד המתח המכני בדלקת מעי כרונית. השיטה מאפשרת השוואה בין קטעים דלקתיים ללא דלקתיים ומדגימה את חשיבות המתח המכני בפתוגנזה של מחלת קרוהן.

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

גלה סרטונים נוספים