פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

פרוטוקול זה מראה כיצד טכניקת מסך הדנ"א משמשת לחקר דינמיקה של כרומטין, ובמיוחד לחקר הפונקציה המולקולרית של מלווים היסטון. טכניקת הדמיה של מולקולה בודדת בתפוקה גבוהה מסך DNA מתגבר על מגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשר הדמיה בזמן אמת, ומאפשר אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולות. הניחו נייר נקי בגודל 5 על 35 מילימטרים במרכז הסרט הדו-צדדי.

חבר את הסרט מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר. לאחר מכן הבלו את הנייר באמצעות להב נקי. הניחו מחליק כיסוי זכוכית על גבי הסרט הדו-צדדי, ושפשפו את החלקת הכיסוי באמצעות קצה פיפט ליצירת תא מיקרופלואידי.

מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ, וגזור אותן. אופים את תא הזרימה בתנור ואקום של 120 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. חבר את מחבר הנוזל לניתוח מבוסס שבב לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם.

ולחבר את שני הקווים של צינורות נעילת פיתוי. חברו מזרק מנעול פיתוי המכיל שלושה מיליליטר מים נטולי יונים, ושטפו את החדר. שטפו שוב את החדר עם שלושה מיליליטר של חיץ שומנים באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה.

הזריקו מיליליטר אחד של שומנים ביוטיניליים פי 0.04 במאגר השומנים, לתוך התא, בשתי זריקות, עם דגירה של חמש דקות לכל זריקה. הזריקו 0.025 מיליגרם למיליליטר סטרפטאווידין במיליליטר אחד של BSA, עם שתי יריות, ודגירה של 10 דקות לכל זריקה. הזריקו כ-30 פיקומולרי של דנ"א פאג' למבדה ביוטינילציה במיליליטר אחד של חיץ BSA, לתוך התא עם שתי יריות, ודגירות של 10 דקות לכל זריקה.

חברו מזרק המכיל 10 מיליליטר של חיץ הדמיה למשאבת מזרק, והסירו בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית. חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתא הזרימה. הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה, והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל השתקפות פנימית כוללת שנבנה בהתאמה אישית.

הזריקו 200 מיקרוליטר של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך 100 מיקרוליטר של לולאת דגימה כדי להכתים מולקולות DNA של למדא. הפעל תוכנת הדמיה, והפעל את הלייזר בגודל 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב. לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.

כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הכיבוי ודגרו במשך 15 דקות להעמסת היסטון על ידי Abo1. שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך חמש דקות. כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על הדנ"א.

היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות DNA בצבע אינטרפולציה. קווים ירוקים המוצגים במערכים מקבילים הצביעו על כך ש-YOYO1 המשולב במולקולות דנ"א היה מיושר היטב ונמתח במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית. כאשר דימרים Cy5-H3-H4 הוזרקו לתוך מסך הדנ"א בהיעדר Abo1, Cy5-H3-H4 לא נקשר לדנ"א, מה שמצביע על חוסר קשירה ספונטנית של דימרים H3-H4 לדנ"א.

כאשר Cy5-H3-H4 הוזרק עם Abo1, נקטה פלואורסצנטית אדומה נראתה על מולקולות DNA, מה שמרמז על כך ש-Abo1 טוען דימרים H3-H4 על DNA. האותות הפלואורסצנטיים נעלמו בהיעדר זרימת חיץ, והופיעו שוב כאשר הזרימה חודשה, מה שמרמז על כך שדימרים H3-H4 נקשרים לדנ"א. הקישור של דימרים H3-H4 לדנ"א אושר גם על ידי הקימוגרף, שבו אותות הפלואורסצנטיות נעלמו בכל פעם שהזרימה כובתה.

מעט פונקטה פלואורסצנטית הופיעה במסך הדנ"א, בין אם בהיעדר נוקלאוטיד או בנוכחות ADP, מה שמצביע על כך שדימרים H3-H4 לעיתים רחוקות נקשרים לדנ"א, לא במצב אפו ולא בנוכחות ADP. הניתוח הכמותי מראה כי מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א גדל בנוכחות ATP. התוצאות מצביעות על כך שהידרוליזה של ATP חיונית להעמסת H3-H4 על DNA על ידי Abo1.

הימנעות מהזרקת בועות לתא הזרימה היא הקריטית ביותר לכל השלבים. אז בפרוטוקול הזה, אנחנו שמים דגש על חיבורים טיפה אחר טיפה. ניתן להרחיב את בדיקת וילון הדנ"א לווילונות DNA בעלי קשירה כפולה עם ננו-תבניות כפולות.

בנוסף, אנו יכולים ליצור סוג אחר של מסך דנ"א עם דנ"א חד-גדילי, רנ"א או חוטי אקטין חד-גדילים. מסך הדנ"א מאפשר הדמיה של תנועת החלבונים על גבי הדנ"א ומאפשר לימוד על מנגנון חיפוש המטרה. ניתן להרחיב את מסך הדנ"א לחקר חילוף החומרים של הדנ"א, כולל שכפול ושעתוק.