Name: פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: גלה את מנגנון ההרכבה ההיסטונית בזמן אמת באמצעות טכניקת מסך DNA. שיטת הדמיה מולקולרית זו מאפשרת לחקור את תפקידו של Abo1 בדינמיקת כרומטין ב-S. pombe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מעריכים את התמיכה האדיבה ב- Abo1 וב- Cy5-H3-H4 על ידי פרופסור ג'י-ג'ון סונג, קרול צ'ו, Ph.D. וג'וון ג'אנג, Ph.D., ב- KAIST, דרום קוריאה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר (NRF-2020R1A2B5B01001792), קרן מחקר אינטרמורלית (1.210115.01) של המכון הלאומי למדע וטכנולוגיה של אולסן, והמכון למדע בסיסי (IBS-R022-D1).

1. הכנת תא הזרימה
<ol><li>הכינו שקופית סיליקה מאוחה מנוקה המכילה תבניות ננו-תעלות בהתאם לדוח25 שפורסם בעבר.<ol><li>קדחו שני חורים בקוטר 1 מ"מ במגלשת סיליקה מאוחה נקייה (איור 1A) באמצעות מקדח מצופה יהלום (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>הפקד 250 ננומטר של אלומיניום עבה (Al) על המגלשה באמצעות מרזב DC32 (ראה טבלת חומרים) עם 10 mTorr של גז ארגון.</li>
		<li>יש לצפות שכבה בעובי 310 ננומטר של 4% פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת ולאפות על פלטה חמה בטמפרטורה של 180°C במשך 3 דקות.</li>
		<li>צייר את תבניות ננו-תעלה על שכבת PMMA בין שני החורים באמצעות ליתוגרפיית קרן אלקטרונים (אלומה)33 עם זרם 0.724 nA ב- 80 kV. הערה: הארכיטקטורה והממדים של תבניות ננו-תעלות מוצגים באיור 1A.</li>
		<li>הסר את PMMA החשוף לאלומה על ידי השריית השקופיות בתמיסה המתפתחת (יחס של 1:3 של מתיל איזובוטיל קטון ואיזופרופנול, ראה טבלת חומרים) למשך 2 דקות.</li>
		<li>תחריט שכבות Al עם תחריט יונים תגובתי פלזמה מצומד אינדוקטיבי (ICP-RIE) באמצעות כלור (Cl2) וגזי בורון טריכלוריד (BCl 3). הערה: שני גזים אלה יכולים להסיר את ה-Al מאזורים החשופים לאלומות.</li>
		<li>חצבו ננו-תעלות במגלשות באמצעות גזי גופרית טטרה-פלואוריד (SF4), טטרה-פלואורומתאן (CF4) וגזי חמצן (O2) (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>הסר את שכבת Al הנותרת על ידי השריית השקופיות ב- Al etchant (מפתח AZ 300 GIF, ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות.</li>
		<li>לאחר הייצור, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, ובצעו סוניקציה באצטון למשך 30 דקות באמצעות סוניק מסוג אמבטיה.</li>
		<li>נקו את המגלשות בתמיסת Hellmanex III 2% (ראו טבלת חומרים) למשך יום אחד לפחות עם ערבוב מגנטי.</li>
		<li>החליקו את המגלשות באצטון במשך 30 דקות וב-1 M NaOH במשך 30 דקות ברציפות.</li>
		<li>יש לשטוף את המגלשות במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בגז חנקן (N2).</li>
	</ol></li>
	<li>שים נייר נקי (5 מ"מ x 35 מ"מ) על מרכז סרט דו-צדדי. חבר את סרט הדבק מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר.</li>
	<li>הבלו על הנייר באמצעות להב נקי (איור 1A).</li>
	<li>הניחו כיסוי זכוכית על גבי סרט הדבקה דו-צדדי ושפשפו את הכיסוי באמצעות קצה פיפטה כדי ליצור תא מיקרופלואידי (איור 1A).</li>
	<li>מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ וגזור אותן.</li>
	<li>אופים את תא הזרימה בתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות למשך 45 דקות.</li>
	<li>חבר את מחבר הנוזל (Nanoport) עבור ניתוחים מבוססי שבב (ראה טבלת חומרים) לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם וחבר את שני הקווים של צינורות נעילת Luer.</li>
	<li>חברו מזרק Luer lock המכיל 3 מ"ל מים נטולי יונים, ושטפו את החדר.</li>
	<li>שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים (20 מילימול של Tris-HCl, pH 8.0 ו-100 מילימול של NaCl) באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה. הערה: חיבור טיפה אחר טיפה מקשר את כל המזרקים לתא הזרימה כדי למנוע הזרקת בועות אוויר לתא.</li>
	<li>הזריקו 1 מ"ל של 0.04x שומן ביוטינילציה בחיץ שומנים לתוך התא בשתי יריות עם 5 דקות דגירה לכל זריקה. הערה: הכנת מלאי שומנים 1x biotinylated מתואר בדוחשפורסם בעבר 34.</li>
	<li>שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים ודגרו במשך 20 דקות כדי ששכבת השומנים תתבגר על משטח המגלשה.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מאגר BSA (40 מ"מ של Tris-HCl, pH 8.0, 50 מילימול של NaCl, 2 מילימול של MgCl2 ו- 0.2 מ"ג/מ"ל של BSA) ודגור במשך 5 דקות כדי להפוך את משטח המגלשה לפסיבי. הערה: שלב זה יכול להפחית את הקישור הלא ספציפי של חלבונים למשטח השקופית.</li>
	<li>הזריקו 0.025 מ"ג/מ"ל סטרפטאווידין ב-1 מ"ל של חיץ BSA עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל זריקה.</li>
	<li>שטפו את שאריות הסטרפטאווידין עם 3 מ"ל של מאגר BSA.</li>
	<li>הזריקו ~300 pM (30 μL) של DNA פאג' למבדה ביוטינילציה ב-1 מ"ל של חיץ BSA לתוך התא עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל ירייה. הערה: הכנת DNA של למבדה ביוטינילציה מתוארת בדו"ח34 שפורסם בעבר.</li>
</ol>2. חיבור תא זרימה למערכת המיקרופלואידית והטענתו על המיקרוסקופ
<ol><li>הכן מאגר הדמיה Abo1 (50 mM של Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM של NaCl, 1 mM של DTT, 1 mM של ATP, 2 mM של MgCl2, 1.6% גלוקוז, ו 0.1x של gloxy, ראה טבלה של חומרים). הערה: Gloxy היא מערכת לניקוי חמצן המפחיתה את ההלבנה של צבעים פלואורסצנטיים. הכנת מלאי גלוקסי 100x עם גלוקוז אוקסידאז וקטלאז מתוארת בהפניה35.</li>
	<li>חבר מזרק המכיל 10 מ"ל של חיץ הדמיה למשאבת מזרק והסר בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית.</li>
	<li>חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתוך תא הזרימה (איור 1B).</li>
	<li>הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ TIRF שנבנה במיוחד (איור 1C). זהירות: כאשר מכניסים את תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ, קבעו בזהירות את גובה עדשת המטרה. אסור שתא הזרימה ייגע בעדשת המטרה. זה יכול להזיק לעדשה.</li>
	<li>הורידו שמן תואם אינדקס במרכז תא הזרימה והניחו מנסרת יונה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים) על טיפת השמן.</li>
</ol>3. הרכבת היסטון על ידי Abo1 באמצעות וילון DNA
<ol><li>ערבבו 5 ננומטר של Abo1 ו-12.5 ננומטר של דימר היסטון H3-H4 עם תווית Cy5 (Cy5-H3-H4) (ראו טבלת חומרים) ב-150 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. כל החלבונים הוכנו בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר.</li>
	<li>דוגרים על התערובת על קרח במשך 15 דקות. הערה: כדי למנוע הלבנה של Cy5, הדגירה חייבת להיעשות בחושך.</li>
	<li>הזריקו ~20 pM (2 μL) של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך לולאת דגימה של 100 μL כדי להכתים מולקולות DNA של למדא.</li>
	<li>הפעל תוכנת הדמיה (ראה טבלת חומרים) והפעל את הלייזר של 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב. הערה: אם וילונות הדנ"א בנויים היטב, מולקולות הדנ"א, המוכתמות ב-YOYO-1, מוצגות כקווים מיושרים במחסום בנוכחות זרימה. הקווים המתוחים נרתעים ומתרחקים מהמכשול כאשר הזרימה כבויה.</li>
	<li>הזריקו 2 מ"ל של מאגר מלח גבוה (200 מילימול של NaCl ו-40 מילימול של MgCl2) כדי לסלק את צבע YOYO-1 מהדנ"א.</li>
	<li>לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.</li>
	<li>כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הסגירה ודגרו 15 דקות על העמסת היסטון על ידי Abo1.</li>
	<li>שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך 5 דקות.</li>
	<li>הפעל את שסתום הכיבוי וחדש את הזרקת הזרימה.</li>
	<li>הפעל את הלייזר של 637 ננומטר וצלם את החלבונים הפלואורסצנטיים בזמן שזרימת המאגר מופעלת.</li>
	<li>כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על דנ"א (איור 2C).</li>
	<li>אסוף תמונות מסך DNA באמצעות תוכנית לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים). הערה: כאשר זרימת החיץ נפסקת באופן זמני, הדנ"א נרתע מהשדה האוונסנטי של השתקפות פנימית כוללת, וחלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לדנ"א נעלמים.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>המר את התמונות שצולמו על-ידי התוכנית לרכישת תמונות לתבנית TIFF כרצפי תמונות. הערה: כל הנתונים נותחו באמצעות תמונה J (NIH) כמתואר בהפניה20.</li>
	<li>בחרו מולקולת דנ"א בודדת מתוך רצפי התמונות וציירו קימוגרף. הערה: הקימוגרף יכול להראות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות של כל חלבון היסטון הקשור למולקולת דנ"א יחידה כפונקציה של זמן.</li>
	<li>צור את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות מהקימוגרף והתאם אותו למספר פונקציות גאוסיות.</li>
	<li>אסוף את הקואורדינטות המרכזיות של הפסגות מפרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות. בשלב זה, ניתן להשיג את העוצמה המינימלית של פלואורסצנטיות היסטון.</li>
	<li>חלק את כל עוצמות השיא שנאספו מהפרופילים בעוצמה מינימלית. מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א מוערך בשלב זה.</li>
	<li>בצע שלבים 4.2-4.5 עבור מולקולות דנ"א אחרות.</li>
	<li>צור היסטוגרמה להתפלגות הקישור של דימרים H3-H4 בגודל סל של 1 kbp. מספר המולקולות שנותחו הוא לפחות 300.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כטכניקת הדמיה של מולקולה יחידה, נעשה שימוש נרחב בווילון הדנ"א כדי לחקור תגובות מטבוליות של דנ"א43. וילון DNA הוא מערכת היברידית המשרשרת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ו-TIRFM. שלא כמו טכניקות אחרות של מולקולות בודדות, מסך DNA מאפשר הדמיה בזמן אמת בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA. לכן, טכניקת מסך הדנ"א מתאימה לחקירת המנגנון מאחורי אינטראקציות מולקולריות, כולל קשר ספציפי לרצף, תנועת חלבונים יחד עם דנ"א, והתנגשות חלבון-חלבון בדנ"א 17,20,26.</su...

דנ"א אאוקריוטי ארוז במבנה מסדר גבוה יותר המכונה כרומטין 1,2. נוקלאוזומים הם היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מכ-147 bp DNA העוטפים את אבני הליבה האוקטמריות 3,4. כרומטין ממלא תפקיד קריטי בתאים אאוקריוטים; לדוגמה, המבנה הקומפקטי מגן על הדנ"א מפני גורמים אנדוגניים ואיומים אקסוגניים5. מבנה הכרומטין משתנה באופן דינמי בהתאם לשלב מחזור התא ולגירויים סביבתיים, ושינויים אלה שולטים בגישה לחלבונים במהלך עסקאות DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון6. דינמיקה של כרומטין חשובה גם ליציבות גנומית ולמידע אפיגנטי.
הכרומטין מווסת באופן דינמי על ידי גורמים שונים, כולל שינויים בזנב היסטון ומארגני כרומטין כגון משפצי כרומטין, חלבונים מקבוצת פוליקומב ומלווי היסטון7. מלווים היסטון מתאמים את ההרכבה והפירוק של נוקלאוזומים באמצעות שיקוע או ניתוק של אבני ליבה 8,9. פגמים במלווים היסטון גורמים לאי יציבות גנומית וגורמים להפרעות התפתחותיות וסרטן 9,10. מלווי היסטון שונים אינם זקוקים לצריכת אנרגיה כימית כמו הידרוליזה ATP כדי להרכיב או לפרק נוקלאוזומים 9,11,12,13. לאחרונה, חוקרים דיווחו כי ATPases המכיל ברומודומיין AAA+ (ATPase הקשור לפעילויות תאיות מגוונות) ממלאים תפקיד בדינמיקה של כרומטין כמו מלווים היסטון 14,15,16,17. ATAD2 אנושי (חלבון המכיל תחום AAA ממשפחת ATPase 2) מקדם את נגישות הכרומטין כדי לשפר את ביטוי הגנים18. כמווסת שעתוק משותף, ATAD2 מווסת את הכרומטין של גורמי שעתוק אונקוגניים14, וביטוי היתר של ATAD2 קשור לפרוגנוזה גרועה בסוגים רבים של סרטן19. Yta7, ההומולוג Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) של ATAD2, מפחית את צפיפות הנוקלאוזומים בכרומטין15. לעומת זאת, Abo1, ההומולוג Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) של ATAD2, מגביר את צפיפות הנוקלאוזומים16. באמצעות טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת, וילון DNA, השאלה אם Abo1 תורם להרכבת נוקלאוזומים או פירוקו מטופלת17,20.
באופן מסורתי, התכונות הביוכימיות של ביומולקולות נבדקו על ידי ניסויים בתפזורת כגון בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA) או קו-אימונומשקעים (co-IP), שבהם נבדקים מספר רב של מולקולות, ותכונותיהן הממוצעות מאופיינות21,22. בניסויים בתפזורת, תת-מצבים מולקולריים מוסווים על ידי אפקט ממוצע האנסמבל, וחקירת אינטראקציות ביומולקולריות מוגבלת. לעומת זאת, טכניקות של מולקולות בודדות עוקפות את המגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשרות אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולריות. בפרט, נעשה שימוש נרחב בטכניקות הדמיה של מולקולות בודדות כדי לחקור אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון23. טכניקה אחת כזו היא מסך DNA, טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה אחת המבוססת על מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM)24,25. במסך דנ"א, מאות מולקולות דנ"א בודדות מעוגנות לדו-שכבה השומנית, המאפשרת תנועה דו-ממדית של מולקולות דנ"א עקב נזילות השומנים. כאשר זרימה הידרודינמית מופעלת, מולקולות דנ"א נעות לאורך הזרימה על הדו-שכבה ונתקעות במחסום דיפוזיה, שם הן מיושרות ונמתחות. בעוד שהדנ"א מוכתם בחומרים משתלבים, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי מוזרקים, ו-TIRFM משמש לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת23. פלטפורמת מסך הדנ"א מאפשרת תצפית על תנועות חלבונים כגון דיפוזיה, טרנסלוקציה והתנגשות 26,27,28. יתר על כן, וילון DNA יכול לשמש למיפוי חלבונים על דנ"א עם מיקומים, כיוונים וטופולוגיות מוגדרות או מיושם לחקר הפרדת פאזה של חלבונים וחומצות גרעין 29,30,31.
בעבודה זו, טכניקת מסך הדנ"א משמשת כדי לספק ראיות לתפקודם של מלווים באמצעות הדמיה ישירה של חלבונים ספציפיים. יתר על כן, מכיוון שמסך DNA הוא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה, הוא מאפשר איסוף נתונים בהיקף מספיק לאמינות סטטיסטית. כאן, הוא מתואר כיצד לבצע את בדיקת מסך ה- DNA בפירוט כדי לחקור את התפקיד המולקולרי של S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1 'x 3' זכוכית שקופיות סילקה התמזגה</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 אינץ' x 3 אינץ' מלבני ועובי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים</td></tr><tr><td>18:1 כובע ביוטיניל PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים</td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק לואר-לוק</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>שסתום הזרקת דגימה 6 כיוונים</td><td>IDEX</td><td>MX סדרה II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-Resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אצטון SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום (Al)</td><td>TASCO, דרום קוריאה</td><td>קוטר LT50AI414</td><td>4 אינץ', עובי 1/4 אינץ'</td></tr><tr><td>מסנן Amicon Ultra צנטריפוגלי, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF מפתח</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>משמש להסרת להב אלומיניום</td></tr><tr><td></td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 מ"מ x 6 מ'</td></tr><tr><td>בורון טריכלוריד (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>טוהר: >99.99%</td></tr> <tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא</td><td>C40-1g</td><td>זהו רכיב של 100x גלוקסי מלאי</td></tr><tr><td>כלור (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>טוהר: >99.99%</td></tr> <tr><td>סרט דו צדדי שקוף</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC מקרטע</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>משמש לתצהיר אלומיניום על מגלשה</td></tr><tr><td>מקדח מצופה יהלום</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>משמש ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dove-prism</td><td>Korea Electro-Optics Co. Ltd.</td><td>1906-106</td><td>מנסרת יונה סיליקה מותכת בהתאמה אישית עם ציפוי נגד השתקפות</td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>משמשת ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת</td></tr><tr><td>Electron Bean Lithography</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>אתילן-דיאמין-חומצה טטראצטית (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי אצבעות</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת צינורות נעילת לואר</td></tr><tr><td>אגוז זכר ללא אוגן</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת מייבש הקפאה של צינורות luer-lock</td></tr><tr><td>, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>משמש לליופיליזציה של חלבונים נוזליים</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא</td><td>G2133-50KU</td><td>זהו מרכיב של מלאי גלוקסי 100x</td></tr><tr><td>גואנידיניום הידרוכלוריד</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>חברת המילטון</td><td>80065</td><td>מזרק זה משמש להזרקת דגימה</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>משמש ל- FPLC (אי הכללת גודל)</td></tr> <tr><td>בוחש פלטה חמה</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>משמש לשמן תואם אינדקס Tris-HCl</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>תחריט יונים תגובתי פלזמה בשילוב אינדוקטיבי</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>משמש לאינדוקציה של &beta;-galactosidase</td></tr><tr><td>פעילות Lambda פאג'</td><td>DNA NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>מדיה לצמיחת תאי E.coli</td></tr><tr><td>מתאם Luer 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>זה מחבר luer-lock מזרק וצינורות</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>מתיל איזובוטיל קטון (MIBK)</td><td>KAYAKU חומרים</td><td></td> מתקדמים <td>המשמשים לפיתוח מיקרוסקופ תמיסה</td></tr><tr><td>(Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כיסוי זכוכית</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 מ"מ (מס' 1)</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>קצה קרקע זכוכית שקופית 45&deg;, רגיל 26 x 76 מ"מ</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>סוג טבילה: מים, הגדלה: 60x, תיקון: 18, מרחק עבודה: 0.29 (0.31-0.28)</td></tr> <tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS מוכשר כימית E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>תא מוכשר לביטוי יתר של חלבונים</td></tr><tr><td>חמצן (O2)</td><td>NOBLEGAS, דרום קוריאה</td><td></td><td>טוהר: >99.99%</td></tr> <tr><td>צינורות PFA טבעיים</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>הוא מחובר עם "אביזרי אצבעות" ליצירת צינורות נעילת לואר</td></tr><tr>מעכב<td>פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>Roche</td><td>11359061001</td><td>מעכב</td></tr> <tr><td>פרוטאזSephacryl S-200 Cytiva ברזולוציה גבוהה</td><td></td><td>17-0584-01</td><td>משמש עבור FPLC (אי הכללת גודל)</td></tr> <tr><td>שסתום כיבוי</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ממברנה מולקולרית ספקטרה/פור, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum</td><td>laboratories 132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>גופרית טטרלפלואוריד (SF4)</td><td>NOBLEGAS, דרום קוריאה</td><td></td><td>טוהר: >99.99%</td></tr> <tr><td>משאבת מזרק</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tetrafluoromethane (CF4)</td><td>NOBLEGAS, דרום קוריאה</td><td></td><td>טוהר: >99.99%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>משמש עבור Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>משמש להרכבת FPLC (חילופי יונים)</td></tr> <tr><td>איחוד</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>זה מחבר צינורות</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמה</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>תנור ואקום</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>צבע אינטרקלציה זה מדולל ב-DMSO</td></tr><tr><td>&-mercaptoethanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך dna

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

כרומטין הוא מבנה מסדר גבוה יותר שאורז דנ"א אאוקריוטי. הכרומטין עובר שינויים דינמיים בהתאם לשלב מחזור התא ובתגובה לגירויים סביבתיים. שינויים אלה חיוניים לשלמות הגנומית, לוויסות אפיגנטי ולתגובות מטבוליות של DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון. הרכבת הכרומטין חיונית לדינמיקה של הכרומטין והיא מזורזת על ידי מלווים של היסטון. למרות מחקרים מקיפים, המנגנונים שבאמצעותם מלווים בהיסטון מאפשרים הרכבת כרומטין נותרו חמקמקים. יתר על כן, התכונות הגלובליות של נוקלאוזומים המאורגנים על ידי מלווים היסטון אינן מובנות היטב. כדי להתמודד עם בעיות אלה, עבודה זו מתארת טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת בשם מסך DNA, המאפשרת לחקור את הפרטים המולקולריים של הרכבת נוקלאוזומים על ידי מלווים היסטון. מסך DNA היא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לספק פלטפורמה אוניברסלית להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. באמצעות וילון DNA נחקרת פונקציית מלווה ההיסטון של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase, ומתגלה המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הרכבת ההיסטון של Abo1. וילון DNA מספק גישה ייחודית לחקר דינמיקת הכרומטין.

עבודה זו מתארת את הליך הכנת תאי הזרימה לבדיקת מסך הדנ"א (איור 1A). בדיקת מסך הדנ"א אפשרה את המחקר של הרכבת דימר היסטון H3-H4 על DNA על ידי Abo1. ראשית, היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות דנ"א ב-YOYO-1, צבע מצטלב. קווים ירוקים הוצגו במערכים מקבילים, מה שמצביע על כך ש-YOYO-1 הצטלב למולקולות דנ"א, שהיו מיושרות היטב ונמתחו במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית (איור 2A). כדי לשלול את האפשרות ש-YOYO-1 מעכב את האינטראקציה של DNA וחלבוני היסטון, YOYO-1 הוסר ...

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

פרוטוקול זה מראה כיצד טכניקת מסך הדנ"א משמשת לחקר דינמיקה של כרומטין, ובמיוחד לחקר הפונקציה המולקולרית של מלווים היסטון. טכניקת הדמיה של מולקולה בודדת בתפוקה גבוהה מסך DNA מתגבר על מגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשר הדמיה בזמן אמת, ומאפשר אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולות. הניחו נייר נקי בגודל 5 על 35 מילימטרים במרכז הסרט הדו-צדדי.חבר את הסרט מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר. לאחר מכן הבלו את הנייר באמצעות להב נקי. הניחו מחליק כיסוי זכוכית על גבי הסרט הדו-צדדי, ושפשפו את החלקת הכיסוי באמצעות קצה פיפט ליצירת תא מיקרופלואידי.מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ, וגזור אותן. אופים את תא הזרימה בתנור ואקום של 120 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. חבר את מחבר הנוזל לניתוח מבוסס שבב לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם.ולחבר את שני הקווים של צינורות נעילת פיתוי. חברו מזרק מנעול פיתוי המכיל שלושה מיליליטר מים נטולי יונים, ושטפו את החדר. שטפו שוב את החדר עם שלושה מיליליטר של חיץ שומנים באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה.הזריקו מיליליטר אחד של שומנים ביוטיניליים פי 0.04 במאגר השומנים, לתוך התא, בשתי זריקות, עם דגירה של חמש דקות לכל זריקה. הזריקו 0.025 מיליגרם למיליליטר סטרפטאווידין במיליליטר אחד של BSA, עם שתי יריות, ודגירה של 10 דקות לכל זריקה. הזריקו כ-30 פיקומולרי של דנ"א פאג' למבדה ביוטינילציה במיליליטר אחד של חיץ BSA, לתוך התא עם שתי יריות, ודגירות של 10 דקות לכל זריקה.חברו מזרק המכיל 10 מיליליטר של חיץ הדמיה למשאבת מזרק, והסירו בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית. חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתא הזרימה. הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה, והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל השתקפות פנימית כוללת שנבנה בהתאמה אישית.הזריקו 200 מיקרוליטר של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך 100 מיקרוליטר של לולאת דגימה כדי להכתים מולקולות DNA של למדא. הפעל תוכנת הדמיה, והפעל את הלייזר בגודל 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב. לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הכיבוי ודגרו במשך 15 דקות להעמסת היסטון על ידי Abo1. שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך חמש דקות. כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על הדנ"א.היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות DNA בצבע אינטרפולציה. קווים ירוקים המוצגים במערכים מקבילים הצביעו על כך ש-YOYO1 המשולב במולקולות דנ"א היה מיושר היטב ונמתח במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית. כאשר דימרים Cy5-H3-H4 הוזרקו לתוך מסך הדנ"א בהיעדר Abo1, Cy5-H3-H4 לא נקשר לדנ"א, מה שמצביע על חוסר קשירה ספונטנית של דימרים H3-H4 לדנ"א.כאשר Cy5-H3-H4 הוזרק עם Abo1, נקטה פלואורסצנטית אדומה נראתה על מולקולות DNA, מה שמרמז על כך ש-Abo1 טוען דימרים H3-H4 על DNA. האותות הפלואורסצנטיים נעלמו בהיעדר זרימת חיץ, והופיעו שוב כאשר הזרימה חודשה, מה שמרמז על כך שדימרים H3-H4 נקשרים לדנ"א. הקישור של דימרים H3-H4 לדנ"א אושר גם על ידי הקימוגרף, שבו אותות הפלואורסצנטיות נעלמו בכל פעם שהזרימה כובתה.מעט פונקטה פלואורסצנטית הופיעה במסך הדנ"א, בין אם בהיעדר נוקלאוטיד או בנוכחות ADP, מה שמצביע על כך שדימרים H3-H4 לעיתים רחוקות נקשרים לדנ"א, לא במצב אפו ולא בנוכחות ADP. הניתוח הכמותי מראה כי מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א גדל בנוכחות ATP. התוצאות מצביעות על כך שהידרוליזה של ATP חיונית להעמסת H3-H4 על DNA על ידי Abo1.הימנעות מהזרקת בועות לתא הזרימה היא הקריטית ביותר לכל השלבים. אז בפרוטוקול הזה, אנחנו שמים דגש על חיבורים טיפה אחר טיפה. ניתן להרחיב את בדיקת וילון הדנ"א לווילונות DNA בעלי קשירה כפולה עם ננו-תבניות כפולות.בנוסף, אנו יכולים ליצור סוג אחר של מסך דנ"א עם דנ"א חד-גדילי, רנ"א או חוטי אקטין חד-גדילים. מסך הדנ"א מאפשר הדמיה של תנועת החלבונים על גבי הדנ"א ומאפשר לימוד על מנגנון חיפוש המטרה. ניתן להרחיב את מסך הדנ"א לחקר חילוף החומרים של הדנ"א, כולל שכפול ושעתוק.

deciphering-molecular-mechanism-histone-assembly-dna-curtain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטת Hi-C מאפשר זיהוי משוחדת, גנום רחב של אינטראקציות הכרומטין (1). Hi-C זוגות קשירת סמיכות וסדר מקבילי מאסיבי. הנתונים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד אדריכלות גנומית בקני מידה מרובות: התוצאות הראשוניות זיהו תכונות כגון בשטחים כרומוזום, הפרדה של הכרומטין פתוח, סגור, מבנה הכרומטין בקנה מידה megabase.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

חבילת תוכנת 3DNA היא כלי פופולרי ביואינפורמטיקה ותכליתית עם יכולות לנתח, לבנות, ולדמיין מבני חומצות גרעין תלת ממדיים. מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים לקבוצת משנה של תכונות חדשות והפופולריות זמינות ב3DNA, החלים על שני מבנים והרכבים של מבנים הקשורים בודדים.

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

שיטה מוצגת לכינון מחדש של מערכי nucleosomal מודל מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. אנו גם מתארים כיצד ניסויי מהירות שקיעה בultracentrifuge האנליטיות, ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משמשים לניטור לאחר הכינון מחדש את מידת הרוויה מערך nucleosomal.

הרכבה של nucleosomal מערכים מההיסטונים ליבת רקומביננטי והנוקלאוזום המיקום DNA

ניתן להשיג נזק ממוקד ל-DNA על ידי קשירת גורם מזיק ל-DNA לאוליגונוקלאוטיד היוצר טריפלקס (TFO). באמצעות TFOs ששונו, ניתן לחקור אסוציאציות חלבון ספציפיות לנזק ל-DNA ושינוי טופולוגיית DNA בתאים אנושיים על ידי שימוש במבחני משקעים חיסוניים של כרומטין שונה ומבחני סלילת על של DNA המתוארים כאן.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה את מנגנון ההרכבה ההיסטונית בזמן אמת באמצעות טכניקת מסך DNA. שיטת הדמיה מולקולרית זו מאפשרת לחקור את תפקידו של Abo1 בדינמיקת כרומטין ב-S. pombe.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

גלה סרטונים נוספים