Name: בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: למדו לבודד מיקרוגליה ראשונית מלקחי דמיאלינציה במוח עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית. שיטה זו מאפשרת חקר מאפייני מיקרוגליה בתוך הגוף ומייעלת משאבים מחקריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי קרן בית החולים טונג'י (HUST) למדען צעיר מעולה (מענק מס '2020YQ06).

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונגג'י, אוניברסיטת הואז'ונג למדע וטכנולוגיה, סין.
1. חומרים
<ol><li>הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול.<ol>
<li>הכינו את מאגר ההעמסה על ידי הוספת סרום בקר עוברי (FBS, 2%) לתמיסת מלח מואצרת פוספט (PBS).</li>
		<li>הוסף צבע אדום נייטרלי (NR) (1 סופי%) ל- PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את הפתרונות הבאים באמצעות ערכת הדיסוציאציה של המוח למבוגרים הזמינה מסחרית (ראה טבלת החומרים).<ol>
<li>כדי להכין תערובת אנזימים 1, פיפטה 1.9 מ"ל של Buffer Z ו-50 μL של אנזים P לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.</li>
		<li>כדי להכין תערובת אנזימים 2, פיפטה 20 μL של Buffer Y ו-10 μL של אנזים A לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הכן את הפתרון להסרת פסולת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קליטת עכברים וכריתתם
<ol><li>באופן תוך-צפקי (i.p.) להזריק לעכבר 500 μL של 1% צבע NR ב- PBS 2-3 שעות לפני ההרדמה. הערה: הזרקה תוך-צפקית של NR במודלים של עכברים מתפרקים עוזרת להבחין בנגעים (איור 1).</li>
	<li>מרדימים את העכבר עם פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), וודאו שהעכבר מורדם בהצלחה על ידי בחינת תגובות הכאב.</li>
	<li>פתח את חלל החזה של העכבר וחשוף את הלב.</li>
	<li>חתכו פינה קטנה של האטריום הימני בזהירות והטביעו את העכבר באופן תוך-לבי עם 20-30 מ"ל של PBS קר מהחדר השמאלי.</li>
	<li>ערפו את העכבר בהרדמה.</li>
	<li>פתח את גולגולת העכבר ושחרר בזהירות את המוח מהגולגולת.</li>
	<li>העבירו את המוח לתבנית פרוסת המוח של העכבר וחתכו את המוח לפרוסות של 0.1 ס"מ.</li>
	<li>מוציאים את פרוסות המוח ומניחים אותן ב-PBS קר בצלחת פטרי (60/15 מ"מ). מיקרו-דיסקציה של הנגעים המסומנים על ידי צבע NR סביב קורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים מיקרוכירורגיים. הערה: ודא שהרקמה המנותחת שלמה ככל האפשר כדי להקל על ההעברה שלאחר מכן; יש להשלים את התקדמות הנתיחה הכוללת תוך 2 שעות.</li>
	<li>העבר את הרקמה המנותקת לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל המכילים את הכמות המתאימה של חיץ טעינה קר. הערה: אסוף את רקמת הקורפוס קלוסום מ-2-3 עכברים יחד בצינור אחד כדגימה אחת.</li>
</ol>3. דיסוציאציה של רקמות
<ol><li>צנטריפוגה הרקמה המנותקת ב 300 ×g במשך 30 שניות (לאחר שהגיע למהירות זו) כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.</li>
	<li>תערובת אנזים קדם-חימום 1 ותערובת אנזימים 2 עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.</li>
	<li>הוסיפו 1,950 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 1 לדגימה אחת ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>מוסיפים 30 μL של תערובת אנזימים מחוממת מראש 2 ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>מעכלים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומערבבים בעדינות כל 5 דקות.</li>
	<li>מוסיפים 4 מ"ל של PBS קר לצינור לאחר העיכול ומנערים בעדינות.</li>
	<li>הניחו מסנני 70 מיקרומטר על צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל והניחו מראש את המסננים עם 500 μL של PBS קר. לסנן את הרקמה המנותקת על ידי העברת דגימות הרקמה המעוכלות דרך המסננים, ולהעביר את ההשעיה המסוננת בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הערה: דלג על שלב זה אם כמות הרקמה קטנה מדי.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות הרקמה המסוננות ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושואף את supernatant לאט ושלם. הערה: יש לבצע את כל השלבים על קרח למעט העיכול האנזימטי.</li>
</ol>4. פינוי פסולת
<ol><li>בצעו החייאה של גלולת התא בעדינות עם 1,550 μL של PBS קר.</li>
	<li>מוסיפים 450 μL של תמיסה קרה להסרת פסולת ומערבבים היטב.</li>
	<li>שכבו את התערובת הנ"ל לאט ובעדינות רבה עם 2 x 1 מ"ל של PBS קר באמצעות פיפטה של 1,000 μL. הערה: הטה את צינור הצנטריפוגה ב- 45 ° והוסף באיטיות PBS לאורך דופן הצינור עם הפיפטה.</li>
	<li>מעבירים את הצינור לאט ובעדינות לצנטריפוגה ומסובבים ב-4 מעלות צלזיוס ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות.</li>
	<li>חפשו שלוש שכבות לאחר צנטריפוגה. שאפו את שתי השכבות העליונות לחלוטין על ידי שימוש בפיפטה של 1,000 μL (איור 2).</li>
	<li>מלאו את הצינור עד 5 מ"ל עם חיץ טעינה קר והפכו בעדינות את הצינור שלוש פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-1,000 × גרם למשך 10 דקות. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהימנע משיבוש כדור התא.</li>
</ol>5. הפרדה מגנטית של תאים מיקרוגליאליים
<ol><li>בצעו שימוש חוזר בכדור התא עם 90 μL של מאגר טעינה והוסיפו 10 μL של חרוזי CD11b (Microglia).</li>
	<li>מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של מאגר טעינה ופיפטה את הנוזל בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 μL כדי לשטוף את התאים לאחר הדגירה. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-300 × גרם למשך 10 דקות ושואפים את הסופרנאטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא מאוגדים.</li>
	<li>בצעו החייאה של התאים ב-500 μL של מאגר טעינה.</li>
	<li>מקם את העמודה MS עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.</li>
	<li>שטפו את העמודה ב-500 μL של מאגר טעינה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי בהתבסס על פרוטוקול היצרן.</li>
	<li>החל את תרחיף התא על עמודת הטרשת הנפוצה והשליך את ה-flowthrough המכיל תאים ללא תווית.</li>
	<li>הוסיפו 500 μL של מאגר טעינה לעמודה שלוש פעמים כדי לשטוף תאים שנצמדים לדופן העמודה ולהשליך את אורך הזרימה. הערה: הוסף מאגר טעינה חדש לשטיפה רק כאשר מאגר העמודות ריק לחלוטין.</li>
	<li>הסר את העמוד מהמפריד לאחר שטיפת העמוד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מאגר טעינה לעמודה ודחף את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף את התאים המסומנים באופן מגנטי. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי לאסוף לחלוטין את התאים המסומנים באופן מגנטי.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול מציע שיטה לבודד מיקרוגליה סביב נגעי demyelinating, אשר יכול לעזור לחקור את המאפיינים הפונקציונליים של microglia במחלות demyelinating דלקתיות. מיקרוגליה שצולמה באמצעות חרוזי CD11b מפגינה טוהר וכדאיות גבוהים. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים לוקליזציה מדויקת של מוקדים וטיהור מיקרוגליאלי אופטימלי. בשלב פרוטוקול 2.1, יש צורך להזריק את תמיסת NR 2 שעות לפני הקרבת העכבר כדי להבטיח כי הנגעים יכולים להיות מוצגים במדויק20. בשלב פרוטוקול 2.8, ננקטה הקפדה על הנחת מקטעי רקמת המוח על קופסת קרח לצורך כרי...

מקורם של המיקרוגליה הוא באבות חלמון-שק, המגיעים למוח העוברי מוקדם מאוד ומשתתפים בפיתוח מערכת העצבים המרכזית 1,2. לדוגמה, הם מעורבים בגיזום סינפטי3 ובוויסות הצמיחה האקסונלית4. הם מפרישים גורמים המקדמים הישרדות עצבית ומסייעים ללוקליזציה עצבית5. במקביל, הם מעורבים בהסרת תאים לא תקינים ותאים אפופטוטיים כדי להבטיח התפתחותמוחית תקינה 6. בנוסף, ככל שהתאים הכשירים לחיסון של המוח, מיקרוגליה חושפת ללא הרף את הפרנכימה המוחית כדי לנקות תאים מתים, סינפסות לא מתפקדות ופסולת תאית7. הוכח כי הפעלה מיקרוגליאלית ממלאת תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות, מחלות נוירודגנרטיביות וגידולי מוח. מיקרוגליה מופעלת בטרשת נפוצה (MS) תורמת להתמיינות של תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים (OPCs) ולהתחדשות של מיאלין על ידי בליעת פסולת מיאלין8.
במחלת אלצהיימר (AD), הצטברות של עמילואיד בטא (Aβ) מפעילה מיקרוגליה, המשפיעה על התפקודים הפאגוציטיים והדלקתיים של מיקרוגליה9. מיקרוגליה מופעלת ברקמת הגליומה, הנקראת מיקרוגליה הקשורה לגליומה (GAM), יכולה לווסת את התקדמות הגליומה ובסופו של דבר להשפיע על הפרוגנוזה של חולים10. ההפעלה משנה באופן עמוק את השעתוק המיקרוגליאלי, וכתוצאה מכך שינויים מורפולוגיים, ביטוי של קולטני מערכת החיסון, פעילות פגוציטית מוגברת והפרשת ציטוקיניםמשופרת 11. ישנן תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה מופעלת במחלות נוירודגנרטיביות כגון מיקרוגליה הקשורה למחלה (DAM), מיקרוגליה בתגובה פעילה (ARM) ופנוטיפ נוירודגנרטיבי מיקרוגליאלי (MGnD)8.
באופן דומה, תת-קבוצות תפקודיות דינמיות מרובות של מיקרוגליה מתקיימות גם הן יחד במוח במחלות דלקתיות12. הבנת ההטרוגניות בין תת-קבוצות שונות של מיקרוגליה חיונית כדי לחקור את הפתוגנזה של מחלות דלקתיות ולמצוא את האסטרטגיות הטיפוליות הפוטנציאליות שלהן. ההטרוגניות של המיקרוגליה תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית8. חיוני לתאר את השינויים המולקולריים של המיקרוגליה במדויק לחקר ההטרוגניות. ההתקדמות בטכנולוגיית ריצוף ה-RNA החד-תאי (RNA-seq) אפשרה לזהות את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה פעילה בתנאים פתולוגיים13. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים היא קריטית להמשך חקירה של תאי המטרה האלה בתנאים ספציפיים.
מחקרים שבוצעו כדי להבין את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה הם בדרך כלל מחקרים במבחנה, שכן נמצא כי מספר גדול של מיקרוגליה ראשונית ניתן להכין ולתרבת ממוחות של גורים עכברים (בני 1-3 ימים), אשר מתחברים לצלוחיות התרבית וגדלים על משטח הפלסטיק עם תאי גליה מעורבים אחרים. לאחר מכן, ניתן לבודד מיקרוגליה טהורה על סמך ההדבקה השונה של תאי גליה מעורבים14,15. עם זאת, שיטה זו יכולה רק לבודד מיקרוגליה מהמוח הפרינטלי ונמשכת מספר שבועות. משתנים פוטנציאליים בתרבית תאים עשויים להשפיע על מאפיינים מיקרוגליאליים כגון ביטוי מולקולרי16. יתר על כן, מיקרוגליה המבודדת בשיטות אלה יכולה להשתתף רק בניסויים במבחנה על ידי הדמיית התנאים של מחלות CNS ואינה יכולה לייצג את המאפיינים והתפקודים של מיקרוגליה במצבי מחלה in vivo. לכן, יש צורך לפתח שיטות לבידוד מיקרוגליה ממוח העכבר הבוגר.
מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) והפרדה מגנטית הם שתי שיטות בשימוש נרחב, אם כי יש להם מגבלות שונות משלהם 16,17,18,19. היתרונות והחסרונות שלהם בהתאמה יהיו מנוגדים בסעיף הדיון. ההבשלה של טכנולוגיית MACS מציעה את האפשרות לטהר במהירות תאים. Huang et al. פיתחו שיטה נוחה לתיוג נגעים demyelinating במוח20. בשילוב שתי הגישות הטכניות הללו, אנו מציעים פרוטוקול הפרדה מגנטית מהיר ויעיל CD11b, המספק תיאור שלב אחר שלב כדי לבודד את המיקרוגליה סביב נגעים מתפרקים במוחות של עכברים בוגרים ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה. נגעי הדמילינאט המוקד נגרמו על ידי הזרקה סטריאוטקטית של 2 μL של תמיסת ליזולצית'ין (1% LPC ב-0.9% NaCl) בקורפוס קלוסום 3 ימים לפני תחילת הפרוטוקול21. פרוטוקול זה מניח את היסודות לביצוע השלב הבא בניסויים במבחנה. יתר על כן, פרוטוקול זה חוסך זמן ונשאר אפשרי לשימוש נרחב בניסויים שונים.

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה מיקרו 1.5 מ"ל</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; m מסנן</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של מוח למבוגרים, עכבר וחולדה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>SJA Labs</td> CD11b (מיקרוגליה) חרוזים<td></td><td></td></tr><tr><td>, אדם ועכבר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מפריד MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>עמודות MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>אדום ניטרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Flow Cytometer</td><td>מערכת Agilent</td><td></td><td>A המורכבת של חלקים שונים</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של demyelination

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

מיקרוגליה, תאי החיסון המולדים במוח, הם המגיבים העיקריים לדלקת או לפציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS). ניתן לחלק את המיקרוגליה למצב מנוחה ולמצב מופעל והוא יכול לשנות את המצב במהירות בתגובה למיקרו-סביבה של המוח. מיקרוגליה תופעל בתנאים פתולוגיים שונים ותציג פנוטיפים שונים. בנוסף, ישנן תת-קבוצות רבות ושונות של מיקרוגליה מופעלת והטרוגניות רבה בין תת-קבוצות שונות. ההטרוגניות תלויה בעיקר בייחודיות המולקולרית של המיקרוגליה. מחקרים גילו כי מיקרוגליה תופעל ותמלא תפקיד חשוב בתהליך הפתולוגי של דמילינציה דלקתית. כדי להבין טוב יותר את המאפיינים של מיקרוגליה במחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה, אנו מציעים פרוטוקול מיון מיקרוגליאלי ראשוני. פרוטוקול זה משתמש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטית טוררית (MACS) כדי להשיג מיקרוגליה ראשונית מטוהרת מאוד ולשמר את המאפיינים המולקולריים של מיקרוגליה כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרוגליה במחלות דלקתיות.

מיקרוגליה מבודדת באמצעות חרוזי CD11b בעלי טוהר גבוה תאים מיקרוגליאליים סביב הנגעים במודלים של עכברי דמילינציה בודדו באמצעות הפרוטוקול הנ"ל ונבדקו על ידי ציטומטריה של זרימה. התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי עם CD11b-פלואורסציין איזותיוציאנט (FITC) ו-CD45-אלופיקוקיאנין (APC) כדי לקבוע מיקרוגליה בציטומטריה של זרימה על פי הוראות היצרן. ישנן ספרות רבות המדגימות כי נוגדנים CD11b ו- CD45 מספיקים כדי לבדוק את טוהר המיקרוגליההמבודדת 19,22. הפיצוי הפלואו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

פרוטוקול זה מסייע לבודד את המיקרוגליה מהנגעים הדו-מיניים של מוח העכבר הבוגר כדי לחקור את המאפיינים המיקרוגליאליים in vivo. טכניקה זו חוסכת זמן ויש לה דרישות נמוכות יותר הן לנסיינים והן לציוד. שיטה זו מסייעת לבודד מיקרוגליה ממוח החיה, במיוחד אלה רקמות microdissected במצבי מחלה שונים.התחל על ידי מיקרו-הבחנה של הנגעים המסומנים על ידי צבע נייטרלי סביב קורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ. צנטריפוגה את הרקמה המנותקת ב 300 פעמים g במשך 30 שניות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור. אנזים קדם-חימום מערבב אחד ואנזים מערבב שתיים עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.לאחר מכן, הוסיפו 1, 950 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שחוממו מראש דגימה אחת לשנייה, ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים מחוממת מראש שניים, ומערבבים בעדינות. לאחר העיכול, להוסיף ארבעה מיליליטרים של PBS קר לצינור, ולנער בעדינות.צנטריפוגה של הרקמה דוגמת ב-300 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ושואפת את הסופרנאטנט לאט ובאופן מלא. בצעו החייאה של גלולת התא בעדינות עם 1, 550 מיקרוליטרים של PBS קר. מוסיפים 450 מיקרוליטרים של הפתרון הקר להסרת פסולת, ומערבבים אותם היטב.השתמשו בפיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לכסות את התערובת לאט מאוד, ובעדינות עם שני מיליליטרים של PBS קר. צנטריפוגה את התערובת, ולאחר מכן לחפש את שלוש השכבות. השתמש בפיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לשאוף לחלוטין את שתי השכבות העליונות, ולמלא את הצינור עד חמישה מיליליטרים עם מאגר טעינה קר.הפכו בעדינות את הצינור שלוש פעמים. לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה ושאיפה של הסופרנטנט, החיזרו את גלולת התא עם 90 מיקרוליטרים של מאגר טעינה, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של חרוזי CD11b. מערבבים היטב, ודוגרים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר ההעמסה, ושטפו את התאים על ידי צנרת עדינה של הנוזל למעלה ולמטה עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. צנטריפוגה של התאים ב-300 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ושואפים את הסופרנטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא מאוגדים. בצעו שימוש חוזר בתאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר הטעינה, והניחו את עמודת הטרשת הנפוצה עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.שטפו את העמודה ב-500 מיקרוליטרים של מאגר ההעמסה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי בהתבסס על פרוטוקול היצרן. החל את תרחיף התא על עמודת הטרשת הנפוצה, והשליך את הזרימה המכילה את התאים ללא תווית. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר הטעינה כדי לשטוף את העמודה ולהסיר אותה מהמפריד.מקם את העמודה על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, והוסף מיליליטר אחד של מאגר הטעינה לעמודה. לבסוף, דחפו את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף החוצה את התאים המסומנים באופן מגנטי. ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הגטינג המשמשת בניתוח ציטומטריה של זרימה של מיקרוגליה שבודדה מנגעי דמילינציה של עכברים בוגרים לפני ואחרי מיון התאים המופעלים על ידי מגנטית מוצג כאן.התמונות הגרפיות מייצגות את גובה הפיזור הקדמי ואת גובה הפיזור הצדדי לבחירת תאים, אזור פיזור קדימה וגובה פיזור קדימה לבחירת תאים בודדים, ו- CD11b-FITC ו- CD45-APC לבחירת התאים המיאלואידיים והמיקרוגליה. שיעור המיקרוגליה גדל באופן משמעותי לאחר מיון התאים המופעלים על ידי מגנטית. התמונה הגרפית מייצגת את אסטרטגיית הגטינג המשמשת בניתוח ציטומטריה של זרימה עבור תאים בודדים חיים ומתים לאחר מיון התאים המופעלים מגנטית.כאן, 7-aminoactinomycin D וגובה פיזור צד שימשו לבחירת התאים החיים. בעת ניסיון הליך זה, זכור לנתח במדויק את הנגעים demyelinating תחת סטריאומיקרוסקופ המבוסס על סימנים אדומים ניטרליים.

isolation-mouse-primary-microglia-magnetic-activated-cell-sorting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי אוליגודנדרוציטים ראשוניים מתרחיף תא עצבי המתקבל מגור עכבר באמצעות הפרדה מגנטית. הטכניקה עושה שימוש בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים ספציפיים לאנטיגנים אוליגודנדרוציטים, המאפשרים בידוד סלקטיבי של תאים אלה.

בידוד אוליגודנדרוציטים ראשוניים באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

הקמנו מודלים של העכבר לויקומלציה periventricular (PVL), את הפגיעה במוח השולט על פגים מאופיין periventricular נגעים בחומר הלבן. היפוקסיה / איסכמיה עם / בלי זיהום מערכתי הם הגורמים העיקריים של PVL. קשירת הראש חד צדדית וחשיפה היפוקסיה עם / בלי זריקה lipopolysaccharide יוצר PVL כמו נגעים בעכברים P6.

עכבר מודלים של לויקומלציה periventricular

למדו לבודד מיקרוגליה ראשונית מלקחי דמיאלינציה במוח עכברים בוגרים באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית. שיטה זו מאפשרת חקר מאפייני מיקרוגליה בתוך הגוף ומייעלת משאבים מחקריים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

גלה סרטונים נוספים