זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

טכניקה זו מאפשרת זיהוי של התאים בעלי יכולות פולשניות שונות בהשפעת גורמים מופרשים מתאים סטרומליים בתרבית משותפת. הטכניקה מעריכה את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת התאים. זה גם מאפשר התאוששות וניתוח של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות הנמצאות בתערובות תאים הטרוגניות.

הטכניקה יכולה לקבוע אילו גידולים מכילים תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים שמובילים לגרורות. לכידה וניתוח של תאים סרטניים פולשניים עשויים לקבל החלטות טיפוליות מושכלות. כדי להתחיל את תרבית התאים, שטפו את תרביות תאי ההדבקה במפגש של כ-70% עם מלח 1X חסום פוספט.

לאחר מכן הוסף תמיסת 0.05% טריפסין ו- EDTA כדי להרים את התאים. נטרלו את תמיסת הטריפסין בעזרת מדיה של תרביות תאים המכילה סרום וספרו את התאים באמצעות אליקווט של תרחיף התא. הניחו את כל שלושת התאים הסטריליים במכסה המנוע של תרבית הרקמה.

אתרו את הידית בצד הקצר של החדר התחתון וכיוונו את התא התחתון כך שהידית תפנה אל הנסיין. הוסף 30, 000 עד 50, 000 תאים ב-90 מיקרוליטרים של מדיה לכל באר מהתא התחתון מבלי ליצור בועות. השתמשו ב-5% מהתוספים של סרום בקר עוברי בשני תאים תחתונים כבקרה חיובית לתנועתיות התאים, והשתמשו ב-0% במדיה של תוספי סרום כבקרה שלילית.

סובבו את התא התחתון ב-90 מעלות לאחר שנתנו לו להסתפק במשך 10 עד 15 דקות במכסה המנוע. לאחר מכן הניחו את החדר האמצעי למעלה כך שהידית בתא התחתון תחליק לתוך החריץ שבחדר האמצעי. דחפו את התא אנכית כלפי מטה עד שנשמע קליק מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.

הוסיפו 160 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לכל הבארות של החדר האמצעי. ודאו שמניסקוס בצורת כיפה נראה לעין לאחר מילוי בארות והניחו את התא העליון עם אלקטרודות הפונות כלפי מטה אל החדר האמצעי כדי ליישר את הנקודות הכחולות בתאים האמצעיים והעליונים. דחפו את התא אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.

הוסיפו 20 עד 50 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לתא העליון. הרכיבו את ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי באינקובטור תרביות הרקמה והמתינו 30 דקות לפני מדידת הרקע. פתח את תוכנת מנתח התאים, לאחר מכן בחר את העריסה לשימוש, ולאחר מכן לחץ על לשונית ההודעה, וודא שכתוב עליה חיבורים בסדר "כדי להבטיח שהמערך ממוקם היטב בעריסה והאלקטרודות מיושרות היטב עם החיישנים.

לחץ על לשונית הערות הניסוי ומלא את כל המידע האפשרי על הניסוי. לאחר מכן לחץ על כרטיסיית הפריסה ומלא את התיאור של פריסת המערך. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים והוסף שני שלבים מתפריט השלבים, שלב רקע עם טאטוא אחד ושלב בדיקה עם 100 טאטואים.

לאחר שהמערך נמצא באינקובטור מנתח התאים הדו-תכליתי במשך 30 דקות, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידת הרקע. לאחר סיום מדידת הרקע, הסר את המערך מהעריסה והנח אותו בחזרה במכסה המנוע של תרבית התאים. לאחר מכן הוסיפו 30, 000 עד 50, 000 תאים ב-100 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום לכל באר של החדר העליון.

אלה הם התאים שהאלקטרודה תזהה ברגע שהם יעברו בהצלחה דרך הממברנה. תנו למכלול לעמוד במכסה המנוע במשך 30 דקות לפני ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה. מקם את המערך בחזרה למנתח התאים הדו-תכליתי ובדוק את לשונית ההודעה עבור ההודעה 'חיבורים בסדר'.

לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל מדידת עכבה ולאחר מכן לחץ על כרטיסיית העלילה כדי לעקוב אחר התקדמות האות. אם נקודת הקצה מגיעה לפני 25 שעות, לחץ על שלב הביטול מהתפריט הנפתח 'הפעל'. כדי לייצא נתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחר העתק בתבנית הרשימה ולאחר מכן הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני.

עקוב אחר קצב ההעברה בזמן אמת על מנתח התאים הדו-תכליתי כדי לקבוע את נקודת העצירה של העניין. לאחר שהושגו, שחררו את ההרכבה ממנתח התאים הדו-תכליתי והניחו אותו במכסה המנוע של תרבית הרקמה. הכן מספר מתאים של 1.5 מיליליטרים של צינורות microcentrifuge כדי לאסוף את התאים מבארות העניין.

מניחים את המכלול בצלחת של 10 ס"מ כדי להכיל נוזלים כאשר התאים מתנתקים. דוחפים את קצוות ההצמדה הגמישים בצד הארוך של החדר האמצעי פנימה עד שנשמע צליל לחיצה, ולאחר מכן מפרקים את התא העליון והופכים אותו לתבשיל חדש של 10 סנטימטרים. השתמשו במרים תאים עם להב של 13 מילימטר כדי לאסוף את התאים מכל הבארות עם אותו מצב ניסיוני.

יש לשטוף או לטבול את הלהב בתמיסת מלח 1X דחוסה בפוספט כדי לאסוף את התאים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובבו את התאים ב-500 פעמים G למשך חמש דקות והפיצו את התאים שנאספו או בצעו ניתוח נקודות קצה כגון ריצוף RNA חד-תאי. הערכה של פלישה לתאים בנוכחותם או בהיעדרם של תאים סטרומליים הראתה כי פלישת תאי MDA-MB-231 שופרה כאשר זן הפיברובלסטים של Swiss-3T3 המוקרן J2 ישב בתא התחתון לצורך החלפת גורמים בין שני קווי התאים.

באופן מעניין, הפלישה ל-MDA-MB-231 גדלה כאשר מספרם של תאי 3T3 J2 הוכפל. מצד שני, נראה כי קצב הפלישה של שיבוט פולשני של תאי MCFDCIS, DCIS-Delta Four, מעוכב על ידי הצלבה עם תאי 3T3 J2, מה שמרמז על יישום רב ערך של מערך שלושת התאים למדידת השפעות משתנות של הסטרומה. במקרה זה, פיברובלסטים על פלישת תאים.

תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי היו פולשניים יותר בתגובה לגורמים המופרשים על ידי תאי MDA-MB-231, בניגוד לאלה שהופרשו על ידי תאי DCIS, מה שעולה בקנה אחד עם יכולתם של גידולים פולשניים לגייס תאי אנדותל להיווצרות כלי דם ולהפצה מאוחרת יותר למחזור הדם. פלישת תאי קסנוגרפט שמקורם בחולה מהתא העליון גדלה בתגובה לתאי חיסון של מח עצם אנושי בתרבית משותפת. באופן מעניין, נוכחות של 2% סרום בתא התחתון עם תאי החיסון של מח העצם האנושי הייתה חיונית לפלישה של קסנוגרפטים שמקורם בחולים.

ניתן לצפות את הבארות במטריצה חוץ-תאית כדי לחקות את מחסום קרום המרתף. ניתן להוסיף סוכנים טיפוליים לתקשורת בבארות כדי לעקוב אחר השפעתם על הפלישה.