מיקרו-דיסקציה של שכבה של עלוני שסתומים טריקוספידיים לאפיון מכני דו-אקסיאלי וכימות מיקרו-סטרוקטורלי
February 10th, 2022
פרוטוקול זה מתאר את האפיון המכני הדו-אקסיאלי, כימות קולגן מבוסס הדמיה של תחום תדרים מרחביים מקוטבים, ומיקרו-הבחנה של עלוני מסתמים טריקוספידיים. השיטה שסופקה מבהירה כיצד שכבות העלון תורמות להתנהגויות העלון ההוליסטיות.
שיטה זו יכולה לבודד את התרומות של שכבות הרקמה להתנהגות הרקמה הכוללת, ולספק תובנה חדשה לגבי המיקרו-מבנה של הרקמה. מסגרת המיקרו-דיסקציה והבדיקה שלנו מאפשרת לנו להשוות באופן ישיר את התכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות של עלוני מסתמי הלב לשכבות המורכבות שלהם. המיקרו דיסקציה יכולה להיות קשה לשליטה, ולכן, מומלץ מאוד לתרגל כמה שיותר לפני השקת המחקר שלך.
ראשית, לאסוף את החומרים הנדרשים, לוח שעווה, מים DI, פיפטה, אזמל, מיקרו מספריים, מלקחיים דקים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עבים וסיכות. שחררו את הרקמה מהבודק הדו-אקסיאלי ומדדו את עוביה באמצעות חיישן תזוזת הלייזר. מניחים את הרקמה על לוח השעווה.
בדוק את הצד החדרי של הרקמה עבור תוספות צ'ורדה גדולות. צלם תמונה לעיון. מורחים את הרקמה שטוחה על לוח השעווה כאשר האטריאליס פונה כלפי מעלה.
כדי להצמיד את הרקמה ללוח, הניחו סיכה אחת בזווית הרחק מהרקמה בכל פינה, כך שהיא מושכת מעט את הרקמה. ודא כי הפינים נמצאים מחוץ לחורים שנוצרו על ידי הטינים בעת הרכבת הרקמה והרקמה היא מרובעת ואינה זזה במהלך המיקרו-דיסקציה של השכבה. במידת הצורך, מניחים סיכות לאורך צד הרקמה במהלך הנתיחה כדי למתוח את הרקמה יותר.
הסר את סמני חרוזי הזכוכית. הניחו את מי ה-DI על פני השטח של הרקמה עם פיפטה, כך שהם מכסים לחלוטין את הרקמה באופן דמוי בועה. כדי להפוך את הפינה הראשונית, בחר פינה של הדגימה המוצמדת, תוך הימנעות מהכנסות צ'ורדה גדולות באזורים שבירים.
לאחר מכן, חתכו את שכבת ה-A/S על ידי גרירה קלה של האזמל מעל משטח הרקמה לאורך חורי ההרכבה לצורך בדיקה מכנית. הקצוות של החתך מתחילים להתפרק, וחושפים את שכבת ה-F/V שמתחת. עם מלקחיים קהים ודקים, לשפשף בחוזקה לאורך החתך כדי להפריד עוד יותר את קצוותיו.
אם החתך בשכבת ה-A/S אינו מתחיל להתפרק, יש לעקוב בקלילות אחר אותו חתך שוב עם אזמל. בצע חתך שני בניצב לחתך הראשון. אם שני החתכים אינם מחוברים, הפעילו את הפינצטה הדקה מתחת לאזור הרקמה הקטן המפריד בין שני החתכים.
לאחר מכן, בזהירות להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה. משפשפים לאורך חתכי הפינה עם מלקחיים דקים עד שהרקמה נפרדת משכבת ה-F/V. ברגע שפיסת רקמה קטנה מופרדת, תפסו אותה בפינצטה הגדולה ומשכו אותה בעדינות כדי להפריד את השכבות המורכבות עוד יותר.
ממשיכים לקלף את הרקמה תוך כדי אחיזתה בפינצטה גדולה יותר כדי למנוע קריעה וקריעה לא רצויים של השכבה המורכבת A/S, ושפשפו את התפר עד שהוא מגיע לקצה שני החתכים המיועדים לפינה. אם בפינה הראשונה יש בעיות משמעותיות בהפרדה, נסה פינה אחרת כנקודת התחלה. לאחר מכן, כדי ליצור פינה שנייה, הרחיבו את שני החתכים שנעשו עבור הפינה הראשונה על ידי הנחת קצה האזמל בתחתית כל חתך וגרירתו קלות לאורך משטח הרקמה, כך שהרחבות החתך יתחברו לחתכים המקוריים וימשיכו לעקוב אחר חורי הטין או התפר.
יש להמשיך להאריך את החתכים ולקלף את שכבת ה-A/S המורכבת העליונה לאחור תוך כדי שפשוף התפר עד לסיום צד אחד. שימו לב שהרקמה תופרד לחלוטין לאורך חתך אחד. לאחר מכן, צור פינה שנייה בניצב לסוף הצד המקולף במלואו.
הרחיבו את החתכים הנותרים תוך הימנעות מהכנסות צ'ורדה גדולות. אל תכלול את תוספות הכורדה מאזור ההפרדה A/S רק כאשר אי הכללה זו תאפשר דגימת A/S גדולה מספיק לאפיונים ניסיוניים. המשך להפריד בין שכבות ה-A/S וה-F/V באמצעות טכניקות השפשוף והמשיכה שבהן נעשה שימוש עבור הפינה הראשונה.
יש להפסיק להפריד את הרקמה באופן מיידי אם נוצר קרע או חור. כדי למנוע לכידת פינצטה, הניחו את המספריים בכל חור שנוצר וחתכו את הרקמה מהמרכז. אם הפגם נוצר לאורך התפר של ההפרדה, ואז להתחיל להפריד את הרקמה לאורך קצה אחר.
חפשו קשרים בין-שכבתיים שעשויים להופיע בעת הפרדת הרקמה ומנעו הפרדת רקמות נוספת. שימו לב שמדובר בגדילים דקים אך חזקים שיש לחתוך בזהירות באמצעות מספריים. הימנעו מיצירת חור בשכבת ה-A/S או מחיתוך כלפי מטה לשכבת ה-F/V.
המשך בתהליך זה עד להפרדת הדגימה הגדולה ביותר האפשרית של שכבת ה- A/S. סמן את כיוון הדגימה באמצעות העט הכירורגי. לבסוף, חתכו לאורך תפר ההפרדה עבור קצה הרקמה הנותר עם המספריים.
מניחים את השכבה המורכבת המופרדת A/S שטוחה על משטח החיתוך. במידת הצורך, השתמש באזמל כדי ליישר את קצוות הרקמה וליצור צורת רקמה מרובעת המתאימה לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית. מניחים את שכבת ה-A/S במי DI עד שהיא מוכנה לבדיקה.
סמן את הכיוון של שכבת ה-F/V שנותרה על לוח השעווה. חתכו את הריבוע הגדול ביותר האפשרי מתוך השטח שבו הוסרה שכבת ה-A/S. לאחר מכן, הניחו אותו במי DI.
ניתוח היסטולוגי של העלון השלם ושתי השכבות המנותחות אימת אם הרקמה הופרדה כהלכה לאורך הגבול בין הספונטיוסה לפיברוסה. המיקרוגרפים ההיסטולוגיים שימשו לקביעת עובי שכבת הרקמה ושברי המסה המרכיבים אותה באמצעות תוכנת ImageJ. הבדיקה המכנית מבוקרת והעיבוד שלאחר העיבוד יצרו מתח ממברנה לעומת נתוני מתיחה של העלון הקדמי של המסתם הטריקוספידי, העלון האחורי של המסתם הטריקוספידי ועלון המחיצה של המסתם הטריקוספידי, המתארים את ההתנהגות המכנית הלא ליניארית של הרקמה.
נתוני ההדמיה של תחום התדרים המרחביים המקוטבים הניבו מפות צבע של כיוון סיבי הקולגן ומידת האניזוטרופיה האופטית. באופן ספציפי, מפות צבע אלה סיפקו הבנה מקיפה של ארכיטקטורת סיבי הקולגן בכל דגימת הרקמה. חשוב לציין כי השכבה המורכבת מתכווצת ברגע שהם מופרדים מהרקמה המוצמדת.
אסוף את הדגימה הגדולה ביותר האפשרית כדי להבטיח שיש מספיק רקמה לבדיקה הבאה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לביצוע אפיון מכני דו-צירית וכימות קולגן של דפנות מסתם תלת-פסיגי. הוא מספק תובנות לגבי תרומת שכבות העלים לתופעות ההתנהגות הכלליות של העלים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- מכניקת רקמות
רקע
- הבנת מכניקת מסתמי הלב חיונית לבריאות הלב וכלי הדם.
- טכניקות מיקרו-ניתוח יכולות לחשוף את תרומת שכבות הרקמה.
- כימות קולגן מסייע בהערכת תכונות הרקמה.
- בדיקות מכניות מספקות תובנות לגבי התנהגות הרקמה.
מטרת המחקר
- לבודד את תרומת שכבות הרקמה להתנהגות הכללית.
- להשוות בין מאפיינים מכניים ומיקרו-מבניים של דפנות מסתם הלב.
- לשפר את ההבנה של המיקרו-מבנה של מסתם הלב.
שיטות ששימשו
- בדיקה מכנית דו-צירית של דפנות מסתם תלת-פסיגי.
- הדמיה דומיין תדר מרחבית מקוטבת לכימות קולגן.
- מיקרו-ניתוח של שכבות רקמה לניתוח מפורט.
- שימוש בכלים ספציפיים כגון סכין ניתוח ופורצפס לביצוע הניתוח.
תוצאות עיקריות
- תרומות מבודדות של שכבות רקמה שונות נמדדו בהצלחה.
- מאפיינים מכניים השתנו באופן משמעותי בין השכבות.
- כימות קולגן סיפק תובנות לגבי מבנה הרקמה.
- המתודולוגיה מאפשרת השוואה ישירה של שכבות מורכבות.
מסקנות
- המחקר משפר את ההבנה של מכניקת מסתם הלב.
- טכניקות מיקרו-ניתוח דורשות תרגול להשגת יכולת מקצועית.
- התובנות שהושגו יכולות לסייע במחקר עתידי בתחום הקרדיווסקולרי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Layer-specific mechanical and microstructural quantification of tricuspid valve leaflets addresses a critical gap in understanding tissue-level determinants of valve function and failure. This protocol enables direct comparison of intact and dissected leaflet layers, supporting predictive modeling and mechanistic de-risking in early cardiovascular device and therapeutic development. The approach enhances portfolio decision-making by providing high-resolution data for computational model validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue-layer contributions to overall valve mechanics for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying layer-specific biomechanical and microstructural properties.
- Provides data to refine computational models, increasing predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue samples for reproducible mechanical and imaging assays.
- Standardizes measurement of membrane tension and collagen architecture across tissue layers.
- Enables quantitative outputs for downstream screening of biomaterials or device-tissue interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microstructural and biomechanical data with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of valve repair or replacement strategies by clarifying tissue mechanics.
- Provides a framework for biomarker discovery linked to tissue integrity and function.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-fidelity tissue data for model development, assay validation, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific leaflet layers in valve function and pathology.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical and microstructural readouts for assay development.
- Analytics: Provides membrane tension-stretch curves and collagen orientation maps for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by aligning tissue mechanics with disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for tissue characterization across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based research.
- Operational Value: Standardizes tissue dissection and testing for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device or therapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated tissue mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and tissue handling for reproducible results.
- Needs access to biaxial mechanical testers, imaging systems, and histological analysis tools.
- Demands cross-team standardization of dissection and measurement protocols.
- May require adaptation for different valve types or species-specific tissues.
- Sample size and tissue integrity can limit downstream testing and analysis.
