מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

שיטה זו מאפשרת לכמת שינויים בתכונות הפיזיקליות של דופן תא הצמח במהלך ההתפתחות ולקשר את השינויים המיקרוסקופיים הללו לצמיחה של איבר שלם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה פולשנית ואינה דורשת כל טיפול המאפשר כימות in vivo של תכונות פיזיקליות של דופן התא להוסיף רזולוציה תת תאית מהירה יחסית. כדי להתחיל, להפיץ שכבה דקה של דבק סיליקון לתוך צלחת פטרי עם כיסוי להחליק ולהשאיר אותו באוויר במשך 45 שניות.

בעזרת פינצטה, מניחים את השתיל על הדבק ומכוונים את כיוונו כדי למנוע מגע בין החלקים הבולטים של השתיל, לבין הקנטילבר. לאחר מכן לחץ את השורש בעדינות לשכבת דבק הסיליקון כדי לקשור אותו בחוזקה. השאר אותו למשך 45 שניות, והוסף את פתרון 1X PBS.

הרכב את תותח הסיליקון ניטריד הסטנדרטי עם קצה פירמידלי לתוך מחזיק הבדיקה AFM לנוזל, ויישר את הלייזר על הקנטילבר קרוב למיקום הקצה. לאחר מכן הזיזו את דיודת הצילום כדי למקם את נקודת הלייזר במרכז הגלאי. כייל את רגישות הסטייה על ידי ביצוע כניסה בגודל רמפה של 3 מיקרומטר, קצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה וסף טריגר של 0.5 וולט.

ודא שהבדיקה אינה מקיימת אינטראקציה עם הדגימה וכייל את קבוע הקפיץ של הקנטילבר. באמצעות כלי הכוונון התרמי, לחץ על כיול ואחריו כוונון תרמי או על סמל המנגינה התרמית בסרגל הכלים nano scope והזן את טמפרטורת הקנטילבר. לאחר בחירת טווח תדרים, לחץ על כפתור נוזל המתנד ההרמוני של הדגימה.

לאחר מכן, לחץ על נתונים שנרכשו בלוח המנגינה התרמית. כעת, התאם את רוחב המסנן החציוני לשלושה. התאם את רוחב ה-PSD כדי להפחית את הרעש בנתונים הנרכשים על-ידי ממוצע והגדר גבולות התאמה סביב שיא התהודה הראשון.

לחץ על חשב קבוע קפיץ K, ולאחר מכן לחץ על כן בחלון המוקפץ, ושאל אם המשתמש רוצה להשתמש בערך זה. באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך בהגדלה של פי 10, 20 ו-40 של חלקי העין, מקם את גשושית ה-AFM על פני השטח של התא האפידרמלי המוארך הרביעי של השורש הראשוני כדי להבטיח למקם אותו במרכז התא. עם הערך הקבוע של הקפיץ שחושב בעבר מתקבלים עקומות כוח בגודל רמפה של 3 מיקרומטר, סף טריגר של 11 ננו-ניוטון, וקצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה בנקודות נבחרות.

השג עקומות כוח משלושה תאים לכל שורש עבור כל טיפול ולכוד לפחות 150 עקומות כוח עבור כל שורש. תרשים זה מראה תוצאה צפויה כאשר ניסוי כניסת כוח נערך על דגימות חיות הממוקמות במרכז התא של אזור התא של התא של אזור התא של התא. כאשר קצה ה-AFM מתחיל להיכנס, פני השטח של דופן התא, הכוח מתחיל לעלות בגלל התנגדות דופן התא להשמצה.

עליית הכוח נמשכת עד להגעה לערך הכוח המרבי. לאחר נקודה זו, חלק הפריקה של הכניסה מתחיל. הכוח גדל בעקבות פרבולה בחלק הכניסה, שחשוב להתאים כל עקומה למודל החיזוי של שקעים פירמידליים המשמשים לחישובים.

כפרמטר מתאים, מיקום נקודת המגע צריך להתאים למשטח דופן התא לפני הכניסה ונחשב למקור של תזוזת קצה AFM. עקומות כוח שבהן אי אפשר לזהות את נקודת המגע לפני הכניסה יש להשליך. יתר על כן, עקומת הטעינה והפריקה של ניסוי כניסת הכוח חייבת להיות נטולת רעש.

לאחר התאמת כל עקומת כוח למודל, התקבלו היסטוגרמות שהראו את התפלגות התדירות של הערכים המתקבלים של המודולוס של יאנג לכאורה. היסטוגרמה זו מראה את התדירות המתקבלת עם קבוצה של 201 כניסות מוצלחות על תשעה תאים שונים של שלושה צמחים שונים של קולומביה זירו שגדלו בתנאי בקרה. הזחה עלולה להיות קשה עבור חלק מהגנוטיפים בשל המורפולוגיה של השורש.

לדוגמה, המוטציה הכפולה TTL 1 PRC 1-1 גדלה בסטרס אוסמוטי חמור. היסטוגרמות אלה מראות את התפלגות ההסתברות של הערכים המתקבלים של המודולוס של יאנג לכאורה מתשעה תאים שונים. רק היסטוגרמה H המתאימה לתא אחד יכולה להיות מותאמת להתפלגות גאוס.

המתכת המוצגת כאן יכולה להיות משולבת עם טכניקות אחרות כגון מחקרי קצב גידול או ניתוח ההרכב הכימי של דופן התא. טכניקות אחרות אלה ישלימו עוד יותר את המידע כדי להבין כיצד ההרכב הכימי על התכונות הפיזיקליות של דופן התא משפיע על צמיחת איבר.