הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

ספקטרוסקופיית תהודה של פלסמון פני השטח נקבעה לקביעת ליגנד חלבון באופן בעל תפוקה בינונית. מוצגות זיקות שונות לגרסאות אתר קשירה של אותה מולקולה, כלומר לאוליגוזכרידים הגבוהים הקושרים ברזל על וירוסים. SPR היא טכניקה נטולת תוויות לחקר קשירה מקרומולקולרית בזמן אמת של קולטנים משותקים על פני השטח.

אינטראקציות מרובות אתרים מוכרות בניתוח הקינטי על ידי קשירה תחרותית ללא תלות בגודל האזורים הספציפיים במחקר המשתמשים ב- SPR הם פיתוח תרופות לחיפוש מעכבים או אפיון נוגדנים. קבועים קינטיים וזיקות מחושבים ישירות מתגובת החיישן. כדי להתחיל, להעביר 100 microliters של התמיסה על צלחות LB-agar ולהפיץ אותו בעדינות באמצעות מפזר תאים סטריליים.

התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית דנ"א דו-גדילי הנעים בין חמישה ל-50 ננוגרם תוך שמירה על ריכוז פריימר קבוע. לאחר מכן הוסיפו את אנזים ההגבלה DpnI מתחת לשכבת השמן המינרלי ודגרו מיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לעיכול הדנ"א הדו-גדילי של ההורים. כדי להפשיר את התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue, יש להפשיר את התאים לצינור תחתון קטן ועגול מקורר מראש.

לאחר מכן, העבר מיקרוליטר אחד של הדנ"א החד-גדילי שטופל ב-DpnI מכל תגובת בקרה ודגימה לאליקוטים נפרדים של התאים העל-טבעיים אשר מסנתזים את הגדיל המשלים. לאחר מערבולת תגובות הטרנספורמציה בזהירות כדי לערבב, לדגור את התגובות על הקרח במשך 30 דקות. יש להפעיל את דופק החום על תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ולאחר מכן להניח את התגובות על הקרח למשך שתי דקות.

לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר של מרק NZY+דגירה של תגובות הטרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-225 עד 250 סל"ד למשך שעה. לאחר מכן, צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה על לוחות LB Ampicillin Agar כפי שהודגם קודם לכן. עבור תרבית זרעים, לחסן כמות קטנה של אמפיצילין המכיל מדיה LB עם מושבה אחת מן הצלחת מותמרת.

באמצעות תרבית הלילה, לחסן את תרבות הביטוי עם תוספים הכוללים 10 מילימולאר של מגנזיום כלוריד, 10 מילימולאר של מגנזיום גופרתי, ו 20 מילימולאר של גלוקוז, דילול תרבית הזרעים לאחד על 100. לאחר מכן, לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 מעלות צלזיוס ל 600 ננומטר סופג בין 0.4 ל 0.6 לפני קירור התאים ל 20 מעלות צלזיוס ולגרום עם IPTG מילימולרי אחד ולגדול בן לילה. ואז לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.

לאחר החייאת גלולת התא במאגר מלח חצוב פוספט, מקלט לאחרונה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשליך את supernatant עם פיפטה. לאחר מכן, להשעות את הכדור הנותר ב 10 מיליליטר של חיץ תזה לדגור את ההשעיה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן להפריד שברים מסיסים ובלתי מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בנוסף, השתמש בג'ל HIS-Select Ni2+Affinity בצינורות של 14 מיליליטר כדי לקשור ולהשהות מחדש את הציאנובירין-N המתויג שלו המתויג באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 מילימולר אימידזול ו-250 מילימולאר אימידזול, בהתאמה. לדגור באצווה במשך 30 דקות לפחות בין השלבים האלה.

הוספת חיץ אלוציה המכיל 250 מילימולאר אימידזול לחלבון אלוטי. מעבירים את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגה באמצעות מסנן חיתוך דלתון במשקל 10 קילו ורוכזו אותן על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-4, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. הוסף חיץ פועל SPR למקדם דילול של 1 עד 10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי במשך 10 דקות ב 4, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop UV-Visible בהתבסס על ההכחדה המחושבת שהייתה יעילה עבור החלבון העיקרי CVN2L0 המציג גודל של 23, 474 דלתון. עבור מערכת SPR דו-ערוצית, השתמש ב- HBSCP plus כמאגר פועל, 10 מילימולר גליצין חומצה הידרוכלורית של pH 1.5 עד 1.6 כמאגר ההתחדשות והפעל את מכשיר degasser, autosampler ומשאבה. לאחר מכן לשטוף את כל המערכת עם מים מזוקקים כפולים במשך שעה אחת.

לאחר מכן, הטילו שמן טבילה על הגלאי והרכיבו שבב חיישן זכוכית המצופה בסרט זהב דק. ובצד העליון, פונקציונלי עם קרבוקסימתיל דקסטרן הידרוג'ל ישירות על הגלאי מתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. לאחר מכן תקן את ההגדרה על ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.

כדי לשתק את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישן, פתח טבלת ריצה על ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל את עורך הטבלה בתוכנת הקישור האוטומטי המשולבת SPP. לאחר מכן בחר ולחץ על אימוביליזציה בסיסית מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ובצע את השלבים של ההליך הניסויי על מסך המחשב. לאחר מכן, לחץ על עורך ערכת דוגמאות בקטע הטופס כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים בדגימה האוטומטית לניתוח נוסף.

לחץ על Autosampler Direct Control ככלי בשורת התפריטים כדי להביא את המדפים קדימה או אחורה הביתה ובחר ארבע מעלות צלזיוס כטמפרטורת ההפעלה. הפעל את המשאבה כדי להחדיר מים מזוקקים כפולים על ידי לחיצה על כלים ובקרה ישירה של המשאבה. ותעד נתונים על ידי לחיצה על שליטה ישירה במכשיר SPR.

ובכל פעם, התחל בחלון החדש שהופיע. לאחר הוספת ריאגנטים צימוד בבקבוקונים של 300 מיקרוליטר, הכניסו אותם למדפי הדגימה האוטומטית והתחילו את שולחן ההפעלה על ידי לחיצה על Run. עבור אינטראקציה פשוטה חלבון-חלבון, לאחר מילוי המשאבה ב 25, 000 microliters לדקה, לבצע התאמה בסיסית במשך 30 שניות.

אפשר את ההתאמה הבסיסית הבאה עם מים מזוקקים כפולים למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם אתנולמין הידרוכלוריד טוחן אחד, pH 8.5. לאחר מכן החלף את הצינורות מהדוגם הנוזלי לדגה ממים מזוקקים כפולים לבקבוק באמצעות HBS-EP+לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל- Post-Processing על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לאחר מכן לחץ על הוסף כדי לבחור עקומות קשירה שנוצרו לאורך זמן בפלטפורמת הנתונים עבור כל תא זרימה ולייצא את שכבת העל כקובץ סקרבר.

לאחר מכן, לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקבצים ולקבל עקומות תגובה על ידי יישור עקומות שמאל וימין והפחתת אותות של ערוץ הייחוס השני מאלו של ערוץ הליגנד. זריקות בודדות של CVN2L0 ושונות V2 ו-V5 נבדקו לראשונה לקשירת שבב החיישן המצומד haemagglutinin כדי להעריך את יכולות הקשירה באמצעות הדגימה האוטומטית ועורך טבלת הריצה. הזרקות חוזרות ונשנות היו אוטומטיות בריכוזים שונים בתחום הננומולאר והמיקרומולאר במערכת לאורך זמן והוכיחו כי לא הושגה רוויה על פני השבב או קשירת שיווי משקל.

ריכוז לעומת תגובה תוכנן עבור קשירה מסוג בר CVN ל-RBD, בהנחה שמיקוד ספציפי של פחמימות עשויות להיות שמורות בתת-היחידה RBD S1 עם זיקה חלשה יותר עם קצב דיסוציאציה קבוע של 260 מיקרומולים. אותה עלילת זיקה לקשירת CVN2L0-V4 ל-DM הופכת לבלתי ניתנת עוד לניתוח עקב החלפת קשרי דיסולפיד המפריעים לקשירת זיקה גבוהה לפפטידים גליקוזילים קטנים ומניבים תגובה גבוהה מהערך המרבי של התגובה. קשירת CVN ל-RBD ב-SARS-CoV-2 מראה קשירה לחלבון S ול-RBD עם קבוע זעם דיסוציאציה של 18.6 מיקרומולים ו-260 מיקרומולים, בהתאמה.

למרות שתגובת SPR עבור ריכוזי אנליטים גורמת ליחידות תגובה גבוהות ולחיישני SPR טיפוסיים עבור קשירת CVN מסוג פראי ו-E41A. עם זאת, המוטציה אינה יציבה כאשר היא מדוללת. ביוסנסינג SPR מטפל בקשירת זיקה גבוהה וזיקה נמוכה של חלבונים מטוהרים וריאנטים שלהם לליגנדים.

במקרה שלנו, גליקופרוטאינים מנצלים את הקריאה האופטית ואת מערכת זרימת הערוצים הכפולה על משטח שבב החיישן. אנזים הוא בדיקה אימונוסורבנטית היא שיטה אימונולוגית חלופית המזהה אפיטופים של חלבונים אך גם מספקת נתונים על ריכוז פפטידים ומולקולות קטנות מתוך מטריצות מורכבות. בדיקת חלבונים המבוטאים באופן רקומביננטי על ידי מבחני קשירת SPR שילבה ביוסנסינג של שינויים מאשרים אשר שימושי לאימות וחיזוי יציבות החלבון על ידי צד חלבון חישובי.