Name: בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: חקור את שיטת ההזנה הסטנדרטית דרך ממברנה לזיהוי זיהום Plasmodium falciparum בווקטורים של יתושי Anopheles. שיטה זו מאפשרת הערכת תרכובות אנטי-מלריה במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לפרופ'. לין-מארי בירקהולץ וד"ר ג'נט רידר מהמחלקה לביוכימיה, גנטיקה ומיקרוביולוגיה, המכון לבקרת מלריה בת קיימא, באוניברסיטת פרטוריה, על גידול ואספקת תרבות הגמטוציטים. זן הטפיל התקבל מהמחלקה האחרונה (לא חלק מפרסום זה). המחלקה למדע וחדשנות (DSI) וקרן המחקר הלאומית (NRF); יוזמת כסאות מחקר בדרום אפריקה (UID 64763 ל- LK ו- UID 84627 ל- LMB); קהילות הנוהג של NRF (UID 110666 ל- LMB ו- LK); ושותפויות החדשנות האסטרטגית בתחום הבריאות של מועצת המחקר הרפואי של דרום אפריקה (SHIP) מוכרות גם הן עבור כספים מה-DSI.

עיין באיור 1 להמחשה של הפרוטוקול. אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה למדעי הבריאות של אוניברסיטת פרטוריה (506/2018) לנסיגה ושימוש בדם אנושי.
1. תרבות הגמטוציטים
הערה: לפני הקמת ה- SMFA, הוכנה תרבות גמטוציטים באוניברסיטת פרטוריה (ראה Reader et al.22 לפרוטוקול המלא).
<ol><li>הכינו תרבית גמטוציטים המורכבת מגמטוציטים שלב V מזן הטפיל NF54.</li>
	<li>ודא כי gametocytemia של התרבית הוא בין 1.5% ל 2.5%, עם hematocrit 50% בסרום זכר A+, שאליו מוסיפים תאי דם אדומים טריים.</li>
	<li>יש להפריד את התרבית לצלוחיות שונות ולהוסיף 2 מיקרומטר מכל תרכובת לכל טיפול בהתאמה 48 שעות לפני ביצוע ה-SMFA. השאירו את קבוצת הביקורת ללא טיפול.</li>
	<li>הערך את תרבות הגמטוציטים זמן קצר לפני ביצוע ה- SMFA כדי להבטיח את ההצפה של גמטות זכריות, עם נוכחות של יחס נקבה:זכר 3:1.</li>
</ol>2. זיהום מלאכותי של יתושים דרך SMFA
הערה: בטיחות ביולוגית: יתושים נגועים צריכים להיות מאוחסנים במתקן בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) עם גישה מוגבלת.
<ol><li>באמצעות שואב הפה, הכניסו 25 יתושי An. gambiae נקבות לא מזוהמות לכוס האכלה של 350 מ"ל. עשו את אותו הדבר עבור כל טיפול ותייגו את הכוסות בצורה ברורה בהתאם לשאלה אם יש להשתמש בהן כקבוצות ביקורת או טיפול. בחר את מספר הכוסות לכל טיפול בהתאם למספר המשכפלים הטכניים הכלולים. הערה: יתושי מושבה בני 5 עד 7 ימים משמשים בהערכת תרכובת חוסמת העברה טיפוסית. הרעבת יתושים במשך 3-4 שעות או יותר לפני הזנת הדם תקל על ספיגת הדם במהלך SMFA.</li>
	<li>חבר את מערכת הזנת הזכוכית לאמבטיית המים ושמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: מזין הזכוכית מורכב משתי זרועות, המחוברות לצינורות הסיליקון שאליהם מחוברת אמבט המים (איור 2). המבנה החלול של המזין מאפשר למים לזרום דרך ותחזוקה של הטמפרטורה של הדם.</li>
	<li>הכינו את המעי של הפרה (או הקרום הסינתטי) על ידי שטיפתו במי ברז וחתכו אותו לחתיכות המותאמות לכל מאכיל. מכסים כל מזין ומהדקים את הממברנה עם רצועה אלסטית. הערה: לא היה צורך באישור אתי למעי, מכיוון שהוא נקנה מקצבייה מקומית, שם הוא נמכר לציבור להכנת מזון.</li>
	<li>הניחו את כוסות הזיהום מתחת למאכילים, כאשר הממברנה מונחת על גבי רשת הכוס.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של דם נגוע בגמטוציטים למזיני כוסות הבקרה ודם נגוע בגמטוציטים עם תרכובת נוספת לכל מזין תרכובת וכוס מתאימים.</li>
	<li>השאירו את היתושים להאכיל במשך כ 40 דקות עם המזינים חשופים. הערה: האכלות מתבצעות בתנאי חרקים (25 מעלות צלזיוס, 80% לחות יחסית) בחושך. קוטר המזין הוא כ -13 מ"מ.</li>
	<li>לאחר ההאכלה, להסיר את המזינים מן הכוסות, לשטוף את המאכילים, ולטפל הדם עודף עם hypochlorite.</li>
	<li>הסר את היתושים הלא מזוהמים מהכוס על ידי הפלת כל היתושים על הקרח (למשך 1-2 דקות) והפרדת היתושים הלא מזוהמים מאלה שלקחו ארוחת דם. חפשו בטן נפוחה ואדומה (מה שמעיד על דם) כדי להבחין בין היתושים שניזונו במלואם לבין אלה שלא ניזונים (איור 3).</li>
	<li>הניחו את כוסות הזיהום בתא הבטיחות הביולוגית (איור משלים S1) וספקו לכל כרית מי סוכר של 10%, תוך החלפת מי הסוכר בימים חלופיים למשך 8-10 ימים.</li>
</ol>3. הכנת יתושים נגועים
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתרחש בחדר ההדבקה BSL2. רק צוות מורשה ומיומן רשאי להיכנס לחדר ההדבקה שבו שוכנים יתושים נגועים. היתושים נשמרים בכוסות מהונדסות המכילות נקודת כניסה אחת בלבד, אשר אוטמת באופן אוטומטי כאשר מסירים את שואב הפה. כוסות אלה מונחות בתוך מיכל תרמופלסטי שקוף כדי למנוע בריחה. המכולה ממוקמת בחדר ההדבקה מאחורי מערכת דלת כפולה. כל הפרוטוקולים הדרושים חייבים להיות במקום לחשיפה מקרית ליתושים נגועים (קובץ משלים S1). הפרוטוקולים הם ספציפיים למדינה ותלויים בדרישות המוסד.
<ol><li>בימים 8-10 לאחר האכלת הזיהום, הפילו את היתושים הנגועים על ידי הנחתם על קרח והעברתם לצינורות מסומנים עם 70% אתנול (שמירה על היתושים של כל קבוצת ביקורת וטיפול בנפרד).</li>
	<li>ודא כי כל היתושים מתים לפני היציאה מחדר ההדבקה.</li>
</ol>4. נתיחות של יתושים נגועים
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתבצע במעבדה.
<ol><li>העבירו את היתושים לצלחות פטרי מסומנות מרופדות בנייר סינון, תוך שמירה על הפרדה בין קבוצות הביקורת והבדיקה.</li>
	<li>הניחו טיפה של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) על שקופית מיקרוסקופית (המסומנת על פי קבוצת הביקורת/בדיקה) והעבירו יתוש בודד מנייר הסינון ל-PBS.</li>
	<li>הסר את המותניים מהדגימה המשותקת והנגועה על ידי הצמדת בית החזה של היתוש עם מחט החיתוך תוך משיכת מקטע הבטןהשביעי עם המלקחיים.</li>
	<li>כאשר המעיים חשופים ונראים לעין, חפשו את הצינוריות המלפיגיאניות (איור 4A,B) כדי להבחין בין המעיים לבין השחלות. מוציאים אותו מה-PBS, מעבירים אותו לטיפה של 0.1% מרקורוכרום במגלשה חדשה במיקרוסקופ, ומשאירים את המעיים להכתים למשך 8-10 דקות.</li>
	<li>לאחר ההכתמה, הניחו כיסוי על המעיים המוכתמים וצפו במעיים תחת תאורת שדה בהיר בהגדלה של 20x-40x (איור 4C,D).</li>
	<li>רשום את הנוכחות של ומספר oocysts לכל midgut עבור כל קבוצת ביקורת וטיפול (קובץ משלים S2).</li>
	<li>חשב את פעילות חסימת השידור באמצעות משוואה (1): %TBA <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63546/63546eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) כאשר TBA = פעילות חוסמת שידור (ירידה בשכיחות oocyst); p = שכיחות oocyst; C = שליטה; ו- T = טיפול.</li>
	<li>חשב את הפעילות המפחיתה את השידור באמצעות משוואה (2): %TRA = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63546/63546eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2) כאשר TRA = פעילות מפחיתה תמסורת (הפחתה בעוצמת oocyst); I = עוצמת אוסיסט; C = שליטה; ו- T = טיפול. הערה: ייתכן שה-TBA לא יופחת באופן משמעותי, אך ניתן להבחין בהבדל משמעותי ב-TRA ולהיפך. זה תלוי בחומר הכימי המוערך.</li>
	<li>בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t שאינו פרמטרי (Mann-Whitney).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כדי שפרוטוקול זה יבוצע בהצלחה, יש לתת תשומת לב לכל שלב, למרות שזה עשוי להיות תהליך מייגע ומייגע. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא להבטיח כי תרבות gametocyte הוא באיכות טובה וכי הוא מורכב gametocytes בוגרים, עם יחס זכר:נקבה הנכון, לפני תחילת SMFA23,24. במהלך ה-SMFA, חשוב גם לשמור על תרבית הגמטוציטים בטמפרטורה הנכונה כדי למנוע מגמטות זכרים להתפרץ לפני הכניסה ליתוש. גורם נוסף הממלא תפקיד מכריע בהקמת זיהום מלאכותי מוצלח הוא להבטיח כי נקבות יתושים להוטים לקחת ארוחת דם כמו...

מלריה, הידועה כאחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, עדיין מהווה איום גדול על מספר מדינות - במיוחד אלה באזור אפריקה - ותורמת לכ-95% מהמקרים ברחבי העולם1. מחלה זו נגרמת על ידי טפיל פרוטוזואי, יחד עם וקטור יתוש Anopheles שלה, האשמים האלה יכולים לגרום נזק רב המארח האנושי2. ליתר דיוק, המין falciparum של סוג טפיל פלסמודיום אחראי על כ 99% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה1. בנוסף לכך, ניתן להאשים מספר וקטורים עיקריים של יתושי אנופלס (כולל An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., ו- An. funestus Giles) ביותר מ-95% מהעברת הטפילים ברחבי העולם 3,4,5,6,7,8 . כדי להקים את החברות האידיאלית של טפיל-וקטור, וקטור היתוש צריך להיות רגיש לטפיל ולהיות מסוגל להעביר אותו9. יתר על כן, גם הווקטור וגם הטפיל צריכים להתגבר על מחסומים פיזיים כדי ליצור את השילוב הזיהומי המושלם - וקטור היתוש צריך להיות מסוגל לקיים את התפתחות הטפיל, והטפיל צריך להיות בעל יכולת להתגבר על מנגנוני ההגנה של הפונדקאי10,11.
גמטוציטים, השלב המיני של טפיל P. falciparum, ממלאים תפקיד מכריע בחיבור בין השותפים הווקטוריים והטפילים12. ההתפתחות המינית מתרחשת in vivo, וגמטוציטוגנזה מתארת את תהליך ההתמיינות של גמטוציטים בוגרים למיקרוגמטות זכריות תנועתיות ומקרוגמטות נקביות13. תהליך נוסף המתרחש בתוך היתוש הוא exflagellation - התהליך שבמהלכו הגמטוציט הזכרי הופך לגמטות ומגיח מתוך תאי הדם האדומים שנלקחו במהלך ארוחת דם11. תהליך ההסתגרות מוצע עוד יותר להיות משופר על ידי שינוי חיובי בסביבה של יתוש midgut14. לאחר exflagellation, זיגוטה נוצרת על ידי מיזוג של גמטות זכר ונקבה13. מן הזיגוטה, אוקינט תנועתי עולה ועובר מארוחת הדם לאפיתל של היתוש midgut13. כאן, ookinete מתבגר, ו oocyst נוצר, אשר, בתורו, מייצר sporozoites תנועתי13,15. לאחר מכן הספורוזואיטים נודדים לבלוטות הרוק של היתושים, וכאשר היתוש לוקח ארוחת דם מהפונדקאי שלו, ספורוזואיטים אלה מוזרקים לזרם הדם של הפונדקאי15.
התערבויות בקרת מלריה, המשלבות אסטרטגיות בקרת וקטורים ושימוש בתרופות יעילות נגד מלריה, הפכו חיוניות במאבק במחלה זו15. עם העלייה בעמידות בפני טפילים ויתושים, הדחיפות לזיהוי תרכובות חדשות נגד מלריה עולהב-16. לכן, הערכת in vivo של תרכובות חוסמות שידור חשובה16. לאחר פיתוח של תרופות חוסמות העברה יעילות כאלה, SMFA שימש כדי להעריך אם תרכובות אלה מעכבות את ההתפתחות המינית של P. falciparum יתוש Anopheles 17,18,19. בדיקה זו זכתה להכרה מאז שנות ה-70 וה-80 של המאה ה-20 כתקן הזהב להערכת חסימת תמסורת20,21. בדיקה זו מספקת אלטרנטיבה זולה יותר מאשר בדיקות אחרות כגון RT-qPCR, הדורשת ציוד מיוחד. יתר על כן, אין צורך בחולים כדי לבצע את הניסויים. בדיקה זו כוללת גם מתן דם המושרה על ידי גמטוציטים ליתושים נקבות, אשר מנותחים לאחר מכן כדי להעריך אם התפתחות oocyst קיים21. זה מאפשר כימות גמטוציטים וזיהוי של oocysts מעוותים בגלל תרכובות22. כדי שתרכובת תסווג כיעילה, יש להעריך את השכיחות (שיעור היתושים שיש להם לפחות אוציסט אחד באמצע המעיים) ואת מספר האוציסטים (עוצמה) במידגוט היתושים כדי להעריך את עיכוב הזיהום 17,21,22.

<table><tbody><tr><td>מעי בקר /</td> <td>תרכובת קצבים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MMV1581558</td><td>MMV</td><td></td><td>תיבת תגובה למגיפה</td></tr><tr><td>מחטי ניתוח</td><td>WRIM</td><td></td><td>צינור בז בהתאמה אישית</td></tr><tr><td></td><td>מזיני זכוכית Lasec</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glastechniek Peter Coelen B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism (8.3.0)</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mercurochrome</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>129-16-8</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Merch (Sigma-Aldrich)</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cleansafe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS טבליות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944</td><td></td></tr><tr><td>Perspex ביו-בטיחות</td><td>אוניברסיטת</td><td></td> וויטס <td>תוצרת הקבלנים בכוסות פלסטיק של וויטס</td></tr><tr><td>(350 מ"ל)</td><td>ארץ פלסטיק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

מלריה נותרה אחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, ועד כה, האזור האפריקאי עדיין אחראי ל -94% מכלל המקרים ברחבי העולם. מחלה טפילית זו דורשת טפיל פרוטוזואי, וקטור יתוש אנופלס ופונדקאי בעל חוליות. הסוג אנופלס כולל יותר מ -500 מינים, מתוכם 60 ידועים כווקטורים של הטפיל. הסוג טפיל פלסמודיום מורכב מ-250 מינים, ו-48 מהם מעורבים בהעברת מחלות. יתר על כן, טפיל הפלסמודיום פלציפרום תרם בשנים האחרונות לכ-99.7% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה. 
גמטוציטים מהווים חלק מהשלב המיני של הטפיל והם נבלעים על ידי נקבת היתוש כאשר הם ניזונים מפונדקאי אנושי נגוע. התפתחות נוספת של הטפיל בתוך היתוש משופרת על ידי תנאים סביבתיים נוחים באמצע היתוש. כאן מתרחש המיזוג של הגמטות הנקביות והזכריות, ומקורם של האוקינטים התנועתיים. האוקינטים נכנסים לאפיתל midgut של היתוש, ואוקינטים בוגרים יוצרים oocysts, אשר, בתורם, מייצרים ספורוזואיטים תנועתיים. ספורוזואיטים אלה נודדים לבלוטות הרוק של היתוש ומוזרקים כאשר יתוש לוקח ארוחת דם. 
למטרות גילוי תרופות, יתושים הודבקו באופן מלאכותי בדם נגוע בגמטוציטים בבדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA). כדי לזהות זיהום בתוך היתוש ו/או כדי להעריך את היעילות של תרכובות נגד מלריה, הוסרו היתושים של נקבות היתושים לאחר ההדבקה והוכתמו במרקורוכרום. שיטה זו שימשה כדי לשפר את הזיהוי החזותי של oocysts תחת מיקרוסקופ לקביעה מדויקת של שכיחות oocyst ועוצמה.

המספר הכולל של דגימות הבקרה שנותחו היה 47, עם שכיחות ממוצעת של 89% ועוצמה של 9.5 oocysts לכל midgut (טבלה 1, כפי שפורסם קודםלכן 22). עבור התרכובת MMV1581558, גודל המדגם הגיע לסך של 42 דגימות, עם שכיחות של 36% oocyst ועוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts. זה מראה ירידה בשכיחות oocyst של 58% ו- TRA של 82% על פני כל שלושת השכפולים הביולוגיים (טבלה 1).
גם %TRA וגם %TBA עבור MMV1581558 היו מעל 50%; לפיכך, תרכובת זו יכולה להיחשב כמועמדת פוטנציאלית לחס...

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

הפרוטוקול מאפשר לנו לזהות את השפעת הטיפול על הרגישות למלריה של וקטורים למלריה אפריקאית. לדוגמה, תרכובות שמטרתן לחסום את ההעברה מהאדם ליתוש. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להעריך מספר רב של תרכובות בתנאי מעבדה, עוד לפני ש-GATEs רעילים זמינים.נתיחות מידגוט יכולות להיות מאתגרות בהתחלה, אבל זה פשוט דורש קצת תרגול. כמו כן, כדי להיות מסוגל לזהות oocysts לא תמיד קל. ראשית, באמצעות שואב פה, הכניסו 25 יתושי Anopheles gambiae נקבות לא מזוהמות לכוס האכלה של 350 מיליליטר.יש לסמן את הכוסות בצורה ברורה כדי להבחין בין קבוצת הביקורת לבין קבוצות הטיפול. בחר את מספר הכוסות לכל טיפול בהתאם למספר המשכפלים הטכניים הכלולים. חבר את מערכת הזנת הזכוכית לאמבטיית מים ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הכינו את המעי של הפרה או את הממברנה הסינתטית על ידי שטיפתה במי ברז וחתכתם לחתיכות המותאמות לכל מזין. מכסים את החלק התחתון של כל מזין ומהדקים את הממברנה עם רצועה אלסטית. לשימוש בכוסות ההזנה ככוסות זיהום, ראשית, יש לשמור את הממברנה על גבי רשתות הכוסות.לאחר מכן הניחו את כוסות הזיהום מתחת למאכילים. כעת, הוסף מיליליטר אחד של דם נגוע בגמטוציטים למזיני כוסות הבקרה, ודם נגוע בגמטוציטים עם תרכובת בדיקה למזיני כוסות הטיפול. ואז להשאיר את היתושים להאכיל במשך כ 40 דקות.לאחר ההאכלה, להסיר את המזינים מן הכוסות, לשטוף את המאכילים, ולטפל הדם עודף עם hypochlorite. לאחר מכן, הפילו את כל היתושים על הקרח למשך דקה עד שתיים, ובחרו את היתושים שלקחו ארוחת דם על ידי חיפוש בטן נפוחה ואדומה. החליפו את מי הסוכר הניתנים בימים חלופיים לכל זיהום בפד מים של 10% סוכר, ודגרו את כוסות הזיהום בתא בטיחות ביולוגית למשך שמונה עד עשרה ימים.שמונה עד עשרה ימים לאחר ההאכלה, הפילו את היתושים הנגועים על ידי הנחתם על קרח. לאחר מכן, העבר אותם לצינורות מסומנים עם 70% אתנול, תוך שמירה על שליטה בכל קבוצת טיפול בצינורות נפרדים. תוך שמירה על הפרדה בין קבוצות הבקרה והבדיקה, העבירו את היתושים לצלחות פטרי מסומנות מרופדות בנייר סינון.הוסיפו טיפה של PBS על מגלשת זכוכית המסומנת כראוי, והעבירו יתוש מנייר הסינון אל הטיפה. להצמיד את בית החזה של היתוש עם מחט לנתח. לאחר מכן, הסר את midgut על ידי משיכת קטע הבטן השביעי עם מלקחיים, ולהעביר אותו טיפה של 0.1% mercurochrome על שקופית מיקרוסקופ חדש.השאירו את המעיים להכתים במשך שמונה עד 10 דקות. לאחר מכן הניחו כיסוי על המעיים המוכתמים, וצפו בו תחת תאורת שדה בהירה בהגדלה של פי 20 עד 40. רשום את מספר oocysts לכל midgut עבור הבקרה וכל קבוצת טיפול.במחקר זה, התרכובת MMV1581558 נמצאה כמגבילה באופן משמעותי את מספר הפלסמודיום falciparum oocysts באמצע היתושים של נקבות אנופלס גמביה בהשוואה לבקרה. בקבוצת הביקורת, השכיחות הממוצעת של oocysts במידגוט הייתה 89% עם עוצמה ממוצעת של 9.5 oocysts לכל midgut. אבל בקבוצה שטופלה ב-MMV1581558, השכיחות הממוצעת של oocysts הייתה 36% עם עוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts בלבד לכל midgut.לפיכך, טיפול MMV1581558 הביא לפעילות חסימת שידור של 58% והפחתה של 82% בפעילות בכל שלושת המשכפלים הביולוגיים. זה קריטי כדי להבטיח כי יתושים להאכיל על תרבית gametocyte בריא. אם אלה הם גמטוציטים לא בשלים, או לא שלב חמש gametocytes, ההסתברות לקבל זיהום יתוש הוא מוגבל או בלתי אפשרי.הבדיקה משתמשת בשיטת זיהוי מורפולוגית חזותית, אולם ניתן להשתמש במבחני כימות מולקולריים. עם זאת, הדבר יקר יותר ועלול להגביל את השימוש בהם במעבדות מוגבלות במשאבים. היכולת לבצע טכניקה זו פותחת אפיקים חדשים להעריך את השינוי בשכיחות ובעוצמה של מלריה בין כמעט כל דבר אצל יתושים.לדוגמה, השוואת יכולת וקטורית של מינים.

standard-membrane-feeding-assay-for-detection-plasmodium-falciparum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

סרטון זה מדגים בדיקת האכלת דם כדי להעריך את התמותה והפוריות של תרכובות בדיקה עם דרכי פעולה חדשות על נקבות יתושים. טכניקה זו מסייעת בסינון סוגים חדשים של קוטלי חרקים כדי להרוג את האוכלוסייה העמידה של יתושים ולשלוט בהתפשטות מחלות.

בדיקת האכלת יתושים: שיטה להערכת השפעות תרכובת הבדיקה על תמותה וצואה של יתושים בוגרים

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

ליתושים המעבירים מלריה יש מספר מאפיינים חשובים מבחינה אפידמיולוגית שניתן לזהות רק באמצעות טכניקות מולקולריות. תוך שימוש בפלטפורמת גנוטיפ SNP מבוססת MALDI-TOF, פיתחנו בדיקה לזיהוי בו-זמנית של תכונות מפתח מרובות (מינים, עמידות לקוטלי חרקים, זיהום טפילים ובחירת מארח) של וקטורים למלריה.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.

פלסמודיום פאלציפארום תרבות המשחק וזיהום יתושים באמצעות האכלה מלאכותית של ממברנה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ולכמת במדויק את נפח הארוחה שנבלעה.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

חקור את שיטת ההזנה הסטנדרטית דרך ממברנה לזיהוי זיהום Plasmodium falciparum בווקטורים של יתושי Anopheles. שיטה זו מאפשרת הערכת תרכובות אנטי-מלריה במעבדה.

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

גלה סרטונים נוספים