הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד מספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמני חלבון מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. פלטפורמה זו מספקת תמונה מקיפה של אינטראקציות חלבונים של מערכות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המולטיפלקסיות נטולת המחזור שלה.

טכניקה זו מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות רכיבה על אופניים אינן מתפקדות היטב, כגון בקטעי רקמה עבים. שיטה זו מאפשרת אפיון תאים בודדים באתרם להבנת מבנים של המערכת המורכבת, כגון אטלס רקמות בנייה, מיקרו סביבות מיקרו של גידול פנוטיפיפינג ומעגל המוח של יצירת פרופילים. כדי להתחיל, להכין כ 0.1 נתרן טוחן ביקרבונט בחיץ PBS ב PHA 0.3 כדי לשמש כמאגר הצמדה ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הכן שלושה מילימולאר n-hydroxysuccinimide אסטר תמיסת בדיקה מתפקדת MARS ב anhydrous dimethyl sulfoxide. ממיסים את מוצקי הנוגדנים במאגר ההצמדה לריכוז של שני מיליגרם למיליליטר. עבור נוגדנים המומסים במאגרים אחרים, רכזו אותם במסנן צנטריפוגלי ולאחר מכן הוסיפו למאגר ההצמדה לריכוז של מיליגרם אחד עד שני מיליגרם למיליליטר.

כדי לבצע את תגובת ההצמדה לנוגדנים משניים, הוסיפו עודף טוחן פי 15 של תמיסת צבע לתמיסת הנוגדנים בבקבוקון זכוכית באיטיות עם ערבוב ודגירה של תערובת התגובה בטמפרטורת החדר עם ערבוב למשך שעה. כדי לבצע את הטיהור, להכין את slurry על ידי הוספת 10 מיליליטרים של אבקת שרף סינון ג'ל לתוך 40 מיליליטרים של חיץ PBS בצינור 50 מיליליטר. שמור את הפתרון באמבט מים ב 90 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לאחר מכן נקו את ה-supernatant, הוסיפו את ה-PBS עד ל-40 מיליליטרים, ואחסנו את ה-slurry ב-4 מעלות צלזיוס. ארזו את עמודת ההחרגה בגודל עם תמיסת הסלורי לגובה של 10 עד 15 ס"מ, ואז שטפו ושטפו את העמוד בכ-10 מיליליטרים של PBS כדי לארוז עוד יותר את השרף. לאחר מכן, פיפטה את תערובת תגובת ההצמדה לטור.

לאחר טעינת תערובת התגובה, מיד להוסיף מיליליטר אחד של PBS כמו מאגר elution. לאחר מכן, אספו את ההברקה של תמיסת ההצמדה על ידי התבוננות בצבע בעמודה או על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר. באמצעות המסנן הצנטריפוגלי, לרכז את התמיסה שנאספה לאחד עד שני מיליגרם למיליליטר.

באמצעות עט הידרופובי, ציירו גבול סביב חלקי הרקמה בשקופית. לאחר מכן לדגום את הרקמות עם 0.3 עד 0.5% PBST למשך 10 דקות ומאגר חוסם למשך 30 דקות. כדי להכין את תמיסת ההכתמה הראשונית, הוסיפו את כל הנוגדנים הראשוניים ל-200 עד 500 מיקרוליטרים של מאגר צביעה בריכוזים הרצויים.

צנטריפוגה תמיסת הכתם העיקרית ב 13, 000 פעמים G במשך חמש דקות ולהשתמש supernatant אם משקע מופיע. לאחר מכן דוגרים את הרקמה בתמיסת הנוגדנים העיקרית בארבע מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים. שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-0.3%-0.5% PBST למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בצנצנת עומדת בגלישה וודאו שהרקמות שקועות בתמיסה.

מאוחר יותר, דגירה של הרקמה ב-200 עד 500 מיקרוליטרים של חיץ חוסם למשך 30 דקות. כדי להכין את תמיסת ההכתמה המשנית, יש להוסיף את כל הנוגדנים המשניים ל-200 עד 500 מיליליטר של מאגר צביעה בריכוזים הרצויים. לאחר מכן צנטריפוגה תמיסת הכתם המשנית ב 13, 000 פעמים G במשך חמש דקות והשתמשו בסופרנטנט אם מופיע משקע.

לאחר מכן, דגירה של הרקמות ב-200 עד 500 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית בארבע מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים. לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים עם 0.3%-0.5% PBST בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כל אחת. יתר על כן, דגירה עם 200 עד 500 microliters של פתרון DAPI במשך 30 דקות.

שוב, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כל אחת והעברו את חלקי הרקמות הצפים למגלשות הזכוכית עם הפיפטה שמפילה את הזכוכית. מורחים את הרקמה עם מברשת טישו ומנקים את הסביבה במגבונים במידת הצורך. לאחר מכן, להרכיב את הרקמה בטיפה של ריאגנטים נגד דהייה עם כיסוי זכוכית ולהדק אותה עם לק.

כדי לבצע הדמיה רב-ערוצית-eprSRS, הגדר את עוצמת הלייזר של קרן המשאבה ל-10 עד 40 מילי-וואט ואת קרן הסטוקס ל-40 עד 80 מילי-וואט בלוח הבקרה של הלייזר. לאחר מכן הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים לשתיים עד ארבע מיקרו-שניות והשתמש במסגרות מרובות בממוצע של 10 עד 20 פריימים בתוכנת המיקרוסקופיה. יתר על כן, הגדר את קבועי הזמן של מגבר הנעילה למחצית מזמן השהייה של הפיקסלים.

הדמיית צבע ראמאן של סמני חלבון מובחנים ותאי HeLa עם קליפת המוח של עכבר קבוע פרפורמלדהיד ורקמת FFPE כליות לחה בוצעו באמצעות תיוג חיסוני. הדמיית אימונו-eprSRS של תאי HeLa עם אלפא-טובולין חשפה מבנים תת-תאיים עדינים כגון מיקרוטובולים. הדמיית eprSRS של אסטרוציטים מוכתמים ב-MARS 2145 ושל נוירוני גרגירי המוח הקטן המוכתמים MARS 2228 ברקמת המוח של העכבר הדגימה דפוסים תלת-ממדיים ברזולוציה תת-תאית.

הדמיית טנדם פלואורסצנטית SRS בת שבעת הצבעים של הורמונים וגורמי שעתוק על רקמת איון עכבר קפואה בוצעה. התמונות שהתקבלו חשפו ניגודיות טובה ודפוסים נכונים. בוצעה הדמיית טנדם פלואורסצנטית SRS בת שמונת הצבעים של סמנים מסוג תאים על רקמות מוח הקטן של עכברים קבועים בפרפורמלדהיד.

סוגים שונים של תאים זוהו כגון נוירונים של גרגירי המוח הקטן, נוירוני פורקיניה, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאי עצב GABAergic. ניתן לשלב הליך זה גם עם ניקוי רקמות כדי לבצע הדמיית חלבונים מרובבת מאוד ברקמות שלמות עבות. הקבוצה שלנו פיתחה עבורה פרוטוקול ניקוי רקמות המותאם לצביעת ראמאן.