Name: הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו להעריך יוביקוויטילציה של מצע על ידי ליגאז E3 בליסאטים של תאי יונקים. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות ליגאז-מצע ולהבין תפקידן במחלות כמו סרטן ומחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T נתמך על ידי מענק FAPESP מספר 2020/15771-6 ו- CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P ו-V.S נתמכים על ידי CAPES. C.R.S.T.B.C נתמך על ידי מלגת FAPESP מספר 2019/23466-1. אנו מודים לסנדרה R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) על התמיכה בחומר.

הערה: סקירה כללית של פרוטוקול בדיקת יוביקוויטילציה בתאי יונקים מיוצגת באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> איור 1. סקירה כללית של הליך בדיקת יוביקוויטילציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
1. תרבית תאים
<ol><li>הגדל את קו תאי HEK293T בצלחת תרבית 100 מ"מ שטופלה ב-TC למפגש של 80%-90% במדיית גדילה (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) עתיר גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין (100 יחידות), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם) ו-L-גלוטמין (0.292 מ"ג/מ"ל)). דגירה של התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% CO2.</li>
	<li>כדי להעביר את התאים, שאפו את המדיה מצלחת התרבית באמצעות פיפטה סרולוגית. שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של מי מלח מעוקרים 1x עם מאגר פוספט (PBS 1x).</li>
	<li>נתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA (חומצה אתילנדיאמינט-אצטית). דגירה של המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. החייאת התאים באמצעות פיפטה סרולוגית ב-2 מ"ל של מדיית גדילה.</li>
	<li>מעבירים את מתלי התא לצינור וצנטריפוגה טריים ונקיים של 15 מ"ל ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מוציאים את חומר העל על ידי שפיכתו החוצה בזהירות. יש לבצע החייאה עדינה של כדור התא ב-3 מ"ל של מדיית גדילה על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיף תאים הומוגני.</li>
	<li>העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לתבשיל תרבית 100 מ"מ שטופל ב-TC המכיל 9 מ"ל של מדיית גדילה. הערה: אם התאים נמצאים בתנאים טובים, כל צלחת תרבית של HEK293T, שבה המפגש הוא 80%-90%, יכולה ליצור שלוש מנות תרבית עם מפגש של 80% יומיים לאחר המעבר.</li>
</ol>2. טרנספקציה של תאים
הערה: לא מומלץ לבצע טרנספקטציה של תרבית התאים אם המפגש שאליו הגיעו הוא פחות מ-80%.
<ol><li>לפני הטרנספקציה, יש לאשר אם התאים נקיים מזיהום ובמפגש הולם עבור טרנספקציות חולפות.</li>
	<li>עבור כל דגימת טרנספקציה, הכן את קומפלקסי הדנ"א-פוליאתילנימין (PEI 1 מיקרוגרם/מיקרול ב-pH 7.2) באופן הבא:<ol>
<li>דילול 3 מיקרוגרם של כל פלסמיד ב-100 מיקרוגרם ליטר של opti-MEM הפחתתי את מדיום הסרום ללא תוספת וערבבתי אותו בעדינות על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה. הערה: כאן, התאים עברו טרנספקציה עם 4 מיקרוגרם של כל פלסמיד: וקטור ריק (pcDNA3) או מבני FLAG-Fbxo7 ו- UXT-V2-HA, עם או בלי 6xHis-myc-ubiquitin. תכולת הדנ"א הכוללת הייתה 12 מיקרוגרם.</li>
		<li>להפשיר את ה-PEI ב-RT ולהוסיף אותו לתמיסה לאחר שיעור של 3 μL של PEI לכל 1 מיקרוגרם של דנ"א. הומוגניזציה של התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן לדגום אותו במשך 15 דקות ב- RT כדי לאפשר היווצרות של מתחמי DNA-PEI. הערה: היחס האופטימלי של נפח PEI לכמות DNA משתנה בהתאם לקו התאים שנבחר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מוסיפים את הנפח הכולל של מתחמי DNA-PEI לכל מנה המכילה את תרבית התאים ומערבבים אותה בעדינות על ידי נדנדת הצלחת קדימה ואחורה. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% CO2.</li>
	<li>החלף את מדיום הגדילה לאחר 5 שעות, מכיוון שחשיפה ממושכת ל-PEI עלולה להיות רעילה לתאי HEK293T. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% CO2 למשך 36 שעות.</li>
</ol>3. ליזה תאית ומיצוי חיסוני
<ol><li>לאחר תקופת הדגירה ו-6 שעות לפני התזה של התאים, טפלו בתאים שעברו טרנספקציה עם 10 מיקרומטר של מעכב הפרוטאזום MG-132. שוב, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% CO2.</li>
	<li>שאפו את המדיה מכל צלחת תרבות באמצעות פיפטה סרולוגית ושטפו אותה פעם אחת עם 1 מ"ל של 1x PBS. נתקו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין ודגירה של המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. החייאת התאים ב-1 מ"ל של מדיית גדילה.</li>
	<li>העבירו את מתלי התא לצינור 15 מ"ל רענן ונקי והצנטריפוגה שלו ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.</li>
	<li>מוציאים את חומר העל על ידי שפיכתו החוצה בזהירות. יש לבצע החייאה עדינה של גלולת התאים ב-200 μL של מאגר ליזה NP-40 קר כקרח (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl ו-1% NP-40), בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז (10 mM NaF ו-1 mM Na3VO4), ולהעביר את התמיסה למיקרו-צינורית נקייה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>דגירה של התא ליזאט במשך 30 דקות על קרח. לאחר הדגירה, צנטריפוגה התא lysates ב 16,900 x g במשך 20 דקות ב 4 °C (64 °F).</li>
	<li>בינתיים, לאזן את חרוזי האגרוז-אנטי-HA עם חיץ ליזה NP-40 קר כקרח. השתמש ב-15 μL של חרוזי אגרוז-אנטי-HA עבור כל דגימה. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של חיץ lysis NP-40 על ידי פעימות אותו בצינור microcentrifuge ב 3,000 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (66 °F). עם פיפטה, לשאוף ולהשליך את supernatant בזהירות רבה; חזור על תהליך זה שלוש פעמים. לאחר מכן, השאירו את החרוזים מאוזנים על קרח עד לשימוש.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה התא lysates, לשחזר את supernatant. לכמת את תכולת החלבון בליזאט הכולל בשיטת ברדפורד16.</li>
	<li>ודא שכל דגימה הנתונה לתופעה חיסונית מציגה כמות שווה של חלבון. דגירה את הנפח הדרוש של ליאזט התא עם חרוזי האגרוז-אנטי-HA המשוזנים למשך 4 שעות, תוך סיבוב עדין באינקובטור מסתובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר ל- UXT-V2-HA להיקשר לחרוזי האגרוז-אנטי-HA.</li>
	<li>אסוף את החרוזים האגרוזים-אנטי-HA על ידי פעימות שלהם בצינור microcentrifuge ב 3,000 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (64 °F). בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ ליזיס של תאי NP-40 קרים כקרח ופעמיים עם חיץ FLAG/HA קר כקרח (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl ו-0.1% NP-40).</li>
	<li>לאחר הכביסה הסופית, הסירו את כל הסופרנאטנט בזהירות באמצעות פיפטה והורידו את החלבון הפוליוביקוויטילטיבי עם פפטיד HA (300 מיקרוגרם/מ"ל) מדולל על חיץ FLAG/HA. דגירה של חרוזי אגרוז-אנטי-HA עם פפטיד HA למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס בפלטפורמת שייקר מתנדנדת.</li>
	<li>סובבו את החרוזים בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ופשטו בזהירות את הסופרנטנט המכיל את החלבונים הרב-יוביקוויטינאטים. במידת הצורך, אחסנו את ה-eluate במיקרו-טיוב טרי ונקי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>פתרו את האלואטים והתא ליסאט ב-10% SDS-PAGE (נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה)17 ואימונובלוטציה.</li>
	<li>במחקר זה בוצעה העברה רטובה WB. עבור סוג זה של העברה, מניחים את הג'ל בכריך העברה המורכב מנייר-ג'ל-נייר-מסנן-ממברנה של מסנן נייר, מרפדים אותו ברפידות ולוחצים אותו יחד על ידי רשת תמיכה. מקם מערכת זו אנכית במיכל מלא במאגר העברה ובין אלקטרודות חוטי נירוסטה /פלטינה. ההעברה מתרחשת במשך 90 דקות ב-150 וולט במאגר העברה רטוב (גליצין 192 mM, tris-base 25 mM, 0.025% SDS, 20% מתנול). הערה: מאחר שתמציות התאים כומתו (שלב 3.7), הפעל SDS-PAGE עם כמות שווה של חלבון עבור כל דגימה. כמו כן, כדי לפתור את eluate, הפעל נפחים שווים של כל דגימה.</li>
	<li>לחקור את קרום האימונובלוט באמצעות נוגדנים נבחרים 11. ודא כי אות מריחה מזוהה באלואט מהמצע הפוליוביקוויטילטיבי שנמשך בתהליך ה- IP על ידי שימוש בנוגדן נגד myc בדגימות המכילות את הליגאז מסוג E3 מסוג בר, את המצע ואת myc-ub. בליזאט של התא (קלט), ודא שהאות מהמצע שנבחר, חלבון Fbxo7, חלבונים שעברו יוביקוויטילציה וחלבון משק בית (למשל, GAPDH ו-β-actin) יזוהו כדי להבטיח את אותה כמות של חלבונים בכל נתיב. הערה: הדילול עבור כל נוגדן שבו נעשה שימוש הוכן על פי הוראות היצרן.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

יוביקוויטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי חיוני המווסת את רמותיהם של מספר חלבונים וממלא תפקיד מכריע במסלולי איתות ותהליכים ביולוגיים רבים, ומבטיח סביבה תוך-תאית בריאה. מערכת יוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) היא אחד המוקדים העיקריים של המחקר הפרמצבטי האחרון, המספק את האפשרות לייצב מדכאי גידולים או לגרום לפירוק של מוצרים אונקוגניים22. לדוגמה, התפשטות חריגה של גידולים בתאי פלזמה האחראית להפרשת אימונוגלובולינים חד-שבטיים במיאלומה נפוצה (MM) מקדמת מסלול פתופיזיולוגי עקב הצטברות חלבונים מקופלת ו/או לא מקופלת באופן...

שינויים לאחר התרגום (PTMs) הם מנגנון חשוב בנוגע לוויסות חלבונים, החיוני להומאוסטזיס של התא. יוביקוויטילציה של חלבונים היא שינוי דינמי ומורכב שיוצר מגוון של אותות שונים וכתוצאה מכך מספר תוצאות תאיות באורגניזמים אאוקריוטים. יוביקוויטילציה היא תהליך הפיך המורכב מהצמדת חלבון יוביקוויטין המכיל 76 חומצות אמינו למצע, המתרחש במפל אנזימטי המורכב משלוש תגובות נפרדות1. הצעד הראשון מאופיין בהפעלת יוביקוויטין, התלויה בהידרוליזה של ATP כדי ליצור יוביקוויטין המקושר לתיואסטר באנרגיה גבוהה בין יוביקוויטין C-terminus לבין שאריות הציסטאין הנמצאות באתר הפעיל של האנזים E1. לאחר מכן, האוביקוויטין מועבר לאנזים E2 ויוצר קומפלקס דמוי תיואסטר עם יוביקוויטין. לאחר מכן, האוביקוויטין מחובר באופן קוולנטי לסובסטרט על ידי E2, או לעתים קרובות יותר, על ידי האנזים E3, שמזהה את הסובסטרט 2,3 ומתקשר איתו. לעיתים, אנזימי E4 (גורמי התארכות שרשרת יוביקוויטין) נחוצים כדי לקדם מכלול שרשרת מולטי-יוביקוויטין3.
ליוביקוויטין יש שבעה שאריות ליזין (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63), מה שמאפשר היווצרות של שרשראות פוליוביקוויטין שיוצרות חוליות נפרדות כדי לייצר מבנים תלת-ממדיים שונים שעומדים להיות מזוהים על ידי מספר חלבונים משפיעים 4,5. לפיכך, סוג שרשרת הפוליוביקוויטין שהוכנסה למצע חיוני כדי להחליט על גורל התא שלו 6,7,8. יתר על כן, המצע יכול להיות גם בכל מקום דרך שאריות N-terminal שלו הנקראות N-degrons. יוביקוויטין-ליגאזות E3 ספציפיות אחראיות לזיהוי N-degron, ומאפשרות פוליוביקוויטילציה של שאריות ליזין סמוכות9.
כיום, ישנם יותר מ -40 מצעים שונים ספציפיים ל- SCF המאופיינים. בין אלה, ניתן למצוא מווסתים מרכזיים של מספר מסלולים ביולוגיים, כולל התמיינות והתפתחות תאים, כמו גם הישרדות תאים ומוות, 10,11,12,13. לפיכך, זיהוי של מצעים ספציפיים של כל יוביקוויטין-ליגאז E3 חיוני לתכנון מפה מקיפה של אירועים ביולוגיים שונים. אף על פי שהזיהוי של מצעים אמיתיים הוא מאתגר מבחינה ביוכימית, השימוש בשיטות מבוססות ביוכימיה מתאים מאוד להערכת ספציפיות השרשרת וההבחנה בין מונו לפוליוביקוויטילציה14. מחקר זה מתאר פרוטוקול מלא לבדיקת יוביקוויטילציה באמצעות קו תאי היונק HEK293T המבטא יתר על המידה את המצע UXT-V2 (מבוטא בכל מקום דמוי פרפולדין דמוי מלווה איזופורם 2) עם קומפלקס E3 יוביקוויטין-ליגאז SCF(Fbxo7). UXT-V2 הוא גורם משותף חיוני לאיתות NF-κB, וברגע שחלבון זה מופל בתאים, הוא מעכב את הפעלת NF-κB המושרה על ידי TNF-α11. לפיכך, כדי לזהות UXT-V2 פוליוביקוויטילציה, מעכב הפרוטאזום MG132 משמש מכיוון שיש לו את היכולת לחסום את הפעילות הפרוטאוליטית של תת-היחידה 26S של קומפלקס הפרוטאזום15. יתר על כן, תמצית התא מוגשת ל- IP בקנה מידה קטן כדי לטהר את המצע, תוך שימוש בנוגדן ספציפי המשותק לשרף אגרוז לצורך זיהוי מאוחר יותר על ידי WB באמצעות נוגדנים נבחרים. פרוטוקול זה שימושי מאוד כדי לאמת יוביקוויטילציה של מצע בסביבה התאית, וניתן גם להתאים אותו לסוגים שונים של תאי יונקים ולקומפלקסים אחרים של יוביקוויטין-ליגאז E3. עם זאת, יש צורך לאמת את המצע שנבדק באמצעות בדיקת יוביקוויטילציה במבחנה גם כן, שכן שני הפרוטוקולים משלימים זה את זה לגבי זיהוי מצעים אמיתיים.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת תרבית מטופלת TC</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור</td><td>קורנינג</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת</td><td>קרלפלסט</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי אגרוז-אנטי-HA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>עיזים נגד עכבר IgG</td></tr><tr><td>נוגדן נגד ארנב</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>עיזים נגד ארנב</td></tr><tr><td>IgG נוגדן נגד אקטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>דילול בשימוש: 1:2000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Fbxo7</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SAB1407251</td><td>דילול בשימוש: 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד HA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3663</td><td>דילול בשימוש: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Myc</td><td>נוגדנים איתות תאים</td><td>2272</td><td>דילול בשימוש: 1:1000</td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9647-100G</td> חממת תאי <td>אלבומין בסרום בקר</td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g למשך 5 דקות</td></tr><tr><td>מד pH דיגיטלי ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle' s</td><td>קורנינג</td> בינוני <td>10-017-CRV</td> סרום בקר עוברי <td>עם גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>פילטראט שימוש קודם</td></tr><tr><td>פפטיד</td><td>HA סיגמא-אולדריץ'</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Blotting membrane</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>OPTIKA מיקרוסקופים</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>לביטוי יונקים</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; F-box</td><td>&nbsp; נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI. &דלתא; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp; נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; </td><td></td> rio <td>Tag HA (מסוף C). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp; נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; </td><td></td> rio <td>Tag 6x-His-Myc (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>כדי להשיג 1x PBS, יש לדלל את ה-10x PBS למים טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>שייקר נדנדה</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>מערכת SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר תמיסה</td><td>פניקס לופרקו</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריזמה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט לומינול ווסטרן בלוטינג</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי e3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

יוביקוויטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי המתרחש בתאים אאוקריוטים שהוא קריטי לוויסות של מספר מסלולים ביולוגיים, כולל הישרדות תאים, התפשטות והתמיינות. זהו תהליך הפיך המורכב מהצמדה קוולנטית של יוביקוויטין לסובסטרט באמצעות תגובת מפל של לפחות שלושה אנזימים שונים, המורכבים מ-E1 (אנזים הפעלת יוביקוויטין), E2 (אנזים מצומד יוביקוויטין) ו-E3 (אנזים יוביקוויטין-ליגאז). קומפלקס E3 ממלא תפקיד חשוב בזיהוי מצעים וביוביקוויטילציה. כאן מתואר פרוטוקול להערכת יוביקוויטילציה של מצע בתאי יונקים באמצעות קו-טרנספקציה חולפת של פלסמיד המקודד את המצע שנבחר, יוביקוויטין ליגאז E3 ויוביקוויטין מתויג. לפני התזה, התאים שעברו טרנספקטציה מטופלים במעכב הפרוטאזום MG132 (קרבובנזוקסי-לאו-לאו-לוצינל) כדי למנוע השפלה של פרוטאסומלי במצע. יתר על כן, תמצית התאים מוגשת למיצוי חיסוני בקנה מידה קטן (IP) כדי לטהר את המצע הפוליוביקוויטילטיבי לצורך זיהוי מאוחר יותר על ידי כתם מערבי (WB) באמצעות נוגדנים ספציפיים לתג יוביקוויטין. לפיכך, מתואר פרוטוקול עקבי ולא מסובך לבדיקת יוביקוויטילציה בתאי יונקים כדי לסייע למדענים לטפל ביוביקוויטילציה של מצעים ספציפיים ובליגאזות יוביקוויטין E3.

UXT (תעתיק המבוטא בכל מקום) הוא חלבון דמוי פרפולדין היוצר קומפלקסים של קיפול חלבונים המתבטאים בכל מקום ברקמות עכברים ובני אדם כגון לב, מוח, שרירי שלד, שליה, לבלב, כליות וכבד18. תוארו שני איזופורמים של שחבור של UXT, הנקראים UXT-V1 ו-UXT-V2, המבצעים פונקציות ומיקומים תת-תאיים נפרדים. UXT-V1 מקומי בעיקר בציטופלסמה ובתוך המיטוכונדריה, והוא מעורב באפופטוזיס המושרה על ידי TNF-α ובהיווצרות איתות אנטי-ויראלי19,20. רוב המחקרים התמקדו ב-UXT-V2 שנמצא...

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

פרוטוקול זה מאפשר להעריך את יוביקוויטילציה של מצע מסוים על ידי ליגאז E3. אנו יודעים שהאפיון של אינטראקציית ליגאז-סובסטרט הוא חיוני להבנת תפקודם בתאים. טכניקה זו אינה דורשת ריאגנטים יקרים או ציוד מתוחכם.הוא זקוק לפלסמידים ולקידוד הגנים המעניינים, פיתוח בדיקת אימונופרנציה עם ליזטים של תאים, וכתם מערבי כדי לזהות יוביקוויטילציה של מצע. מספר מחלות אנושיות כמו סרטן והפרעות נוירולוגיות קשורות לדיסרגולציה של ליגאז E3. לפיכך, זיהוי של יוביקוויטילציה של מצע על ידי ליגאז E3 ספציפי יכול לסייע בטיפול או באבחון של מחלות אלה.הדגמת ההליך תהיה על ידי ולנטיין Spagnol. כדי להתחיל, להגדיל את קו תאי HEK293T ל-80 עד 90% מפגש במדיום הנשרים המהונדס של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-100 יחידות פניצילין, 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין ו-0.292 מיליגרם למיליליטרים L-גלוטמין. לאחר מכן, דגירו את התרבית הזו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות ב-5% פחמן דו-חמצני.מעבירים את התאים על ידי שאיפת המדיה מצלחת התרבית באמצעות פיפטה סרולוגית ושוטפים אותם פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS 1X מעוקר. לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת חומצה טריפסין אתילנדיאמינט-אצטית ולאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, החייאת תאים אלה בשני מיליליטרים של מדיית גדילה באמצעות פיפטה סרולוגית. מעבירים את מתלי התא לצינור וצנטריפוגה טריים ונקיים של 15 מיליליטר ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר בעדינות את ה-supernatant ובצע החייאה של גלולת התא בשלושה מיליליטרים של מדיית גדילה על-ידי צפירה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיף תא הומוגני. לאחר מכן, העבר מיליליטר אחד של תרחיף תא זה לתבשיל תרבית TC שטופל ב-100 מילימטרים המכיל תשעה מיליליטרים של מדיית גדילה. לפני הטרנספקציה, יש לאשר אם התאים נקיים מזיהום ובמפגש הולם עבור טרנספקציות חולפות.עבור כל דגימת טרנספקציה, הכינו את קומפלקסי הדנ"א-פוליאתילן-פוליאתילן על ידי דילול שלושה מיקרוגרם של כל פלסמיד ב-100 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת Opti-MEM 1 ללא תוספת וערבובו בעדינות על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה. לאחר מכן, להפשיר את הדנ"א-פוליאתילן בטמפרטורת החדר ולהוסיף אותו לתמיסה בעקבות פרופורציה של שלושה מיקרוליטרים של DNA-פוליאתילן לכל מיקרוגרם אחד של דנ"א. הומוגניזציה של התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה.לאחר מכן, דגירה אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים DNA-פוליאתילן. הוסיפו את הנפח הכולל של קומפלקסי דנ"א-פוליאתילן-פוליאתילן לכל מנה המכילה את תרבית התאים וערבבו אותה בעדינות על ידי נדנדת הצלחת קדימה ואחורה. לאחר מכן, דגירו את התאים האלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים לחות.לאחר הדגירה ושש שעות לפני הדגירה, טפלו בתאים שעברו טרנספקציה באמצעות מעכב פרוטאזום MG132 בעל 10 מיקרומולר ודגמו את התאים בחממת תרביות התאים הלחות. לאחר מכן, שאפו את המדיה מכל צלחת תרבית באמצעות פיפטה סרולוגית ושטפו את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של 1X PBS. לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת טריפסין מיליליטר אחד ודגרו את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.בצעו שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיית גדילה והעבירו את תרחיף התא למיקרו-צינורית דו-מיליטרית טרייה ונקייה וצנטריפוגה ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסירו את הסופרנטנט על ידי מזיגתו בזהירות והחזירו בעדינות את גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה MP40 קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכבי הפרוטאז והפוספטאז. לאחר מכן להעביר את הפתרון הזה למיקרו-טיוב נקי של 1.5 מיליליטר.דגירה של תא זה ליזאט במשך 30 דקות על קרח, ולאחר הדגירה, צנטריפוגה התא lysates ב 16, 900 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בינתיים, לאזן את החרוזים נגד HA אגרוז עם חיץ ליזה MP40 קר כקרח. השתמש ב-15 מיקרוליטרים של חרוזי אגרוז אנטי-HA עבור כל דגימה.לשטוף את החרוזים עם 200 microliters של מאגר ליזה MP40 על ידי פעימתם בצינור מיקרו צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנטנט בזהירות עם פיפטה וחזרו על התהליך הזה שלוש פעמים. לאחר מכן, השאירו את החרוזים מאוזנים על קרח עד לשימוש.לאחר צנטריפוגה של התא ליזאט, לשחזר את הסופרנטנט ולכמת את תכולת החלבון בליזאט הכולל באמצעות שיטת ברדפורד כדי להבטיח שכל דגימה הנתונה לפרציפציה חיסונית מציגה כמות שווה של חלבון. דגירה את הנפח הדרוש של ליזאט התא עם חרוזי האגרוז האנטי-HA המשוזנים במשך ארבע שעות, תוך סיבוב עדין באינקובטור מסתובב בארבע מעלות צלזיוס, מה שמאפשר ל- UXT-V2-HA להיקשר לחרוזים האנטי-HA האגרוזים. אספו את החרוזים נגד HA על ידי פעימות שלהם בצינור מיקרוצנטריפוגה ב-3, 000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ ליזיס של תאי MP40 קרים כקרח ופעמיים עם חיץ FLAG HA קר כקרח. לאחר הכביסה הסופית, הסר את כל הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה והורד את החלבון הפולי-יוביקוויטילציה עם 300 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד HA המדולל על חיץ FLAG HA.דגירה של חרוזי אנטי-HA אגרוזים עם פפטיד HA למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בפלטפורמת שייקר מתנדנדת. לאחר מכן, סובבו את החרוזים ב-3, 000 פעמים G במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס והסירו בזהירות את הסופרנטנט המכיל את החלבונים הרב-יוביקוויטינאטים. במידת הצורך, יש לאחסן את האלוף במיקרו-טיוב טרי ונקי במינוס 20 מעלות צלזיוס.לפתור את eluents ואת התא lysates ב 10% נתרן דודציל סולפט polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה ו immunoblotting. כדי לבצע כתם מערבי להעברה רטובה, מניחים את הג'ל בכריך העברה המורכב מנייר סינון, נייר סינון קרום ג'ל, מרפדים אותו ברפידות ולוחצים עליו יחד על ידי רשת תמיכה. לאחר מכן, מקם מערכת זו אנכית במיכל מלא בחיץ העברה בין אלקטרודות תיל נירוסטה או פלטינה.ההעברה מתרחשת במשך 90 דקות ב 150 וולט במאגר העברה רטוב. לבסוף, בדקו את קרום האימונובלוט באמצעות נוגדן אנטי-מייק. הפולי-יוביקוויטילציה הספציפית של UXT-V2-HA המתווכת על ידי חלבון F-box 7 בתאים נצפתה לאחר שבדקה את ה-eluent מ-anti-HA immunoprecipitation עם נוגדן נגד myc, המזהה את ה-myc-ub המצומד למצע.הספציפיות של אנטי-מיק עבור מצע פולי-יוביקוויטילציה הוצגה בנתיבים 1 ו-2, שבהם לא זוהתה מריחה של חלבונים פולי-יוביקוויטילציה כאשר התאים עברו טרנספקטציה משותפת עם חלבון F-box 7 ו-myc-ub בהיעדר פלסמיד UXT-V2-HA. בנוסף, לא הודגם שום מריחה המתאימה לפולי-יוביקוויטינציה של חלבון בשילוב של חלבון F-box 7 ו-UXT-V2-HA ללא ה-myc-ub plasmid. כאשר חלבון F-box מסוג F בעל וקטור ריק מסוג F-box 7 או F-box חלבון 7 מוטציה שלא היה מסוגל להרכיב SCF פעיל הומר בשילוב עם UXT-V2-HA ו- myc-ub, נצפה אות מריחה חזק של UXT-V2 רב-יוביקוויטילציה רק עבור חלבון F-box מסוג פראי 7, מה שמרמז על כך ש-UXT-V2 היה רב-יוביקוויטילציה על ידי קומפלקס קומפלקס SCF F-box 7 ותאים בהשוואה לבקרים.הצעדים החד-משקעיים, כולל דגירה של ליזטים של תאים עם החרוזים המשוזנים וההתרוממות של חלבונים שעברו חיסון, חיוניים להשגת המטרה של פרוטוקול זה. לאחר הליך זה, יש לבצע בדיקת יוביקוויטילציה במבחנה כדי לאשר את הספציפיות של יוביקוויטילציה של המצע על ידי הליגאז E3.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים...

זיהוי של חלבון Ubiquitination

סרטון זה מדגים את שיטת in vitro עבור SUMOylation של חלבוני סובסטרט באמצעות מפל אנזימים רציף. יתר על כן, מצב SUMOylated של החלבון מזוהה באמצעות אלקטרופורזה וטכניקת immunoblotting.

בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

מטרת כתב היד היא להציג מיתאר למחקרים הביוכימיים והפונקציונליים המקיפים את הליסים של הטבעת. צינור מרובה-צעדים זה, עם פרוטוקולים מפורטים, מאמת פעילות אנזימטית של החלבון שנבדק ומדגים כיצד לקשר את הפעילות לפעולה.

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאוביקוויטין של Streptococcus pneumoniae באמצעות ליזאט תאי יונקים או קומפלקס אנזימי יוביקוויטין טהור, ולאחר מכן טיפול בקומפלקס חלבון VCP/p97-UFD1-NPLOC4 מטוהר להערכת פעילותו הבקטריוליטית, ומאפשר חקר אפקטורים חיסוניים התלויים ביוביקוויטין.

In-vitro שיקום של יוביקוויטינציה חיידקית וחיסול בתיווך VCP/p97

למדו להעריך יוביקוויטילציה של מצע על ידי ליגאז E3 בליסאטים של תאי יונקים. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות ליגאז-מצע ולהבין תפקידן במחלות כמו סרטן ומחלות נוירולוגיות.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

גלה סרטונים נוספים