Name: מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: למד מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבי דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני שחרור נוירוטרנסמיטרים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתוכניות המחקר התוך-גופיות של NINDS (ZIA NS003009-13 ו- ZIA NS003105-08) על התמיכה בעבודה זו.

<ol><li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li>
<li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li>
<li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li>
<li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356(2014).</li>
<li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%2C+60+years+after+the+first+cartoon%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Letters%22%5BJournal%5D)">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li>
<li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li>
<li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503(2021).</li>
<li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow%2C+release-unproductive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li>
<li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li>
<li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604(2016).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li>
<li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).</li>
<li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin+cells%3A+the+peripheral+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li>
<li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+%28SSV%29+and+large+dense-core+vesicle+%28LDCV%29+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li>
<li>Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThahouly%2C+T+%22Exocytosis+and+Endocytosis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology</a>. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li>
<li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li>
<li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX-box+protein%2C+prenylation+process+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).</li>
<li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר 4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר אקסו-פיטום ואנדוציטוזה. עיבוד תמונה קונפוקלי שיטתי מספק מידע על מצבים שונים של התנהגויות נקבוביות לאירועי היתוך וביקוע.
ניטור סימולטני של זרמי סידן ושינויי קיבוליות באותו תא עם תצורת ...

היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית 1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה 1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.
זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה4, 8,14,15,16,17.
בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים 5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.
כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P2 בקרום הפלזמה 8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט מלח מגנזיום</td><td>Sigma</td><td>A9187-500MG</td><td>ATP להכנת תמיסה פנימית</td></tr><tr><td>Atto 655</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 655-21</td><td>Atto צבע לתווית תמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>נוקלאופקטור בסיסי לנוירונים ראשוניים</td><td>Lonza</td><td>VSPI-1003</td><td>מאגר טרנספקציה אלקטרופורציה יחד עם ערכת</td></tr><tr><td>בורוסיליקט פיפטה זכוכית נימית</td><td>וורנר מכשירים</td><td>64-0795</td><td>קיר סטנדרטי עם נימה OD = 2.0 מ"מ מזהה = 1.16 מ"מ אורך = 7.5 ס"מ</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A2153-50G</td><td>מגיב לעיכול בלוטות</td></tr><tr><td>סידן כלוריד 2 M</td><td>איכות ביולוגית</td><td>351-130-721</td><td>מגיב להכנת תמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>מסנני תאים, 100 ומיקרו; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>חומר לסינון תרחיף תאי כרומפין</td></tr><tr><td>תמיסת צזיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>232041</td><td>מגיב להכנת תמיסה פנימית ומאגר מלאי Cs-glutamate/Cs-EGTA</td></tr><tr><td>קולגנאז P</td><td>סיגמא</td><td>11213873001</td><td>אנזים לעיכול בלוטות</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td>GG-14-Laminin, קוטר 14 מ"מ.#1 עבה 60 חתיכות למינין כיסויים גרמניים מצופים</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270-1KG</td><td>ריאגנט להכנת לוק s תמיסה ופתרון אמבטיה</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td>מגיב להכנת מדיום תרבית</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td>מגיב להכנת מאגר מלאי Cs-EGTA לתמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>אלקטרופורציה ונוקלאופקטור</td><td>Amaxa Biosystems</td><td>Nucleofector II</td><td>העברת פלסמידים לתאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td>מגיב להכנת מדיום תרבית</td></tr><tr><td>FFN511</td><td>Abcam</td><td>ab120331</td><td>נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי לסימון שלפוחיות</td></tr><tr><td>גואנוזין 5'-טריפוספט נתרן מלח הידרט</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td>GTP להכנת תמיסה פנימית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td>מגיב להכנת לוק' s פתרון</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>תוכנה לניתוח מהדק תיקון והצגת נתוני הדמיה</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X תוכנה</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td>תוכנה קונפוקלית לאיסוף וניתוח נתוני הדמיה</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Leica Leica</td><td>TCS SP5</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לאיסוף</td></tr> <tr><td>נתוני הדמיהL-חומצה גלוטמית</td><td>סיגמא</td><td>49449-100G</td><td>מגיב להכנת מאגר מלאי Cs-גלוטמט לתמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>מגבר נעילה</td><td>Heka</td><td>Lock-in</td><td>תוכנה להקלטת קיבול</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד 1 M</td><td>איכות ביולוגית</td><td>351-033-721EA</td><td>מגיב להכנת תמיסה פנימית ותמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>המציטומטר מתכתי Hausser Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>תא ספירה</td> <td>3120</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>פיפטות פולניות לשיפור היווצרותם ויציבותם של אטמי ג'יגה-אוהם</td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td></td><td>SLGPR33RB חומר לשטיפה ועיכול</td></tr><tr><td>בלוטות mNG (mNeonGreen)</td> <td>אלל ביוטכנולוגיה</td><td>ABP-FP-MNEONSB</td><td>תבנית ל-PH-mNeonGreen בנייה</td></tr><tr><td>ניילון רשת סינון מסך סינון 100 מיקרון</td><td>EIKO CO</td><td>03-100/32</td><td>חומר לסינון מתלה מדולה</td></tr><tr><td>מהדק תיקון EPC-10</td><td>Heka</td><td>EPC-10</td><td>מגבר לנתוני תיקון-מהדק אוסף</td></tr><tr><td>PH-EGFP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #51407</td><td>עמוד שדרה לבנייה PH-mNeonGreen</td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td>הכינו פיפטות להקלטת מהדק תיקון</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P5404-500G</td><td>מגיב להכנת לוק ' s פתרון ופתרון אמבטיה</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>דופק Heka</td><td></td><td>Pulse תוכנה לאיסוף נתוני תיקון-מהדק תא</td></tr><tr><td>הקלטה תא כיסוי</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1943/QR-40LP</td>, <td>החל פיפטה מהדק תיקון על תאים חיים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S7653-1KG</td><td>מגיב להכנת לוק' תמיסה, תמיסת אמבטיה ותמיסה פנימית</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>S5881-500G</td><td>מגיב להכנת לוק' s תמיסה</td></tr>: <tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>S0876-500G</td><td>ריאגנט להכנת לוק' s תמיסה</td></tr>: <tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>S8282-500G</td><td>ריאגנט להכנת לוק' s פתרון</td></tr><tr><td>ערבוב פלטה חמה</td><td>Barnsted / Thermolyne</td><td>סוג 10100</td><td>תנור חימום לציפוי פיפטה עם מזרק שעווה</td></tr><tr><td>, 30 מ"ל</td><td>Becton Dickinson</td><td>302832</td><td>חומר לשטיפה ועיכול</td></tr><tr><td>של בלוטות Tetraethylammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>T2265-100G</td><td>TEA להכנת תמיסת אמבטיה</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין</td><td>Sigma</td><td>T9253-5G</td><td>מגיב לעיכול בלוטות</td></tr><tr><td>סוג F נוזל טבילה</td><td>Leica</td><td>195371-10-9</td><td>שמן הרכבה קונפוקלי של Leica</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.
כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P2) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.

בעקבות ההליכים הניסיוניים שהוכחו באיור 1 ובאיור 2, תאי כרומפין מבלוטת יותרת הכליה של בקר הועתקו עם PH-mNG כדי לתייג את קרום הפלזמה; A655 נוסף לתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך; והנוירוטרנסמיטר הכוזב הפלואורסצנטי FFN511 הועמס בשלפוחיות לזיהוי שחרור. לאחר מכן, הדמיית זמן קונפוקלית במישור XY של FFN511, PH-mNG ו-A655 בוצעה כל 20-90 אלפיות השנייה בתחתית התא (מישור מוקד Z ~100-200 ננומטר מעל קרום התא). הקלטה של מהדק טלאי של תאים שלמים ויישום של דה-פולריזצי...

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

היתוך ממברנה מתווך פונקציות ביולוגיות רבות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי דינמיקה של פתיחת נקבוביות היתוך ושחרור משדרים והבחנה בין שלושה מצבי היתוך:סגירת היתוך, היתוך שהייה והתכווצות היתוך. השילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי ורישום מהדק טלאי מאפשר הדמיה של פתיחת נקבוביות היתוך וסגירה וקביעת הקינטיקה שלהן.למרות שהוא מתואר עבור תאי כרומפין, עקרון השיטה המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין. יישום מוצלח של שיטה זו תלוי במספר שלבים כלליים, כגון יצירת תרבית תאים כרומפינית ראשונית בריאה, יעילות מספקת של טרנספקציה של פלסמיד ושיעורי הצלחה גבוהים ברישום אלקטרופיזיולוגי. בחר שלוש בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסר את רקמת השומן עם מספריים.לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. לעיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק 30 מילימטר המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן להשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נוספות. לאחר העיכול, לחתוך את הבלוטה אורכית מן הווריד יותרת הכליה לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה. בודדו את המדולה הלבנה על ידי פינצטה לחתיכות לתוך צלחת פטרי באורך 10 סנטימטרים המכילה את התמיסה של לוק.חותכים וכורכים את המדולה במספריים. סנן את תרחיף המדולה באמצעות רשת ניילון בגודל 80 עד 100 מיקרומטר לכוס. מעבירים את התסיס לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48x גרם למשך שלוש דקות עם האטה של שלוש.לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את תרחיף התא עם מסננת של 80 עד 100 מיקרומטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48 x גרם במשך שלוש דקות עם האטה שלוש. מוציאים את הסופרנאטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מיליליטרים של מדיום תרבית.קבע את מספר התא באמצעות תא ספירה של המוציטומטר. להעביר 2, 800, 000 תאים לתוך צינור 15 מיליליטר. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 x g במשך שתי דקות עם האטה של שלושה.הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר טרנסקציה המסופק על ידי היצרן לכדור התא. ואז להוסיף שני מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG. ערבבו בעדינות את המתלים על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי.העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור, בחר את תוכנית 005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה. לאחר אלקטרופורציה, מיד להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום לקובט ולערבב בעדינות עם micropipette מצויד קצה סטרילי. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים האלקטרו-פוריים על החלקת הכיסוי בכל צלחת בציפוי של חמישה עד שישה כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.מעבירים בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות ומוסיפים בעדינות שני מיליליטרים של מדיום מוכן מראש לכל מנה לאחר 30 דקות. מכינים פיפטות טלאים מנימי זכוכית בורוסיליקט על ידי משיכתם במשיכת פיפטה, ציפוי קצותיהם בשעווה נוזלית וליטושם במיקרופורז'. הפעל את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעל את התוכנה.הגדר את הפרמטרים המתאימים של זרם הסידן והקלטת הקיבוליות של התוכנה. קבע פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של רישום מהדק מתח ל-80 מיליבולטים.קבעו דה-פולריזציה של שנייה אחת ממינוס 80 מיליוולט ל-10 מיליוולטים כגירוי לגרום לזרימת סידן וקפיצת קיבוליות. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה. הפעילו את הלייזרים, כולל 458 ננומטרים, 514 ננומטרים ו-633 ננומטרים וקבעו את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר לפי כל גשושית פלואורסצנטית.בחרו מנה עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסיפו שני מיקרוליטרים של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי FFN511 לתוך המדיום בצלחת. מחזירים את המנה לאינקובטור למשך 20 דקות. לאחר טעינת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 50 מיקרוליטרים של תמיסת אמבטיה.מעבירים את פתק העטיפה מהתבשיל לתא ההקלטה עם פינצטה ומיד מוסיפים את תמיסת ה-A655 המכילה אמבטיה. הניחו טיפת שמן על יעד טבילת השמן 100X. הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלקה התחתונה של הכיסוי.הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בשדה בהיר ובהדמיה קונפוקלית כדי למצוא תא מתאים עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר ומרכז אותו בשדה הראייה, תוך מזעור אזורים ריקים. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע של FFN511, PH-mNG ו- A665 עם מרווח זמן מינימלי.התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית כוונון עדינה. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. מוסיפים תשעה מיקרוליטרים של תמיסה פנימית לתוך פיפטת טלאי ומחברים את הפיפטה למחזיק שלב מגבר מהדקי התיקון.יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא בערך בין שניים לארבעה מגה-כמס עם בדיקת דופק מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות מיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב מחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא. שנה את פוטנציאל ההחזקה מאפס למינוס 80 מיליוולטים תוך הפעלת לחץ שלילי עדין עם מזרק.לאחר שההתנגדות עוברת ג'יגה-אוהם אחד, המתן כ-30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה. כדי ליצור מצב סיטונאי, להחיל פולסים קצרים אך חזקים של לחץ שלילי עם המזרק עד הקרום נקרע.לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל את ההדמיה של קיטועי הזמן הקונפוקלי ואת הקלטת מהדק התיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל עם שני יישומי תוכנה שונים.לאחר ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה לאפס מיליבולטים. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל יצרן או תוכנה שסופקה. עבור אל Process, לחץ על ProcessTools והשתמש בכלים כדי ליצור קבצים ממוצעים מתגלגלים עבור כל תמונה של פגרת זמן. שמור קבצים אלה.תחת כימות, עבור אל כלים ולחץ על לחצני פרופיל מחסנית כדי לבדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי ולזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף אזורי עניין עבור אירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור.לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקובץ ההדמיה הגולמי כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה. עבור אל כלים ולחץ על מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה.לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה בתיקיית קבצים. כל ההקלטה של מהדק התא ויישום של דה-פולריזציה של שנייה אחת מ-80 עד 10 מיליבולטים בוצעה כדי לעורר אקסו ואנדוציטוזה. הדפולריזציה המיושמת גרמה לזרם סידן פנימי, קפיצת קיבוליות, המציינת אקסוציטוזה, ודעיכה קיבולית לאחר הקפיצה, מה שמעיד על אנדוציטוזה.עם הדמיית קיטועי זמן בקרקעית התא, אירועי היתוך המושרים על ידי פרוטוקול הדה-פולריזציה של שנייה אחת צוינו כירידה ב-FFN המשקפת שחרור FFN511, מלווה בעלייה פלואורסצנטית נקודתית של FPH ו-A655, המשקפת את הדיפוזיה PH-mNG ו-A655 מממברנת הפלזמה ואת תמיסת האמבטיה לתוך שלפוחית ההתמזגות. האיור מציג היתוך קרוב שזוהה כעמעום F655, בעוד ש-FPH נמשך או נרקב עם עיכוב. האיור מייצג היתוך שהייה שזוהה על ידי נוכחות של נקודות PH-mNG ו- A655.האיור מייצג היתוך כיווץ שזוהה כדעיכה מקבילית של FPH ו-F655 המלווה בהקטנת גודל מקבילה של נקודת PH-mNG ונקודת A655 הקלטה מוצלחת דורשת יצירת תצורת התא כולה עם מהדק טלאי והדמיה בתחתית התא בעוצמה פלואורסצנטית מתאימה לכל ערוץ. השילוב של אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה סופר-רזולוציה המתוארת כאן הוא כלי רב ערך למדידת דינמיקה של נקבוביות היתוך ונוירו-מעגלים עצביים.

confocal-microscopy-to-measure-three-modes-fusion-pore-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים שיטה לבודד מהירה (מיקרו) האירועים סידן והנתיבים איטי יותר בתאים חיים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal. שיטה מודד תנודות בעוצמת הקרינה של אינדיקטורים סידן על ידי קו סריקות הקלטה מאות פיקסלים מספר בתא. ניתוח היסטוגרמה מאפשר לנו לבודד את הכף זמן של והנתיבים סידן שונים.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או בVivo

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

בשל יחס אות לרעש נמוך (SNR) של חיישנים מבוססי העברת אנרגיית תהודה של Fӧrster (FRET), מדידת אותות המחנה הייתה מאתגרת, במיוחד בשלושה ממדים מרחביים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיית דימות וניתוח FRET היפרספקטרלית המאפשרת מדידה של התפלגות המחנה בשלושה ממדים מרחביים.

מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים

למד מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבי דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני שחרור נוירוטרנסמיטרים בזמן אמת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

גלה סרטונים נוספים