מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

היתוך ממברנה מתווך פונקציות ביולוגיות רבות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי דינמיקה של פתיחת נקבוביות היתוך ושחרור משדרים והבחנה בין שלושה מצבי היתוך:סגירת היתוך, היתוך שהייה והתכווצות היתוך. השילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי ורישום מהדק טלאי מאפשר הדמיה של פתיחת נקבוביות היתוך וסגירה וקביעת הקינטיקה שלהן.

למרות שהוא מתואר עבור תאי כרומפין, עקרון השיטה המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין. יישום מוצלח של שיטה זו תלוי במספר שלבים כלליים, כגון יצירת תרבית תאים כרומפינית ראשונית בריאה, יעילות מספקת של טרנספקציה של פלסמיד ושיעורי הצלחה גבוהים ברישום אלקטרופיזיולוגי. בחר שלוש בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסר את רקמת השומן עם מספריים.

לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. לעיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק 30 מילימטר המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן להשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נוספות. לאחר העיכול, לחתוך את הבלוטה אורכית מן הווריד יותרת הכליה לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה. בודדו את המדולה הלבנה על ידי פינצטה לחתיכות לתוך צלחת פטרי באורך 10 סנטימטרים המכילה את התמיסה של לוק.

חותכים וכורכים את המדולה במספריים. סנן את תרחיף המדולה באמצעות רשת ניילון בגודל 80 עד 100 מיקרומטר לכוס. מעבירים את התסיס לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48x גרם למשך שלוש דקות עם האטה של שלוש.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את תרחיף התא עם מסננת של 80 עד 100 מיקרומטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48 x גרם במשך שלוש דקות עם האטה שלוש. מוציאים את הסופרנאטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מיליליטרים של מדיום תרבית.

קבע את מספר התא באמצעות תא ספירה של המוציטומטר. להעביר 2, 800, 000 תאים לתוך צינור 15 מיליליטר. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 x g במשך שתי דקות עם האטה של שלושה.

הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר טרנסקציה המסופק על ידי היצרן לכדור התא. ואז להוסיף שני מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG. ערבבו בעדינות את המתלים על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי.

העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור, בחר את תוכנית 005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה. לאחר אלקטרופורציה, מיד להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום לקובט ולערבב בעדינות עם micropipette מצויד קצה סטרילי. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים האלקטרו-פוריים על החלקת הכיסוי בכל צלחת בציפוי של חמישה עד שישה כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.

מעבירים בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות ומוסיפים בעדינות שני מיליליטרים של מדיום מוכן מראש לכל מנה לאחר 30 דקות. מכינים פיפטות טלאים מנימי זכוכית בורוסיליקט על ידי משיכתם במשיכת פיפטה, ציפוי קצותיהם בשעווה נוזלית וליטושם במיקרופורז'. הפעל את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעל את התוכנה.

הגדר את הפרמטרים המתאימים של זרם הסידן והקלטת הקיבוליות של התוכנה. קבע פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של רישום מהדק מתח ל-80 מיליבולטים.

קבעו דה-פולריזציה של שנייה אחת ממינוס 80 מיליוולט ל-10 מיליוולטים כגירוי לגרום לזרימת סידן וקפיצת קיבוליות. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה. הפעילו את הלייזרים, כולל 458 ננומטרים, 514 ננומטרים ו-633 ננומטרים וקבעו את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר לפי כל גשושית פלואורסצנטית.

בחרו מנה עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסיפו שני מיקרוליטרים של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי FFN511 לתוך המדיום בצלחת. מחזירים את המנה לאינקובטור למשך 20 דקות. לאחר טעינת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 50 מיקרוליטרים של תמיסת אמבטיה.

מעבירים את פתק העטיפה מהתבשיל לתא ההקלטה עם פינצטה ומיד מוסיפים את תמיסת ה-A655 המכילה אמבטיה. הניחו טיפת שמן על יעד טבילת השמן 100X. הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלקה התחתונה של הכיסוי.

הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בשדה בהיר ובהדמיה קונפוקלית כדי למצוא תא מתאים עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר ומרכז אותו בשדה הראייה, תוך מזעור אזורים ריקים. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע של FFN511, PH-mNG ו- A665 עם מרווח זמן מינימלי.

התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית כוונון עדינה. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. מוסיפים תשעה מיקרוליטרים של תמיסה פנימית לתוך פיפטת טלאי ומחברים את הפיפטה למחזיק שלב מגבר מהדקי התיקון.

יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא בערך בין שניים לארבעה מגה-כמס עם בדיקת דופק מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.

הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות מיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב מחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא. שנה את פוטנציאל ההחזקה מאפס למינוס 80 מיליוולטים תוך הפעלת לחץ שלילי עדין עם מזרק.

לאחר שההתנגדות עוברת ג'יגה-אוהם אחד, המתן כ-30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה. כדי ליצור מצב סיטונאי, להחיל פולסים קצרים אך חזקים של לחץ שלילי עם המזרק עד הקרום נקרע.

לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל את ההדמיה של קיטועי הזמן הקונפוקלי ואת הקלטת מהדק התיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל עם שני יישומי תוכנה שונים.

לאחר ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה לאפס מיליבולטים. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.

פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל יצרן או תוכנה שסופקה. עבור אל Process, לחץ על ProcessTools והשתמש בכלים כדי ליצור קבצים ממוצעים מתגלגלים עבור כל תמונה של פגרת זמן. שמור קבצים אלה.

תחת כימות, עבור אל כלים ולחץ על לחצני פרופיל מחסנית כדי לבדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי ולזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף אזורי עניין עבור אירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור.

לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקובץ ההדמיה הגולמי כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה. עבור אל כלים ולחץ על מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה.

לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה בתיקיית קבצים. כל ההקלטה של מהדק התא ויישום של דה-פולריזציה של שנייה אחת מ-80 עד 10 מיליבולטים בוצעה כדי לעורר אקסו ואנדוציטוזה. הדפולריזציה המיושמת גרמה לזרם סידן פנימי, קפיצת קיבוליות, המציינת אקסוציטוזה, ודעיכה קיבולית לאחר הקפיצה, מה שמעיד על אנדוציטוזה.

עם הדמיית קיטועי זמן בקרקעית התא, אירועי היתוך המושרים על ידי פרוטוקול הדה-פולריזציה של שנייה אחת צוינו כירידה ב-FFN המשקפת שחרור FFN511, מלווה בעלייה פלואורסצנטית נקודתית של FPH ו-A655, המשקפת את הדיפוזיה PH-mNG ו-A655 מממברנת הפלזמה ואת תמיסת האמבטיה לתוך שלפוחית ההתמזגות. האיור מציג היתוך קרוב שזוהה כעמעום F655, בעוד ש-FPH נמשך או נרקב עם עיכוב. האיור מייצג היתוך שהייה שזוהה על ידי נוכחות של נקודות PH-mNG ו- A655.

האיור מייצג היתוך כיווץ שזוהה כדעיכה מקבילית של FPH ו-F655 המלווה בהקטנת גודל מקבילה של נקודת PH-mNG ונקודת A655 הקלטה מוצלחת דורשת יצירת תצורת התא כולה עם מהדק טלאי והדמיה בתחתית התא בעוצמה פלואורסצנטית מתאימה לכל ערוץ. השילוב של אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה סופר-רזולוציה המתוארת כאן הוא כלי רב ערך למדידת דינמיקה של נקבוביות היתוך ונוירו-מעגלים עצביים.