Name: חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למדו שיטה ליצירת פציעות בקרנית אפרוח עוברי ללא צלקות. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מנגנוני הריפוי התאיים והמולקולריים בדגם בעלי חיים חשוב לרפואת עיניים ולחקר ביולוגיה התחדשותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח אמנותי ומלומד דרך אוניברסיטת אילינוי ווסליאן ל- TS ומומנה בחלקה על ידי NIH-R01EY022158 (PL).

זן הביצים ששימש בפרוטוקול זה היה White Leghorn, וכל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי ווסליאן.
1. דגירה של ביצי אפרוחים
<ol><li>יש לשמור על הביצים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לאחר הטלתן כדי לעצור את ההתפתחות. כאשר אתם מוכנים להתחיל את התפתחות העובר של אפרוח, נגבו את כל קליפת הביצה במגבונים נטולי מוך (ראו טבלת חומרים) רוויים במים בטמפרטורת החדר כדי להסיר לכלוך ופסולת.</li>
	<li>ודאו שקליפת הביצה מחוטאת. נגבו את כל משטח הביצה במגבונים נטולי מוך עם 70% אתנול. נגבו במהירות את האתנול כדי לייבש את הביצית והימנעו מספיגת אתנול דרך קליפת הביצית אל העובר.</li>
	<li>מסדרים את הביצים בצורה אופקית על מגש. סמן את החלק העליון של הביצית כדי לציין את המיקום הצפוי של העובר. דגירה אופקית של הביצים, כאשר פונקציית הנדנדה מופעלת, באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. חלון הביצים כדי להתכונן לנתיחה של קרום
<ol><li>מוציאים ביצים מהחממה ביום השלישי להתפתחות העוברית (E3). מעקרים את החלק העליון של הביצים עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו עם 70% אתנול. מייבשים את האתנול ממשטחי קליפת הביצה. הערה: כדי להבטיח שהפיתוח לא יתעכב במהלך הליך החלונות, הוסרו 6-12 ביצים, וההליך בוצע במהירות על אלה בזמן שהביצים הנותרות הושארו באינקובטור.</li>
	<li>מקמו ביצה בצורה אופקית במחזיק ביצה מאובטח (ראו טבלת חומרים). באמצעות הקצה החד של מספריים ניתוח, ליצור חור קטן בחלק העליון של קליפת הביצה ליד הקצה המחודד של הביצה. הערה: חור זה יקל על הסרת אלבומן, הנחוצה כדי להפיל את החלמון והעובר הרחק ממשטח קליפת הביצה הפנימי. עבור מחזיקי ביצים, נעשה שימוש בדירות מילוי ביצים עיסת נייר, שבתוכם נשלחות הביצים.</li>
	<li>דרך החור (שלב 2.2.), הכניסו מחט היפודרמית משופעת של 18 גרם. כאשר המחט נדחפת אל המשטח הפנימי התחתון של הביצה והצד המשופע של המחט פונה לקצה המחודד של הביצה (למשל, הרחק מהמיקום הצפוי של החלמון והעובר ליד אמצע הביצה), יש להסיר 2-3 מ"ל של אלבומן מביצת התרנגולת ולהשליך. הערה: אם המחט של האדם תניק את העובר או את כלי הדם הקשורים אליו במהלך שלב זה, זה יגרום לכך שהדם ישאף לאלבומן. זה יגרום למוות של עובר. יתר על כן, אם החלמון שואף בשוגג יחד עם האלבומן במהלך שלב זה, העובר לא יהיה בר קיימא. בכל מקרה, יש להשליך את הביצית אם לא ניתן להשתמש בעובר באופן מיידי למטרות אחרות.</li>
	<li>נקו את משטח קליפת הביצה המקיף את החור עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו קלות עם 70% אתנול ונגבו את הייבוש. אטום את החור שנועד להסרת אלבומן עם סרט שקוף.</li>
	<li>עם הקצה החד של ניתוח המספריים, צרו חור "חלון" שני בחלק העליון של קליפת הביצה באתר הסימון (שלב 1.3.). יש לוודא שהמספריים אינם מתרחבים רחוק מדי לתוך קליפת הביצית כדי להימנע ממגע ופגיעה בעובר או בכלי הדם העובריים, שלעתים קרובות ימוקמו בתוך הביצית ישירות מתחת לאתר החור השני.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים מעוקלים של הקשתית, מרחיבים את חור ה"חלון" כך שיתפרש על פני כ-2-3 ס"מ קוטרם ומשמשים כ"חלון" לעובר המתפתח שמתחת לקליפה.<ol>
<li>הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה. ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של 2-3 ס"מ שמכסה ישירות את העובר. הערה: ביצים שבהן העוברים אינם מוטלים ישירות מתחת לחור שנוצר בשלב 2.6. אסור להשתמש בהם מכיוון שניתוחי הממברנה הקרובים יהיו מאתגרים להשלמה. אפילו עם נדנדה אופקית של הביצים, כ -10% מהביצים אינן שמישות בשל המיקום הלקוי של העובר. עוברים אלה יכולים לשמש למטרות אחרות.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי להגביל את הזיהום החיידקי, יש להוסיף דרך חור החלון (למשל, לתוך הביצה) ~ 100-200 μL של תמיסת רינגר (8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, ו-0.23 גרם של CaCl2.2H 20 לכל L של H20 מזוקק) המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין (50 U/mL של פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>אטמו את חור החלון באמצעות סרט דבק שקוף. בצע את איטום הביצה על ידי יישור פינה של הסרט על הציר הארוך של החור ולחיצה על הקלטת לקליפה במרחק של כ-1-2 ס"מ מקצה החור.<ol>
<li>ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הסרט יחד, יצרו צורה כיפה מעל החור, ולחצו על דש הסרט התלוי יתר על המידה על הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה. הערה: ביצים צריכות להיות בחלון E2 או E3. לפי הניסיון, חלון לפני E2 גורם לכדאיות עוברית נמוכה. יתר על כן, על ידי E4, העובר והממבריונים החוץ-אמבריוניים נקשרים לקליפת הביצה10, וכל ניסיון לחלון E4 או מאוחר יותר גורם לעתים קרובות לפגיעה בעוברים או לקריעה של כלי דם חוץ-ממבריוניים, כאשר כל אחד מהאירועים מוביל לתוצאה של מוות עוברי.</li>
	</ol></li>
	<li>להחזיר את הביצים "החלונות" לחממה להמשך פיתוח. הקפידו לשמור על הביצים אופקיות ולכבות את פונקציית הנדנדה של האינקובטור.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.2.-2.9. עבור כל ביצה.</li>
</ol>3. מיקרו-דיסקציות של הקרומים החוץ-ממבריוניים
<ol><li>הסר ביצה עם חלונות E5.5 מהאינקובטור. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לצפות בעובר ובקרומים החוץ-ממבריוניים שלו דרך החלון. במידת הצורך, השתמשו במספריים או במלקחיים מעוקלים של הקשתית כדי להרחיב את החלון כך שהעובר ימוקם היטב מתחת לחלון, תוך הקפדה שלא לפגוע בכלי הדם העובריים.<ol>
<li>הוסיפו שתי טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהעובר נמצא בשלב ההתפתחותי הנכון (המבורגר המילטון שלב 27, ~E5.5)11,12 ואתר את מיקומם של קרום השפיר (ACM) והממברנה הכוריואלנטואית (CAM). הערה: בשלב זה, העובר מוקף ב-ACM, הכולל את קרום מי השפיר ואת הממברנה הכוריונית העילית המתמזגת ומכוסה חלקית באלנטואה בעלת כלי הדם הגבוהים, המשתרעת מאזור המעיים של העובר ומתמזגת עם כוריון הכיסוי ליצירת CAM11,12. ה-ACM אינו בעל כלי דם כבדים, מה שמאפשר לנתח את הממברנות הללו כדי לחשוף את העובר מבלי לפגוע בכלי הדם ולפגוע בעובר.</li>
	<li>בצע ניתוחי קרום חוץ-אמבריוניים בשלב זה (E5.5). הערה: E5.5 הוא הזמן האידיאלי לבצע את ניתוחי הממברנה החוץ-אמבריונית. ניתוח הממברנות מוקדם יותר (למשל, ב-E4) לפני היווצרות CAM מפחית את נגישות העוברים בשלבים מאוחרים יותר11. יתר על כן, ב- E5.5, העובר מכוסה רק באופן חלקי על ידי ה- CAM בעל כלי הדם הגבוהים, אך במהלך 1-2 הימים הבאים, ה- CAM עוטף במהירות ומונע גישה נוספת לעובר11,12. מסיבה זו, כריתת ממברנה ב- E6 ואילך מאתגרת ככל שהסיכון לקריעת כלי דם עולה.<ol>
<li>השתמשו בזוג מלקחיים עדינים מעוקרים כדי לתפוס בעדינות את ה-ACM ולהרחיק אותו מהעובר. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור ב- ACM ישירות מעל המצח המשתרע מהממברנה מעל הממברנה שמעל המצח ועד לממברנה שמעל הראש. הערה: צעד זה מרגיע את קרום הכוריון והאמניון, ובכך מקל על אחיזתם וניתוחם עוד יותר עם מלקחיים בשלבים הבאים. ראו איור 1 לשרטוט מועיל של האופן שבו מנתחים את הממברנות דרך חלון קליפת הביצה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בשני זוגות של מלקחיים עדינים וסטריליים כדי לתפוס בעדינות את השן בשתי תנוחות סמוכות בין ה-ACM ל-CAM (למשל, אזור בין החתך שנעשה מעל ה-forelimb לקצה הקרוב ביותר של ה-CAM).<ol>
<li>הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה, כאשר זוג אחד נע בגב אל העובר והשני בגחון. הערה: תנועה זו משמשת לקריעת השן עוד יותר תוך הפרדת ה-ACM (הנמשך בכיוון הגב ביחס לעובר על ידי זוג מלקחיים אחד) לבין ה-CAM (הנמשך בכיוון הגחון ביחס לעובר על ידי זוג המלקחיים השני).</li>
		<li>יש לוודא שהממברנות מופרדות כאשר ה-CAM אינו מכסה עוד את העובר, והעורק והווריד האלנטואיים, הנובעים מהמעיים העובריים אל ה-CAM, נראים לעין בקלות.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש במלקחיים עדינים מעוקרים כדי לנתח ולהסיר את כל קרום השן שנותר המכסה את העובר. זה נפוץ ביותר ציין כי אמנון הנותרים יכסה חלקית את המחצית הקאודלית של העובר.<ol>
<li>באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את השמניון ליד אזור אמצע הגולגולת של העובר ומשכו בזהירות את האמניון בכיוון קאודלי ביחס לעובר לכיוון ה-CAM שנעקר מוקדם יותר. העובר ייחשף כעת באופן מלא, וצמיחה נוספת של ה-CAM תתרחש בעיקר הרחק מהעובר המתפתח. הערה: ראה איור 1 לקבלת סכמות מועילות לגבי האופן שבו העובר שנחשף יופיע לאחר כריתת ממברנה. כמו כן, עיין בדוח11 שפורסם בעבר לקבלת דיאגרמות סכמטיות מועילות של שלבים 3.3.-3.6.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.</li>
	<li>אטום מחדש את חור החלון באמצעות סרט שקוף, כמתואר בשלב 2.8. מחזירים את הביצה לחממה להמשך פיתוח, שומרים על הביצה אופקית ושומרים על תפקוד הנדנדה של האינקובטור מושבת.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1.-3.8. עבור כל ביצה. הערה: ניתוחי הממברית החוץ-אמבריונית ב-E5.5 שתוארו לעיל יאפשרו גישה לעובר דרך E7, כלומר כאשר ניתן לבצע פציעה 8,9. על ידי E8, הצמיחה המתמשכת של רקמת CAM מתחילה לכסות את אזור הגולגולת של העובר, ובכך מונעת גישה נוספת לקרנית. אם רוצים לבצע פציעה בקרניות E8-E9 ישנות יותר, ניתן למקם מחדש את הגחון של CAM הגדל ביחס לעובר (שלב 3.10)." אם רוצים לפצוע ב-E7, שלב 3.10. אין צורך לבצע ואפשר להמשיך לשלב 4, פציעת הקרנית.</li>
	<li>הסר ביצת E7 מהאינקובטור שהקרום החוץ-אמבריוני שלה נותח בעבר ב- E5.5 (שלבים 3.1.-3.8.). תפסו עם מלקחיים מעוקרים כל רקמות קרום אמניון זמינות שהתמזגו עם ה-CAM ומשכו בעדינות את קרום האניון הרחק מאזור הגולגולת של העובר בכיוון הגחון ביחס לעובר. הערה: מכיוון שקרום השפיר שנעקר מהעובר מתמזג עם ה-CAM, ה-CAM הגדלה והסקולרית מאוד תעקוב אחר המלקחיים האוחזים באמניון ותתרחק מאזור הגולגולת. חזור על שלב זה מדי יום כדי להרחיק את ה- CAM ללא הרף מהעובר עד שהעובר נמצא בגיל הרצוי לפציעה.</li>
</ol>4. פציעת קרנית
<ol><li>קבל ביצה מהחממה לפציעה בגיל העוברי הרצוי, E7-E9. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים. הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.</li>
	<li>השתמשו בסכין מיקרו-ניתוחית כדי ליצור חתך שמשתרע על פני היקף הקרנית של עין ימין (בשל האופן שבו העובר מטיל את הביצית, עין שמאל אינה נגישה אך יכולה לשמש כבקרה שאינה פצועה), המקבילה לסדק הכורואידי (איור 1) ובהתאם לו. החתך הראשון יחצה את אפיתל הקרנית.<ol>
<li>השתמש בסכין המיקרו-ניתוח כדי לחתוך שוב את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון פי 2 יותר (למשל, שלושה חתכים בסך הכל, כאשר חתך 2 וחתך 3 מתרחשים יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו חתך 1)11. החתך השני יחצה את קרום המרתף, והשלישי יחדור את הסטרומה הקדמית. הערה: אם העובר התיישב תחת ה-CAM המנותח, ניתן להשתמש במלקחיים מעוקלים מעוגלים מעוגלים מעוקרים של הקשתית כדי להזיז בזהירות את הראש החוצה מתחת ל-CAM. מקם את מלקחי הקשתית המעוקלים מתחת לראש, תוך יצירת מגע עם הצד השמאלי של הראש. ערסלו את כל הראש על גבי מלקחיים סגורים מעוקלים של הקשתית והרימו בעדינות את הראש סביב ומעל ה-CAM. כדי לסייע בכדאיות, השתמש בטכניקה דומה עם מלקחיי הקשתית המעוקלים כדי לתחוב את העובר בחזרה מתחת ל- CAM לאחר הניתוח כדי לקדם צמיחה נכונה של ה- CAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסיפו 3-4 טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.</li>
	<li>אטום מחדש את חור החלון בנייר דבק שקוף וחזור לחממה, תוך השארת הביצה אופקית. אפשרו לעובר להתפתח ולפצע הקרנית להחלים לתקופה הרצויה (למשל, 0.5-11 יום), ולאחר מכן להרדים את העובר באופן הומני על ידי עריפת ראשים.</li>
	<li>השתמשו במלקחי קשתית מעוקלים כדי לקצור את העין מעובר המתת חסד שצף בצלחת פטרי של תמיסת המלח של רינגר על ידי אחיזה עדינה של העין בצד האחורי שלה, היכן שהעין ורקמת הפנים נפגשות, והרמת העין כולה בזהירות הרחק והשתחררות מרקמת הפנים.<ol>
<li>השתמש במלקחיים עדינים כדי לתקוע חור קטן (3-5 ס"מ) בחלק האחורי של העין כולה ולתקן את כל העין ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C ב הלילה עם תסיסה קלה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global perspective.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).</li>
<li>Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+cornea+as+a+model+of+wound+healing+and+neuronal+re-innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation.</a> Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).</li>
<li>Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sutures+and+dendritic+polymer+adhesives+for+corneal+laceration+repair+in+an+in+vivo+chicken+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model.</a> Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).</li>
<li>Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+corneal+wound+healing+research%3A+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus).</a> Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).</li>
<li>Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+TGF-%CE%B2+isoforms+and+signaling+intermediates+in+corneal+fibrotic+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).</li>
<li>Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounded+embryonic+corneas+exhibit+nonfibrotic+regeneration+and+complete+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).</li>
<li>Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+normal+collagen+architecture+in+embryonic+wounded+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).</li>
<li>Spurlin, J., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+dependent+and+independent+growth+phases+of+the+embryonic+chick+eye+and+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).</li>
<li>Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing+in+tenascin+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing in tenascin knockout mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).</li>
<li>Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+enhancement+of+corneal+epithelial+wound+healing+of+rabbits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo.</a> Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).</li>
<li>Sumioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cornea+wound+healing+in+a+tenascin+C-deficient+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model.</a> Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).</li>
<li>Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tenascin+and+cellular+fibronectin+in+the+rabbit+cornea+after+anterior+keratectomy.+Immunohistochemical+study+of+wound+healing+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).</li>
<li>Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-derived+Semaphorin3A+regulates+sensory+innervation+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea.</a> Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+corneal+innervation%3A+interactions+between+nerves+and+specialized+apical+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).</li>
<li>Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+sulfated+glycosaminoglycans+and+their+effects+on+trigeminal+nerve+growth+cone+behavior+in+vitro%3A+roles+for+ECM+in+cornea+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).</li>
<li>Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+posttranslational+modification+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+isotype+during+chick+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).</li>
<li>Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+for+quantitative+analysis+of+collagen+fibrillar+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure.</a> Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Waldvogel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bird%27s+eye+view%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">The bird's eye view.</a> American Scientist. 78, 342-353 (1990).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).</li>
<li>Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+wound+healing+response%3A+cytokine-mediated+interaction+of+the+epithelium%2C+stroma%2C+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים בנוגע למידע המוצג בכתב יד זה.

האפרוח הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר תיקון פצעי קרנית עובריים, ללא צלקות. בניגוד ליונקים, האפרוח נגיש בקלות לאורך כל הפיתוח באמצעות אסטרטגיות אובו8 או אקס אובו 24. הקרנית של האפרוח העוברי גדולה בהרבה מהקרניות של מכרסמים, כאשר כמעט 50% מנפח הגולגולת מוקדש לעין25, מה שהופך אותה למקובלת מאוד על מניפולציות פיזיות כמו פציעה. יתר על כן, ביצי עוף זמינות בקלות כל השנה, לעתים קרובות מחוות מקומיות, וחסכוניות, ודורשות רק חממה צנועה כדי לתמוך בפ...

הקרנית היא הרקמה השקופה והחיצונית ביותר של העין שמעבירה ושוברת אור התורם לחדות הראייה. בקרנית הבוגרת, נזק או זיהום לסטרומה הקרנית מובילים לתגובת ריפוי פצעים מהירה וחזקה המאופיינת בשגשוג קרטוסיטים, פיברוזיס, דלקת מוגברת המובילה לאפופטוזיס הנגרמת על ידי ציטוקינים, יצירת מיופיברובלסטים לתיקון, ושיפוץ כולל של המטריצה החוץ-תאית (ECM)1,2 . בעקבות הפציעה, תיקון רקמת הקרנית גורם לרקמת צלקת אטומה המפחיתה את שקיפות הקרנית ומונעת את מעבר האור, ובכך מעוותת את הראייה ובמקרים הקשים ביותר, מובילה לעיוורון הקרנית3. לפיכך, יש צורך ברור לפתח מודלים אמינים של בעלי חיים כדי לטפל במורכבות של ריפוי פצעים ולזהות את הגורמים התאיים והמולקולריים האחראים לסגירת פצעים ולהתחדשות רקמות.
עד כה, רוב המחקרים שבחנו ריפוי פצעי קרנית השתמשו במודלים של בעלי חיים לאחר הלידה4 או בוגרים 1,2,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה הובילו להתקדמות משמעותית בהבנת תגובת ריפוי פצעי הקרנית והמנגנונים העומדים בבסיס היווצרות צלקות, רקמות הקרנית הפגועות במודלי ריפוי אלה אינן מצליחות להתחדש באופן מלא, ובכך מגבילות את התועלת שלהן לזיהוי הגורמים המולקולריים והמנגנונים התאיים האחראים לשיקום מלא של המורפולוגיה והמבנה הקרנית לאחר הפציעה. לעומת זאת, פצעים עובריים הנוצרים באמצעות סכין בקרנית האפרוח העוברי הם בעלי יכולת פנימית להחלים באופן מלא בצורה נטולת צלקות8. באופן ספציפי, קרנית האפרוח העוברית מציגה התחדשות לא-פיברוטית עם שחזור מלא של מבנה המטריצה החוץ-תאית ודפוסי העצבנות 8,9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר רצף של שלבים המעורבים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים עובריים מוקדמים כדי להקל על הגישה לעובר. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-ממבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, המתאימים לזמן שבו נוצרות שלוש השכבות התאיות של הקרנית ורצוי פצע. שלישית, חתכי קרנית מרכזיים ליניאריים החודרים דרך אפיתל הקרנית ולתוך הסטרומה הקדמית נעשים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

<table><tbody><tr><td>18 G מחט היפודרמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>סכין מיקרו-חיתוך בזווית 30 מעלות</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor תווית נוגדנים</td> <td>משנייםבדיקות מולקולריות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2-H20)</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>מגשי ביצי עוף</td><td>GQF</td><td>O246</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח, קצה עדין, משוננים</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח, קצה חד</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>איריס 1 x 2 רקמת שיניים מלקחיים, VWR מעוקל מלא</td><td>VWR</td><td>100494-908</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-ניתוחים</td><td>VWR</td><td>470315-228</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי פיברונקטין (IgG1)</td> <td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>B3 / D6</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי למינין (IgG1)</td> <td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-נוירונים ספציפי &beta;-טובולין (Tuj1, IgG2a)</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-טנאסצין (IgG1)</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>M1-B4</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Sportsman 1502 חממת ביצים</td><td>GQF</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>קרע באריזה ידנית (רוחב 1.88 אינץ')</td><td>סקוטש</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

פצעי הקרנית העובריים של אפרוחים מציגים יכולת יוצאת דופן להתחדש באופן מלא ומהיר, בעוד שקרניות פצועות בוגרות חוות אובדן שקיפות עקב הצטלקות פיברוטית. שלמות הרקמה של הקרנית העוברית הפצועה משוחזרת באופן מהותי ללא היווצרות צלקת הניתנת לזיהוי. בהתחשב בנגישותו ובקלות המניפולציה שלו, עובר האפרוח הוא מודל אידיאלי לחקר תיקון פצעי הקרנית ללא צלקות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים העובריים המוקדמים כדי לגשת לעין. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-אמבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, המתאימים למועד שבו נוצרות שלוש השכבות התאית של הקרנית. שלישית, פצעי קרנית ליניאריים החודרים לשכבת האפיתל החיצונית ולסטרומה הקדמית מיוצרים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה. מחקרים שנערכו עד כה באמצעות מודל זה גילו כי קרניות עובריות פצועות מציגות הפעלה של התמיינות קרטוציטים, עוברות שיפוץ מתואם של חלבוני ECM למבנה המאקרו התלת-ממדי הטבעי שלהן, והופכות להיות מופנמות מחדש כראוי על ידי עצבים חושיים של הקרנית. בעתיד, ניתן יהיה לנתח את ההשפעה הפוטנציאלית של גורמים אנדוגניים או אקסוגניים על תהליך ההתחדשות בריפוי קרניות באמצעות טכניקות ביולוגיות התפתחותיות, כגון השתלת רקמות, אלקטרופורציה, זיהום רטרו-ויראלי או השתלת חרוזים. האסטרטגיה הנוכחית מזהה את הגוזל העוברי כפרדיגמה ניסיונית מכרעת להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.

בעקבות הניתוח המוקדם יותר של ACM ו-CAM ב-E5.5 כדי לחשוף את אזור הגולגולת של העובר המתפתח, נוצרה באובו סדרה של חתכים שהשתרעו על פני הקרנית המרכזית E7 (איור 1). פצע אידיאלי לחקר התחדשות הקרנית מתרחש בעקבות שלושה חתכים, שכל אחד מהם מיוצר באותו מיקום של הקרנית. החתך הראשון חוצה את אפיתל הקרנית, ואילו החתכים השני והשלישי חודרים לקרום המרתף שמתחתיו ולסטרומה הקדמית, בהתאמה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו-דיסקציה חדה (ראו טבלת חומרים) ולהפעיל את כמות הלחץ הנ...

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

פגיעה בסטרומה הקרנית הבוגרת מובילה לתגובה מהירה לריפוי פצעים הפוגעת בראייה של האדם עקב היווצרות רקמת צלקת אטומה. פרוטוקול זה יוצר פצעים בקרניות אפרוח עובריות שבניגוד למבוגרים, יכולות להחלים ללא צלקת. בהתחשב ביכולת הפנימית של הקרנית העוברית הפגועה לעבור שחזור מלא של מבנה הקרנית המקומי ללא הצטלקות הניתנת לזיהוי, הגוזל העוברי משמש מודל חייתי חשוב להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים לריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.ההיבט המאתגר ביותר של טכניקה זו הוא יצירת פצע עקבי החודר הן לאפיתל החיצוני ביותר והן לסטרומה הקרנית העמוקה יותר. כפי שלומדים, ייתכן שיהיה מועיל לראות את הקרניות הפצועות בחתך רוחב, כך שניתן יהיה להעריך את עומק חדירת הפצע לסטרומה הקרנית. כדי להתחיל, לסדר את הביצים אופקית על מגש ולסמן אותם בחלק העליון של הביצית כדי לציין את המיקום הצפוי של העובר.דגירה של ביצים אלה באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס עם פונקציית הנדנדה מופעלת. מוציאים את הביצית מהחממה ביום השלישי להתפתחות העוברית וממקמים אותה אופקית במחזיק ביצית מאובטחת. צור חור קטן בחלק העליון של קליפת הביצה ליד הקצה המחודד של הביצה באמצעות הקצה החד של ניתוח מספריים.הכנס מחט היפודרמית משופעת של 18 מדים דרך החור. כאשר המחט נדחפת לתחתית המשטח הפנימי של הביצה והצד המשופע של המחט פונה לקצה המחודד של הביצה, מוציאים שניים עד שלושה מיליליטרים של האלבומין מביצת התרנגולת ומשליכים. נקו את משטח קליפת הביצה המקיף את החור במגבונים נטולי מוך, לחים קלות עם 70% אתנול ונגבו יבשים.אוטמים את החור שנועד להסרת אלבומין עם קלטת שקופה. עם הקצה החד של ניתוח מספריים, לעשות חור חלון שני בחלק העליון של קליפת הביצה. יש לוודא שהמספריים אינם מתרחבים רחוק מדי לתוך קליפת הביצית כדי להימנע ממגע ופגיעה בעובר או בכלי הדם העובריים הממוקמים ישירות מתחת לצד החור השני.באמצעות מלקחיים מעוקלים, הרחיבו את חור החלון כך שיתפרש על פני קוטר של כשני עד שלושה סנטימטרים כדי לחשוף ולקבל גישה לעובר המתפתח שמתחת לקליפה. כעת, הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה.ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של שניים עד שלושה סנטימטרים שמכסה ישירות את העובר. כדי להגביל את הזיהום החיידקי, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של תמיסת צלצול המכילה 50 יחידות למיליליטר של פניצילין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין דרך חור החלון. אטמו את חור החלון באמצעות סרט דבק שקוף.בצע את איטום הביצה על ידי יישור פינה של הסרט על הציר הארוך של החור ולחיצה על הקלטת לקליפה במרחק של סנטימטר עד שני סנטימטרים מקצה החור. ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הקלטת זו לזו, ויצרו צורה כיפה מעל החור ולחצו על דש הסרט התלוי אל הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.מחזירים את הביצים החלונות לאינקובטור להמשך פיתוח. הקפידו לשמור על ביצים אלה אופקיות ולכבות את תפקוד הנדנדה של האינקובטורים. השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהעובר נמצא בשלב ההתפתחותי הנכון ולאתר את מיקומם של הממברנה השפירית והממברנה הכוריואלנטואית.לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור בקרום השפיר ישירות מעל הפורלימב המשתרע מהממברנה, ומעל הממברנה אל הממברנה שמעל הראש. השתמשו בשני זוגות של מלקחיים סטריליים עדינים ותפסו בעדינות את השמניון בשתי תנוחות סמוכות בין קרום השפיר ACM לבין הממברנה הכוריו-אלנטואית. הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה כאשר זוג אחד נע באופן דורסני אל העובר והשני אל הגחון.השתמש במלקחיים עדינים מעוקרים כדי לנתח ולהסיר את כל קרום השן שנותר המכסה את העובר. באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את האניון ליד אזור הגולגולת האמצעי של העובר ומשכו בזהירות את השן בכיוון בקלה ביחס לעובר לכיוון הקרום הכוריואלנטואי שנעקר מוקדם יותר. אטמו מחדש את חור החלון באמצעות סרט שקוף כמתואר בכתב היד והחזירו את הביצה לחממה להמשך פיתוח.ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הקרומים העובריים הנוספים כדי להבטיח שהעין הימנית נגישה. אם העין הימנית אינה נגישה לפציעה בשל מיקום העובר בביצה, היא יכולה לשמש כבקרה שאינה פצועה. השתמשו בסכין מיקרו-ניתוח כדי ליצור חתך המשתרע על פני היקף הקרנית של עין ימין אשר מקבילה לרקמת הכורואידים ובשורה אחת איתה.השתמש בסכין ניתוח המיקרו כדי לשוב, לחתוך את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון, פי שניים יותר באופן כזה שחתך שניים וחתך שלוש מתרחש יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו לחתוך אחד. כדי לסייע בכדאיות, השתמש במלקחי הקשתית המעוקלים כדי לתחוב את העובר בחזרה מתחת לממברנה הכוריואלנטואית לאחר הניתוח כדי לקדם צמיחה נכונה של הממברנה הכוריואלנטואית. לאחר מכן, מוסיפים שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת צלצול המכילה אנטיביוטיקה כדי לייבש את העובר ולעקר את הביצית.אטום מחדש את חור החלון בנייר דבק שקוף וחזור לחממה, תוך השארת הביצה אופקית. תנו לעובר להתפתח ולפצע הקרנית להחלים לתקופה הרצויה. לאחר הדגירה, המתים את העובר ומשתמשים במלקחיים מעוקלים של הקשתית כדי לקצור את העין בצלחת פטרי של תמיסת המלח של רינגר על ידי אחיזה עדינה של העין בצד האחורי שלה שבו העין ורקמת הפנים נפגשות ומרימים בזהירות את כל העין הרחק וללא רקמת הפנים.השתמשו במלקחיים עדינים כדי לתקוע חור קטן של שלושה עד חמישה סנטימטרים בחלק האחורי של העין כולה ולתקן את כל העין ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס בלילה עם תסיסה קלה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו דיסקציה חדה ולהפעיל את כמות הלחץ הנכונה במהלך החתך. הפעלת לחץ נמוך מדי תגרום לפצע רדוד שקורע את אפיתל הקרנית מבלי לחדור מספיק לסטרומה הקדמית.הפעלת לחץ רב מדי גורמת לפצע בהיקף מלא החודר לכל הסטרומה וחושף את ההומור המיימי לסביבה החיצונית. ביצוע החתכים המתאימים מייצר פצע אידיאלי שבתחילה מגדיל אפס לשלושה ימים לאחר הפציעה. לאחר מכן, אפיתליזציה מחדש ויצירת רקמות חדשות מתרחשת כדי בסופו של דבר לסגור את הפצע בצורה ללא צלקת על ידי 11 ימים, לאחר הפציעה.לוקליזציה מרחבית-טמפורלית של חלבוני המטריצה החוץ-תאית, הפיברונקטין והטנאסין בתוך הפצע המרפא נמצאה כמוגבהה בנקודות זמן המתאימות לאפיתליזציה מחדש של הקרנית, מה שמרמז על מעורבותם בסגירת פצע, נדידת תאי אפיתל והישרדות. אימונוהיסטוכימיה של הר שלם גילתה כי העצבים שהצמידו ישירות את הקרנית המרכזית הפצועה מעוכבים באופן זמני מרקמת הקרנית המרפאת. למרות עיכוב מוקדם יותר, עצבי הקרנית בסופו של דבר מעצבנים את רקמת הקרנית שנרפאה לחלוטין 11 יום לאחר הפציעה לרמות צפיפות דומות ובדפוסים דומים לשלבים תואמים שאינם פצועים שולטים ביום העוברי 18.כפי שמעידה הדמיה הרמונית מהדור השני, צרורות של סיבי קולגן בעומקים משתנים של פצע הקרנית המרכזית נראים מסודרים בצורה אורתוגונלית, התואמת את מבנה המאקרו הטבעי של רקמת הקרנית המרכזית שאינה פצועה. בשילוב עם גישות ביולוגיות התפתחותיות קלאסיות, כגון השתלת רקמות והשתלת חרוזים, כמו גם גישות מודרניות למניפולציה של גנים כגון זיהום רטרו-ויראלי ואלקטרופורציה של DNA, מודל חייתי זה מבטיח לחשוף גורמים מולקולריים ומנגנונים תאיים הדרושים לקידום ריפוי פצעי קרנית ללא צלקות. קביעת גורמים מולקולריים מרכזיים בחלבוני מטריצה המווסתים ריפוי פצעים ללא צלקות עובריות תסלול את הדרך לטיפולים המטפחים תהליך ריפוי משקם יותר עם פחות הצטלקות וסיכום טוב יותר של ארכיטקטורת הרקמה הנורמלית.

investigating-scarless-tissue-regeneration-embryonic-wounded-chick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

מאמר זה מתאר מודל חדש של בעלי חיים שפותח כדי לחקור את האנטומיה וההיסטולוגיה של הקרנית ותהליכי הריפוי שלה. מודל חדש זה של בעלי חיים משתמש בגרביל מונגולי, שיש לו קרנית עם קווי דמיון רבים לקרנית האדם.

גרבילים מונגולים כמודל חייתי לריפוי פצעים

Stripping Only של Descemet הוא הליך ניסיוני שבו מטופלים עם גוטה מרכזית של הקרנית כתוצאה מדיסטרופיה של האנדותל של פוקס פשטו את הממברנה של Descemet עבור תאים היקפיים כדי לחדש את שכבת האנדותל. אנו מציגים מתודולוגיה חדשנית המדמה DSO בקרניות אנושיות דיסטרופיות ex vivo עם ריפוי מואץ המעורר על ידי eFGF1 (NM141).

מודל תרבית איברי הקרנית האנושית של הפשטת Descemet רק עם ריפוי מואץ מגורה על ידי גורם גדילה פיברובלסט מהונדס 1

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

הערכת רעילות טיפולית וכימית באמצעות קרניות חזיר בתרבית איברים וריפוי פצעי אפיתל

מוצג פרוטוקול שניתן לשחזור להכנה, העשרה ויישום של הידרוג'ל במיקום באור כחול– קישור צולב של ג'לטין–ריבופלבין לתיקון פצעי סטרומל בקרנית בארנבים, כולל שלבים פרוצדורליים לטיפול כירורגי, טרסורפאה חלקית וטיפול לאחר הניתוח.

ייצור ויישום כירורגי של הידרוג'לים ג'לטין–ריבופלבין מועשרים עם קישור פוטופולינקרי לתיקון פצעי קרנית בארנבים

למדו שיטה ליצירת פציעות בקרנית אפרוח עוברי ללא צלקות. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מנגנוני הריפוי התאיים והמולקולריים בדגם בעלי חיים חשוב לרפואת עיניים ולחקר ביולוגיה התחדשותית.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

גלה סרטונים נוספים