Name: הערכה של סמן ביולוגי אמין במודל של אלח דם של אלח דם של אלח דם הנגרם על-ידי נקב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: חקור הערכת סמן ביולוגי אמין לזיהום דם באמצעות מודל CLP בעכברים. פרוטוקול סטנדרטי זה מאפשר מחקר מהימן של CitH3 ככלי אבחון לזיהום דם ולניתוח מנגנוני NETosis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופסור וונג וואי ולדוקטור ליו שואי על עזרתם בניסויים. עבודה זו מומנה על ידי מענקים ממימון המחקר הצעיר של בית החולים שיאנגיה, אוניברסיטת סנטרל דרום (מס '2019Q10), מהקרן הלאומית והמדעית של מחוז הונאן (מס '2020JJ4902), ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82202394).

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה לבדיקת חיות בבית החולים שיאנגיה ובאוניברסיטת סנטרל דרום (מס '202103149).
1. הכנה
<ol><li>עכברי C57BL/6J זכרים נבחרים (משקל: 20-25 גרם; גיל: 8-12 שבועות) ובבית למשך 3 ימים לפני ביצוע הליכים כלשהם.</li>
	<li>שקלו את העכבר.</li>
	<li>מרדים את העכבר עם 1.5% איזופלורן על ידי שאיפה וצובט את הבהונות כדי לבדוק את עומק ההרדמה.</li>
	<li>הנח את העכבר על כרית החימום. החל קרם דפילציה על הבטן ולהשאיר לא יותר מ 1 דקה לפני הסרת הקרם והשיער. הערה: יש לשמור על טמפרטורת גוף תקינה על ידי הנחת כרית חמה מתחת לעכבר המרדים במהלך הניתוח.</li>
</ol>2. מבצע
<ol><li>הכינו כלי ניתוח סטריליים המתאימים לניתוח בעלי חיים מכרסמים. יש ללבוש כפפות סטריליות, מסכת פנים וחלוק כירורגי כדי להבטיח תנאים אספטיים.</li>
	<li>לחטא את עור הבטן עם מגבונים יוד לפחות שלוש פעמים. יש לכסות את אזור הניתוח הניתוחי בווילונות כירורגיים סטריליים.</li>
	<li>השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לבצע חתך של כ -2 ס"מ בדופן הבטן לאורך הלינאה אלבה. הערה: אין לפגוע באיברים.</li>
	<li>לזהות ולבודד את cecum מתוך חלל הצפק עם פינצטה סטרילית.</li>
	<li>ליגייט 75% מנפח הצקום עם 4-0 תפרי משי. אין לנעוץ את כלי הדם המזנטריים. הערה: אחוז הצקום המחויב קובע את חומרת אלח הדם.</li>
	<li>נקבו את הצקום על ידי יצירת ניקוב אחד דרך ודרך (שני חורים) עם מחט של 21 G (מצד אחד דרך דופן הסקל לצד הנגדי) בנקודת האמצע שבין קצה הזנב לסט הקשירה.</li>
	<li>השליכו את המחט. סוחטים בעדינות טיפה קטנה של צואה מתוך הצואה דרך חורי החדירה. הערה: כמות הצואה שנדחקה לתוך חלל הצפק צריכה להיות עקבית, שכן זה גם קובע את חומרת אלח דם. יש לדלג על שלבים 2.5-2.7 עבור עכברי בושה.</li>
	<li>החלף בעדינות את הצקום לתוך חלל הבטן.</li>
	<li>סגרו את שרירי הבטן והעור בנפרד עם 6-0 תפרי משי.</li>
	<li>יש לחטא את החתך ביוד.</li>
	<li>הזריקו קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) ברביע השמאלי התחתון של הבטן כדי למנוע את הצקום. הניחו את העכבר על כרית חמה עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה.</li>
	<li>הניחו את העכבר בכלוב בחדר עם בקרת טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס) ותנו גישה חופשית למזון ולמים. בדוק את העכבר כל 6 שעות בשבוע הראשון שלאחר הניתוח.<ol><li>הרדמת העכבר על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני כאשר הסימפטומים של אלח דם פוגשים את נקודות הקצה שהוגדרו מראש.</li>
	</ol></li>
</ol>3. טיפול
<ol><li>חלקו באופן אקראי עכברים לקבוצת הבושה, קבוצת CLP, קבוצת CLP + YW3-56 (איור 2a) וקבוצת CLP + Cl-amidine (איור 1). הערה: קבוצת הבושה עברה את אותם הליכים כמו קבוצות CLP למעט CLP. YW3-56 (5 מ"ג/ק"ג) או Cl-amidine (40 מ"ג/ק"ג) ניתנו בהזרקת פריטונל שעה לאחר שלב 2.9 בעת תפירת שכבת השריר והעור.</li>
	<li>קציר לדוגמה<ol><li>קצירת דם היקפי ממקלעת רטרובולבר15 24 שעות לאחר הניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>מכינים את הסרום על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם, 5 דקות) ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.</li>
	<li>מדוד את ריכוז CitH3 באמצעות ערכת ELISA של סנדוויץ' עקיף כפי שתואר קודםלכן 13.<ol><li>מצפים את הנוגדן החד-שבטי נגד CitH3 על צלחת בעלת 96 בארות כדי ללכוד את חלבון CitH3.</li>
		<li>יש לטפל בסרום עם DNase I (150 יחידה/מ"ל, 37° למשך שעה) ולדגירה בבארות (20 μL, טמפרטורת החדר).</li>
		<li>הוסיפו נוגדן פוליקלונלי נגד CitH3 (0.33 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרול, 2 שעות) כדי לזהות את חלבון CitH3 שנתפס.</li>
		<li>לדגום את הנוגדן המשני המסומן נגד פרוקסידאז (0.02 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם, שעה אחת) בבארות.</li>
		<li>לאחר שטיפה יסודית, לפתח את הבארות עם 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (100 μL, 20 דקות). הערה: פרטי פרוטוקול נוספים של ערכת ELISA מסופקים בפרסום הקודם13.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח סטטיסטי<ol><li>בצע בדרך אחת ANOVA כדי לנתח את ההבדלים בין שלוש הקבוצות, ולאחר מכן Bonferroni לאחר בדיקת הוק להשוואות מרובות. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע את הניתוח. ערכי p של 0.05 או פחות נחשבו משמעותיים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Shankar-Hari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+new+definition+and+assessing+new+clinical+criteria+for+septic+shock%3A+For+the+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).</li>
<li>Fleischmann-Struzek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+mortality+of+hospital-+and+ICU-treated+sepsis%3A+results+from+an+updated+and+expanded+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).</li>
<li>Evans, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+sepsis+campaign%3A+international+guidelines+for+management+of+sepsis+and+septic+shock+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021.</a> Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).</li>
<li>Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effectiveness+of+interventions+to+reduce+peripheral+blood+culture+contamination+in+acute+care%3A+a+systematic+review+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol.</a> Systematic Reviews. 7 (1), 216(2018).</li>
<li>Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+sepsis+in+critical+care%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li>
<li>Hotchkiss, R., Karl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li>
<li>Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+peptidylarginine+deiminase+reduces+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+tissue+injury+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+peptidylarginine+deiminase+alleviates+LPS-induced+pulmonary+dysfunction+and+improves+survival+in+a+mouse+model+of+lethal+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia.</a> European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullinated+histone+H3+as+a+therapeutic+target+for+endotoxic+shock+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2957(2019).</li>
<li>Li, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+citrullinated+histone+H3+as+a+potential+serum+protein+biomarker+in+a+lethal+model+of+lipopolysaccharide-induced+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock.</a> Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CitH3%3A+a+reliable+blood+biomarker+for+diagnosis+and+treatment+of+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8972(2017).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+plasmo-photoelectronic+nanostructure+biosensor+detects+an+infection+biomarker+accompanying+cell+death+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils.</a> Small. 16 (1), 1905611(2020).</li>
<li>Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+various+methods+of+blood+sampling+in+mice+and+rats%3A+Effects+on+animal+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare.</a> Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).</li>
<li>Brook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+mouse+model+for+neonatal+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58574(2019).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

CLP מכניס פתוגנים לתוך הבטן כדי ליצור מודל פרה-קליני של אלח דם. בעת ביצוע CLP, חשוב להשתמש בתנאים סטריליים כדי למנוע את ההפרעה של חיידקים אקסוגניים ולהשתמש במינונים מדויקים של חומרי הרדמה16. שלושת ההיבטים הטכניים של CLP המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל אלח הדם הם אחוז הצקום הקשור, גודל המחט המשמשת לניקוב cecal, ונפח הצואה הנדחקת לחלל הבטן. קשירת כ-75% מהצקום גורמת לאלח דם חמור, קשירת 50% גורמת לאלח דם בינוני, ו-25% קשירה או פחות גורמת לאלח דם קל17. מספר הנקבים וגודל המחט ...

אלח דם מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכני חיים הנגרם על ידי תגובת מארח לא מווסתת לזיהום1, והלם ספטי הוא סיבת המוות המובילה במקרים חמורים של אלח דם2. אלח דם והלם ספטי גורמים למיליוני מקרי מוות ברחבי העולם מדי שנה3. המפתח לשיפור התוצאה של חולים עם אלח דם הוא ייזום מהיר של טיפולים כגון אנטיביוטיקה4. שיטת תקן הזהב לאבחון אלח דם היא תרבות מיקרוביאלית; עם זאת, תרבית מיקרוביאלית גוזלת זמן רב ויכולה להוביל לתוצאות חיוביות שגויות ושליליות שגויות, המגבילות מאוד את המשמעות הקלינית5. לכן, רצוי מאוד לזהות סמן ביולוגי בדם של אלח דם. פרוקלציטונין מוכר כסמן ביולוגי אידיאלי לאלח דם, אך יש לו יעילות אבחנתית מוגבלת מכיוון שהוא אינו מסוגל להבחין בין אלח דם למחלות סטריליות6. 
קשירת צקאל עכבר ודיקור (CLP) משמשת בדרך כלל ליצירת מודל של אלח דם במחקר מדעי. CLP הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של אלח דם מכיוון שהוא מחקה דלקת צפק פולימיקרוביאלית, ומפעיל תגובות חיסוניות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות7. מקובל כי CLP יוצר מודל אלח דם רלוונטי יותר מבחינה קלינית מאשר טכניקות חלופיות, כגון הזרקת אנדוטוקסין חיידקי. לכן, CLP נחשב למודל אלח הדם הקלאסי לשימוש במחקר8. עם זאת, חסרון מרכזי של CLP הוא יכולת השכפול שלו, שכן חומרת המודל מושפעת ממספר גורמים כגון אחוז הצקום קשירה, גודל המחט, מספר הנקבים וטכניקת הלפרוטומיה. לכן, יש צורך לתקנן את מודל אלח דם המושרה על ידי CLP. המחקר הנוכחי מתאר את פרטי הפרוטוקול של מודל אלח הדם המושרה על ידי CLP כדי להראות את ההליך הסטנדרטי ולהגדיל את יכולת השכפול שלו.
התגובה הדלקתית מתרחשת בשלב מוקדם של אלח דם, כאשר נויטרופילים משחררים כמויות מופרזות של מחמצנים ופרוטאזות הגורמים נזק לאיברים8. גורם מפתח בפתופיזיולוגיה של אלח דם הוא היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs), המשחררות רכיבים גרעיניים וציטוזוליים כגון דנ"א, היסטונים ציטרולין וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים9. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שדור מופרז של NETs מתווך את הפתולוגיה של אלח דם; בינתיים, ירידה של NETs, באמצעות עיכוב אנזימטי של פפטידיל ארגינין deiminase (PAD) על ידי כימיקלים כמו YW3-56 או Cl-amidine, מפעילה אפקט פרו-הישרדותי במודלים עכברים של אלח דם10,11. היסטון H3 (CitH3) זוהה כחלבון ספציפי לאלח דם בשנת 201112, ופרסומים מאוחרים יותר הראו כי ריכוז CitH3 במחזור הוא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם13,14. CitH3 נחשב לסמן ביולוגי רגיש יותר וארוך טווח יותר מאשר פרוקלציטונין, והוא ספציפי יותר בהבחנה בין אלח דם מאשר ציטוקינים דלקתיים13.
במחקר זה, הערכנו סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם במודל עכבר המושרה על ידי CLP של אלח דם.

<table><tbody><tr><td>מחט</td><td></td><td></td><td></td>21 גרם</tr><tr><td>3,3',5,5'-טטרמתילבנזידין&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems Inc</td><td>DY999</td><td></td></tr><tr>מעבדת<td>נוגדנים חד שבטיים נגד CitH3</td><td>פיתחה</td><td></td><td></td>בעצמה</tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי אנטי-CitH3</td><td>Abcam</td><td>ab5103</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים</td><td>בית הספר לרפואה של שיאנגיה, אוניברסיטת</td><td></td><td></td>מרכז דרום</tr><tr><td>Cl-amidine</td><td>קרם</td><td></td> אפילציה SML2250 <td></td>סיגמא אולדריץ</tr>' <tr><td>Dnase I</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>קטופרופן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>PHR1375</td><td></td></tr><tr><td>תפרי משי (4-0 ו-6-0)</td><td></td><td></td><td></td></tr>מכשירים <tr><td></td> כירורגיים&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> נ.ב.פ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>YW3-56</td><td>GLPBIO</td><td>GC48263</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של סמן ביולוגי אמין במודל של אלח דם של אלח דם של אלח דם הנגרם על-ידי נקב

Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

אלח דם היא מחלה מסכנת חיים ומתפתחת במהירות הגורמת למיליוני מקרי מוות מדי שנה ברחבי העולם. חוקרים עשו מאמצים אדירים להבהיר את הפתופיזיולוגיה של אלח דם באמצעות מודלים שונים של בעלי חיים; מודל העכבר של אלח דם המושרה על ידי קשירת cecal ונקב (CLP) נמצא בשימוש נרחב במעבדות. שלושת ההיבטים הטכניים המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל CLP הם אחוז הצקום הקשור, גודל המחט המשמשת לניקוב cecal, ונפח הצואה הנדחקת לחלל הבטן. האבחנה המהירה והספציפית של אלח דם היא גורם מכריע המשפיע על התוצאה. תקן הזהב לאבחון אלח דם הוא תרבית מיקרוביאלית; עם זאת, תהליך זה גוזל זמן ולעיתים אינו מדויק. הזיהוי של סמנים ביולוגיים ספציפיים לאלח דם הוא מהיר, אך הסמנים הביולוגיים הקיימים אינם מספקים בשל זמן מחצית חיים קצר, חוסר ספציפיות ורגישות לא מספקת. לכן, יש צורך דחוף סמן ביולוגי אמין של אלח דם בשלבים המוקדמים. פרסומים קודמים מצביעים על כך שמלכודות חוץ-תאיות מוגזמות של נויטרופילים (NETs) מתרחשות באלח דם. היסטון H3 (CitH3), כמרכיב NET, מוגבה הן בבעלי חיים סופגים והן בחולים, ונוכחותו של CitH3 היא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם. המחקר הנוכחי נועד לתאר מודל עכברי סטנדרטי של אלח דם המושרה על ידי CLP ולבסס סמן ביולוגי אמין בדם של אלח דם. עבודתנו עשויה לתרום לאבחון מוקדם ומדויק של אלח דם בעתיד.

כפי שניתן לראות באיור 2A, לא זוהה CitH3 בקבוצת הבושה על ידי כתם מערבי. ריכוז CitH3 בסרום עלה באופן משמעותי לאחר CLP, ועלייה זו נחסמה על ידי עיכוב היווצרות NET באמצעות מתן YW3-56, מעכב PAD10. איור 2B מראה את ריכוזי הסרוםCitH3 שנקבעו על-ידי ELISA. ב-24 שעות לאחר CLP, ריכוז ה-CitH3 בסרום עלה בקבוצות ה-CLP בהשוואה לקבוצת ה-sham (p = 0.0008), ועלייה זו של CitH3 הוחלשה באופן משמעותי על-ידי Cl-amidine, מעכב PAD המגביל את היווצר...

פרוטוקול זה מציג את הפרטים האופרטיביים של קשירת cecal ונקב (CLP) במודל עכבר של אלח דם. CLP היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר ליצירת מודל חייתי של אלח דם. לכן, נדרש פרוטוקול CLP סטנדרטי להשגת תוצאות מחקר אמינות.

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

המטרה העיקרית של מחקר זה היא להשתמש במודל עכבר של קשירת cecal ואלח דם המושרה לנקב כדי להעריך סמן ביולוגי אמין בדם של אלח דם. קשירת Cecal ונקב, או CLP בקיצור, הוא מודל רלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם. CLP הוא מודל נפוץ במחקר אלח דם.היסטון H3, או CitH3, מקורו ב- NETosis המושרה על ידי אלח דם. המחקר הקודם שלנו מדגים כי CitH3 הוא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם. בחר עכברי C57BL/6 זכרים.לשקול את העכבר, ולהרדים את העכבר על ידי שאיפה של 1.5% isoflurane. הנח את העכבר על כרית חימום. יש למרוח קרם דפילציה על הבטן ולהשאיר לא יותר מדקה אחת לפני הסרת הקרם והשיער.הכינו כלי ניתוח סטריליים המתאימים לניתוח בעלי חיים מכרסמים. לחטא את עור הבטן עם יוד לפחות שלוש פעמים. יש לכסות את אזור הניתוח הניתוחי בעזרת וילונות כירורגיים סטריליים מתאימים.השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לבצע חתך של כשני סנטימטרים בדופן הבטן, לאורך הלינאה אלבה. לזהות ולבודד את cecum מתוך חלל הצפק עם פינצטה סטרילית. ליגייט 75 נפח של cecum עם 4-0 תפר משי.אין לנעוץ את כלי הדם המזנטריים. יש לציין, אחוז שונה של cecum ligated קובע את חומרת אלח דם. 25% מוביל לאלח דם בדרגה נמוכה, 50% מוביל לאלח דם בדרגה בינונית, ו-75% מוביל לאלח דם בדרגה גבוהה.נקבו את הצקום על ידי ניקוב אחד דרך ודרך עם מחט 21 מד בנקודת האמצע שבין קצה הזנב לקשירה. סוחטים בעדינות את הצואה מתוך הצואה דרך חורי חדירה. יש לציין, כמות הצואה שנדחקה לתוך חלל הצפק צריכה להיות עקבית, שכן צואה קובעת גם את חומרת אלח דם.החלף את הצקום כמו גם צואה לתוך חלל הבטן בעדינות. סגור את שכבת שרירי הבטן ואת שכבת העור עם 6-0 תפר משי. יש לחטא את החתך ביוד.הזרקה של ketoprofen, חמישה מיליגרם לקילוגרם, צריך להתבצע על הרביע השמאלי התחתון של הבטן, כדי למנוע את cecum. הניחו את העכבר על כרית חימום עד להתאוששות מלאה. העכבר שוכן בחדר עם בקרת טמפרטורה ומקבל גישה חופשית למזון ולמים.בעלי חיים יומתו על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני עם תסמינים של אלח דם, הרלוונטיים לנקודות הקצה המוגדרות מראש שלנו בהתבסס על המחקר שלנו שהוצג. עכברים מחולקים באופן אקראי לקבוצת ה-sham, לקבוצת CLP ולקבוצת הטיפול CLP בתוספת Cl-amidine או YW3-56. עכברים בקבוצת בושה מקבלים את כל הליכי CLP למעט קשירת cecum ונקב.קצירת דם היקפי 24 שעות לאחר הניתוח והכנת סרום באמצעות צנטריפוגה. ריכוז CitH3 נקבע על ידי כתם מערבי וערכת ELISA שפותחה בעצמה. כפי שניתן לראות באיור 2, לא זוהה CitH3 בקבוצת ה-sham.רמות CitH3 היו גבוהות לאחר החדרת CLP, אשר נחלש על ידי עיכוב PAD באופן משמעותי. בהתבסס על הנתונים שלנו, אנו מסיקים כי מחזור CitH3 הוא סמן ביולוגי אבחון אמין של אלח דם.

evaluation-reliable-biomarker-cecal-ligation-puncture-induced-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במודל עכבר של קשירת לנקב cecal ו ככלי רב ערך לחקר אלח דם האדם.

קשירת Cecal נקר נוהל

אלח דם מתייחס תסמונת תגובה דלקתית מערכתית עקב זיהום מיקרוביאלי, והוא יכול להיות מדומה על ידי טכניקה כירורגית כינה קשירת לנקב cecal ו (CLP). כאן אנו מתארים שיטה להשתמש CLP-Induced מודל החיה למסך צמחי מרפא עבור סוכני טיפולית.

שימוש במודל של בעלי חיים אלח דם להערכת טיפולים צמחים רומן

אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר מצונתר מרכזי של מחלה קריטית ממושכת. אנו משלבים את שיטת קשירת הציקל והניקוב כדי לגרום לאלח דם עם שימוש בקו ורידי מרכזי למתן נוזלים, תרופות וחומרים מזינים כדי לחקות את הסביבה הקלינית האנושית.

שימוש קו ורידים מרכזי עבור נוזלים, תרופות ומנהל מזין בתוך עכבר דגם של מחלות קשות

פרוטוקול זה מספק את הצעדים הדרושים כדי ליצור ולהעריך אלח דם neonatal בעכברים בן יום-7.

דגם עכבר מבוקר Neonatal אלח דם Polymicrobial

פרוטוקול זה מתאר טכניקות למדידת תוצאות זיהומיות בבסיס החולים שנרכשו משני זיהומים במצב המדכא, הראשון על ידי הקמת לאחר הקשר/עכברים לאחר מכן מאתגרת אותם עם זיהום intranasal כדי ל ליצור מודל רלוונטי קלינית של אלח דם חיסוני.

עיצוב של הIntranasal וניקוב, מודל כפול של דיכוי חיסוני מושרה באלח דם

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה ויעילה להזרקות ורידים בזנב מכרסם באמצעות מכשיר התחממות /הרחקה שתוכנן באופן ייחודי. על ידי ייעול ייזום תהליכי ויתור וריסון, פרוטוקול זה מאפשר זריקות מדויקות ותוך ורידי בזמן של קבוצות גדולות של בעלי חיים עם מצוקה מינימלית.

מכשיר התחממות/ריסון עכשווי להזרקות יעילות של וריד זנב במודל אלח דם פטרייתי מורין

כאן אנו מציגים מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ בחולדות.

מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ הניתנת לשחזור בחולדות

פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.

אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) הוא מודל סטנדרטי ביותר עבור אלח דם בטן polymicrobial במכרסמים. מאמר זה מתאר את הליך כירורגי של CASP. המודל CASP גירסאותיה, לאפשר חקירה שיטתית של בעיות שונות לגבי הנושא של אלח דם.

קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) - מודל סטנדרטי עבור אלח דם בטן Polymicrobial

חקור הערכת סמן ביולוגי אמין לזיהום דם באמצעות מודל CLP בעכברים. פרוטוקול סטנדרטי זה מאפשר מחקר מהימן של CitH3 ככלי אבחון לזיהום דם ולניתוח מנגנוני NETosis.

הערכה של סמן ביולוגי אמין במודל של אלח דם של אלח דם של אלח דם הנגרם על-ידי נקב

גלה סרטונים נוספים