ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

גישה מונחית שושלת זו מאפשרת ניתוח פרוטאומי של אירועים התפתחותיים חשובים ברזולוציה מרחבית וזמנית בתוך העובר בעל החוליות, ומקנה מידע שלא יהיה נגיש באמצעות מדידות עובר שלם. גישה זו יכולה להיות מורחבת בקלות כדי לחקור חלבונים, מטבוליטים ותעתיקים מתאים עובריים שונים כפי שהם מתמיינים במהלך ההתפתחות. שיטה זו יכולה לקדם את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים השולטים בהתפתחות תקינה ומחלות, כולל מנגנונים של השראת רקמות ומחויבות לגורל התא במהלך ההתפתחות המוקדמת.

השתמש בלולאת שיער כדי להנחות כל עובר לתוך באר ולמקם אותם בעדינות כך שתא היעד של העניין יהיה בזווית הנכונה למיקרו-מחט. עקוב אחר מפות גורל הרקמה של xenopus laevis כדי לזהות את התא המבשר של השושלת המעניינת. השתמש בשני מלקחיים מחדדים כדי להסיר בעדינות את קרום ויטלין המקיף את העובר.

בודדו את התאים הבודדים מהעובר על ידי דיסקציה ידנית באמצעות מלקחיים. התחל על ידי הגדרת מחט ההזרקה המכילה את תמיסת נותב השושלת. הרכיבו את מחט המיקרו-הזרקה לתוך מחזיק מיקרו פיפטה הנשלט על ידי מניפולטור מיקרו רב צירים.

חבר את מחזיק המיקרו פיפטה למזרק מיקרו ומלא את המחט בעוקב השושלת על ידי הפעלת לחץ שלילי. כייל את המחט והתאם את גודל קצה המחט ואת זמן ההזרקה כדי לספק כננוליטר אחד של תמיסת נותב השושלת הנמדדת בשמן מינרלי. ודא שגודל הטיפה המוזרק מדויק והתאם את הגדרות המזרק במידת הצורך.

הציפו את צלחת החימר במיקרו-הזרקה בתמיסת fCAL 3% והעבירו כ-10 עוברים לצלחת החימר באמצעות פיפטת העברה. הזריקו לתאים המעניינים כננוליטר אחד של דקסטרן פלואורסצנטי או 200 פיקוגרמות של GFP mRNA. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לאשר את ההצלחה של תיוג תאים.

ודא שרק התא המיועד מוזרק. יש להשליך עוברים המכילים תאים פגומים או מסומנים באופן שגוי בהתאם למדיניות מוסדית. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי המכילה תמיסת שטיינברג פי 0.5.

תרבית אותם בין 14 ל 25 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. מעבירים שלושה עד חמישה עוברים לצלחת אגר המכילה תמיסת שטיינברג 0.2x לדיסקציות מיקרו. השתמש במלקחיים כדי לנתח את השיבוט המסומן מהעובר.

לאסוף את הרקמה מנותחת עם פיפטה 0.5 עד 10 מיקרוליטר ולהפקיד אותם לתוך קובץ צנטריפוגה מיקרו. באמצעות פיפטה, שאפו את המדיה סביב הרקמה שנאספה להגביל מלחים בדגימה כדי למנוע הפרעה לניתוח HRMS. מיד להקפיא את התאים המבודדים על ידי הנחת בקבוקון הדגימה על קרח יבש או חנקן נוזלי.

אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ספקטרומטריית מסות. עבור עיבוד דגימה של תא בודד על ידי CE, denature החלבונים על ידי חימום הדגימה ל 60 מעלות צלזיוס במשך כ -15 דקות. לאחר מכן אזנו את הדגימה לטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והוסיפו טריפסין לדגימות לעיכול.

לניתוח על ידי NanoLC, ליז עד חמש רקמות מנותחות ב 50 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. להקל על התהליך על ידי pipeting את הדגימה למעלה ולמטה. כדי לעבד את הרקמות המנותחות, לדגור את הליזט בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

לאחר מכן מטילים את פסולת התא ואת טסיות החלמון בארבע מעלות צלזיוס על ידי צנטריפיקציה ב 4, 500 RCF. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון מיקרו-צנטריפוגה נקי ומוסיפים 10%SDS לקבלת ריכוז סופי של 1% SDS בליזט. עבור רקמות, להוסיף 0.5 dithiothreitol מולארי ליזט כדי לקבל ריכוז סופי של כ 25 מילימולר.

לאחר מכן לדגור על הליזט במשך 30 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי להפחית כימית את הקשרים הדיסולפידים בחלבונים. מוסיפים 0.5 יודואצטמיד מולארי כדי לקבל את הריכוז הסופי של כ 75 מילימולר בליזט ולדגור על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף 0.5 dithiothreitol מולארי זהה לנפח הראשוני כדי להרוות את המגיבים שנותרו מתגובת האלקילציה.

לזרז חלבונים באצטון בן לילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט וליצור מחדש ב 0.5 אמוניום ביקרבונט מולארי. מוסיפים טריפסין לעיכול הדגימה ודגרים על הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להפריד את הפפטידים באמצעות CE, לשחזר את החלבון מעוכל אחד עד שני מיקרוליטר של ממס הדגימה.

מערבול את הדגימה המעורבת ואת הצנטריפויה ב 10, 000 RCF במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי פסולת תא גלולה. אתחל את מכשיר CE-ESI על ידי שטיפת נימי CE עם BGE. הכניסו מיקרוליטר אחד של דגימה לבקבוקון הדגימה והזריקו אחד עד 10 ננוליטר מהדגימה לנימי הפרדת CE בהזרקה הידרודינמית.

מעבירים את קצה הכניסה של נימי ההפרדה CE לתוך BGE. התחל הפרדה אלקטרופורטית על ידי העלאה הדרגתית של מתח ההפרדה CE מאדמת כדור הארץ. פוטנציאלים של 20 עד 28 קילו-וולט עם זרם מתחת ל-10 מיקרו-אמפר מבטיחים ביצועים אינסטרומנטליים יציבים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח.

כדי להפריד באמצעות Nano LC, השהה מחדש את דגימת הפפטיד בשלב הנייד A.ריכוז הדגימה ונפח ההזרקה תלויים במערכת LC ובעמודה הזמינה. מעבירים את הדגימה לבקבוקון LC. לטעון כ-200 ננוגרם לשני מיקרוגרם של דגימת פפטיד לתוך העמודה האנליטית C18 ולהפריד את הפפטידים בקצב זרימה של 300 ננו-ליטר לדקה באמצעות אלוציה הדרגתית כמתואר בכתב היד של הטקסט.

באמצעות מצלמה, בדוק את זרימת הנוזל דרך פולט התרסיס האלקטרוני ובדוק חזותית את ההתקנה עבור דליפות אפשריות. לרכוש אירועי ספקטרומטריית מסות ולרצף את הפפטידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. הבדלים תרגומיים גנטיים התגלו בין תאי D11 שנותחו מעוברים שונים באמצעות CE-ESI-HRMS.

שיבוטים של תאים מנותחים עם תווית שושלת נותחו על ידי LC-HRMS. ניתוח מסלול של חלבונים הראה תרגום חלבונים מווסת ומטבוליזם אנרגיה במארגן של Spemann עם neuroectoderm. הנוירואקטודרם פרודאום הועשר בחלבונים הקשורים להובלה גרעינית של מטען חלבונים בתא, מה שככל הנראה מצביע על אירועים במורד הזרם בעקבות איתות.

ניתוח ההעשרה של פונקציות מולקולריות הצביע על upregulation בהתחלת תרגום, קשירת RNA וקשירה של קומפלקס פרוטאזום, מה שמרמז על תפקיד לתחלופת חלבונים דינמית בפיתוח המארגן של Spemann. בחר רק עוברים סטריאוטיפיים עבור פרוטוקול זה כדי לשפר את יכולת השחזור ואת פרשנות התוצאה. יש להעביר רקמה מנותחת לבקבוקון ולהקפיא מיד המכילה חיץ מדיה מינימלי ככל האפשר כדי למזער את הזיהום ממלחי חיץ.

גישה זו אפשרה לנו לחקור דינמיקה של חלבונים בתאים מזוהים ושושלות תאים בעוברים חיים. המידע החדש שהשגנו על הייצור הזמני המרחבי של חלבונים חשובים ברקמות מתפתחות אפשר לנו לתכנן ניסויים ממוקדים כדי להעריך את תפקודם הביולוגי.