קליטת מינון של חשיפת תרכובות מבוססות פלטינה ורותניום בדגי זברה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית עם יישומים רחבים יותר
21 באפריל 2022
הקצב המוגבר של ניתוחים פרמקו וטוקסיקוקינטיים של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת בדגי זברה יכול להוות יתרון למחקרי תרגום סביבתיים וקליניים. ההגבלה של ספיגת חשיפה לא ידועה הנישאת במים התגברה על ידי ביצוע ניתוח עקבות של מתכות על רקמת דגי זברה מעוכלים באמצעות ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.
דגי זברה הם מודל אטרקטיבי, אבל מדענים לא יודעים כמה האורגניזם לוקח עם מינון הנישא במים. פיתחנו טכניקה לעיכול רקמות לאחר חשיפה ולכימות מתכות באמצעות ICPMS. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת ולאמת במדויק את תגובת המינון באמצעות ICPMS.
לשיטה זו יש הרבה פוטנציאל. ניתן ליישם חשיפות פרמקולוגיות או סביבתיות למתכות מרמת התאים ועד למערכות איברים שלמות במודלים של בעלי חיים. הוסיפו כ-0.25 מיליליטרים של חומצה חנקתית בטוהר גבוה לצינורות הצנטריפוגה של פוליפרופילן 15 מיליליטר עבור עד 10 זחלים.
אולטראסונקט במשך שעה אחת כדי לבלוע מראש את הדגימות. עבור ultrasonication, לבצע מחזורים קצרים של עיכול רקמות עם מרווחים של חמש דקות במעכל מיקרוגל בטוח חומצה עד שכל הרקמה מחומצנת בעליל, מה שמייצר תמיסה צהובה אחידה וברורה. עקוב אחר שלמות הצינורות בזהירות כדי למנוע קרע ולבצע סיבובים קצרים בצנטריפוגה בין מחזורים.
לאחר שהרקמה מחומצנת בעליל, דיללו את הדגימות במכסה אדים ל-3.5% חומצה חנקתית באמצעות 6.75 מיליליטר של מים בעלי טוהר גבוה ומערבולת כדי לערבב היטב. לאחר מכן לבצע עקומת כיול תואמת מטריצה בת 7 נקודות כדי להסביר את כל ההפרעות האיזובריות הפוטנציאליות. באמצעות ריכוז מלאי של תקן היסודי המאושר מימי, קח אליקוט 0.1 מיליליטר, ועל ידי פיפט לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר חדש.
דיללו עם 3.5% חומצה חנקתית לנפח סופי של 10 מיליליטר כדי לייצר 10 חלקים למיליארד פתרונות סטנדרטיים. באמצעות מלאי של 10 חלקים למיליארד, הפוך את הדילולים הסדרתיים לתמיסות סטנדרטיות של 0.1, 1.0 ו-5.0 חלקים למיליארד ב-3.5% חומצה חנקתית. באמצעות מלאי 0.1, הפוך את הדילולים הסדרתיים לתמיסות סטנדרטיות 0.001, 0.005 ו- 0.01 חלקים למיליארד ב-3.5% חומצה חנקתית.
לאחר מכן, לפני הכנת מכשיר ה- ICPMS לניתוח דגימה, ודא כי שסתום גז הארגון פתוח, כל הצינורות מחוברים היטב ונקיים, 5% חומצה חנקתית פתוחה לשטיפת צינורות וכלי זכוכית בין ניתוחי דגימה. בדוק את מצב הלפיד והמדוכים וודא כי תיבת הלפיד נאחזת היטב. וצינור הניקוז של תא הריסוס מחובר כראוי לפריפומפ.
פתחו את התוכנה, בדקו את קריאות הוואקום וודאו שכל משאבות הטורבו פועלות ב-100% לחץ על START בחלון המצב של מערכת בקרת הפלזמה כדי להפעיל את רצף ההתחלה. הפעילו את משאבת הפלזמה ואת צ'ילר הפלזמה, הניחו את הנבולייזר והדליקו את הפלזמה. המתן עד שהפלזמה תהיה מוארת ויציבה כאשר חלון המצב מציין שרצף ההפעלה הושלם.
בשלב זה, שימו לב לנקודות הירוקות בחלון מצב המערכת המציינות שכל ספקי הכוח פועלים. בשורת התפריטים, לחץ על Control, Autosampler בתפריט הנפתח. הזן את מיקום המדף האוטומטי עבור הצינור המכיל 5% חומצה חנקתית, לאפשר לחומצה להיכנס לפלזמה.
בשורת התפריטים, לחץ על סריקות, מגנט בתפריט הנפתח. בחלון MagnetScan, הקלד 115 במיקום מסת הסמן ולחץ על Enter. אפשרו למגנט לסרוק את טווח המסה למשך 30 דקות בזמן שהמכשיר מתחמם.
לאחר 30 דקות, השתמש בבקרת הדגימה האוטומטית כדי לעבור למצב של פתרון כוונון רב-תכליתי של חלק אחד למיליארד. שאפו לפתרון הכוונון וכיוונו את המכשיר כדי למטב את קריאת האות. התאם את מיקום הלפיד עבור קואורדינטות X, Y, Z, כך שהפנס יתיישר עם מרכז המדוכים וקצב זרימת הנבולייזר בחלון בקרת הפלזמה.
בצע את ההתאמות הדרושות בחלון כוונון יון אופטיקה עבור המקור, הגלאי והמנתח. לאחר מיטוב קריאת האות, לחץ על עצור בחלון סריקת המגנטים, לחץ על כיול מגנט ובחר רזולוציה נמוכה בחלון הקופץ. לחץ על אישור ופתח את קובץ ה- smc כיול המסה כדי לכייל את המגנט.
לחץ על שמור, השתמש כדי להחיל את כיול המגנט הנוכחי על הניתוחים. בעת מדידת דגימות לא ידועות עם טווח עצום של ריכוזים, בצע כיול גלאי כדי להשוות אותות ספירת יונים בריכוזים נמוכים לאותות יונים מוחלשים המיוצרים בריכוזים גבוהים יותר. התחל ניתוח לדוגמה על-ידי לחיצה על רכישת נתונים ולאחר מכן לחץ על הגדרת שיטה בתפריט הנפתח.
השתמש בשיטה קיימת המסופקת על ידי היצרן או צור שיטה המבוססת על האלמנטים המעניינים. במידת הצורך, התאם את מצב הניתוח, זמן השהייה, השהיית המתג, מספר ההגרלות והמחזורים, הרזולוציה, מצב הזיהוי ומסת הפארק עבור הגדרות הסטה. לחץ על שמור כדי להקליט את הגדרות השיטה.
מטב את הפרמטרים עבור כל מתכת ואיזוטיפ. בשורת התפריטים, לחץ על רכישת נתונים. לחץ על Batch Run בתפריט הנפתח.
לחלופין, לחץ על סמל BATCH מתחת לסרגל התפריטים, יבא את פרמטרי האצווה מגיליון אלקטרוני או צור רצף בחלון Batch Run. הזן את סוג הדגימה, את מיקום ארון התקשורת של הדגימה האוטומטית, זמן ההעברה, זמן הכביסה, המשכפלים, מזהה הדגימה וקובץ השיטה. ארגן את הרצת האצווה עבור פתרונות סטנדרטיים לעקומת כיול, ולאחר מכן תקן בקרת איכות, ולאחר מכן דגימות לא ידועות.
עקוב אחר סחף המכשיר ושכפול הדגימה על ידי הכללת תקן בקרת איכות של 0.5 חלקים למיליארד כל 5 עד 10 דגימות. מחקרי ספיגת רקמות נערכו עם חשיפות המועברות במים של ציספלטין ותרכובת אנטי-סרטנית חדשנית מבוססת רותניום PMC79. קטלניות ועיכוב בקיעה הוערכו עבור ריכוזים נומינליים של ציספלטין.
0, 3.75, 7.5 15, 30 ו-60 מיליגרם לליטר ציספלטין. הצטברות פלטינה ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS ורקמת האורגניזם הכילה מינונים בהתאמה של 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם לאורגניזם. בקיעה מאוחרת נצפתה בכל ריכוזי הציספלטין.
לאחר ההפחתה, המקהלות נאספו ונותחו לפלטינה בנפרד. מינונים לא-קטלניים של ציספלטין ששימשו למחקרי דה-קוריונציה קבעו כי 93% עד 96% מכלל המינון המועבר של ציספלטין הצטברו בכוריון, כאשר המינון הנותר בתוך רקמת הזחל הצטבר בכוריון, כאשר המינון הנותר נמצא בתוך רקמת הזחל. זחלי דגי זברה נחשפו ל-0, 3.1, 6.2, 9.2 ו-12.4 מיליגרם לליטר של PMC79.
ריכוזים אלה נקבעו באופן אנליטי כמכילים 0, 0.17, 0.44, 0.66 ו-0.76 מיליגרם לליטר של רותניום. שלא כמו ציספלטין זה, לא נצפתה בקיעה מושהית בזחלים החשופים PMC79. כוריונים לא נכללו בניתוח רותניום מכיוון שהם התדרדרו באופן טבעי לפני איסוף הזחלים.
המתכת המסיבית בתוך רקמות הזחל שנותחה בכל ריכוז הייתה 0.19, 0.41 ו-0.68 ננוגרם של רותניום לכל זחל. כל אחד מהריאגנטים שנוספו לפרוטוקול החשיפה נותן פוטנציאל להפרעות איזובריות. במידת האפשר, שקול חלופות כמו קירור מהיר בהשוואה לטריקאין.
שיטה זו מאפשרת כימות מינון מתכתי לרעילות, יעילות, ניסויים שיש להשוות בין בעלי חוליות גבוהים יותר. התרגשנו במיוחד מכך שמינון הסף שלנו היה בסדר גודל שניתן לחולים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה חדשנית לכימות ספיגת מתכות בדגי זברה, המעניקה פתרון לאתגר של חשיפה לא ידועה למתכות במים. באמצעות שימוש בספקטרומטריית מסות עם פלסמה מקושרת השראית (ICPMS) על רקמה שעברה עיכול, חוקרים יכולים לתקף ביעילות תגובות למנה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- רעלנות סביבתית
- פרמקולוגיה
רקע
- דגי זבrafish הם אורגניזם מודל נפוץ במחקר.
- הבנת ספיגת מתכות היא קריטית למחקרים סביבתיים וקליניים.
- לשיטות מסורתיות יש מגבלות במדידה מדויקת של חשיפה במים.
- ICPMS מספקת גישה רגישה לניתוח עקבות של מתכות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לכימות ספיגת מתכות בדגי zebrafish.
- העמקת ההבנה של חשיפות למתכות מהבחינה הפארמקולוגית והסביבתית.
- תיקוף של קשרי מינון-תגובה באמצעות ניתוח רקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ספקטרומטריית מסה עם פלזמה השראית (ICPMS) לכימות מתכות.
- טכניקת עיכול רקמות עבור זחלי דג הזברה.
- שימוש בחומצה חנקית בדרגת טוהר גבוהה להכנת דגימות.
- ניתוח ספיגת מתכות מרמת התא ועד לרמת מערכות האיברים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה שפותחה מאפשרת כימות מדויק של ספיגת מתכות.
- היא מתגברת על מגבלות קודמות במדידת חשיפה במים.
- התוצאות מצביעות על יישומים פוטנציאליים במחקרים פרמקולוגיים וסביבתיים.
- השיטה מבטיחה פוטנציאל למחקרים עתידיים בהקשרים ביולוגיים מגוונים.
מסקנות
- הטכניקה החדשה משפרת באופן משמעותי את הערכת החשיפה למתכות בדגי זברה.
- היא מספקת בסיס למחקרים נוספים על השלכות סביבתיות וקליניות.
- מחקרים עתידיים יוכלו לנצל שיטה זו ליישומים רחבים יותר בטוקסיקולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של ספיגת תרכובות מבוססות מתכת בדגי zebrafish באמצעות ICPMS נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף תגובת מינון עבור גילוי תרופות בשלבים מוקדמים וטוקסיקולוגיה. גישה זו מאפשרת כימות ישיר של המינון הפנימי, ובכך תומכת בביטחון ניבוי במחקרי מנגנונים ובמידול תרגומי. השיטה משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק תרופות על ידי אספקת נתוני חשיפה אמינים עבור תרכובות מתכת הן פרמקולוגיות והן סביבתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות מדויק של ספיגת תרכובות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי תיקוף מטרה.
- תומך בהערכה תפקודית של תרופות ורעלים מבוססי מתכת במודל של חולייתים.
- משפר את הביטחון החזוי על ידי קישור בין המינון הפנימי לתגובה הביולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת מערכות מאושרות (validated) של דגי זברה עבור זרימות עבודה של סריקות המשך.
- מספק נתונים כמותיים וסטנדרטיים של ספיגה (uptake) לשימוש בפיתוח ובשחזור של בדיקות.
- מאפשר השוואה מהימנה של יעילות ורעילות של תרכובות תחת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני חשיפה של דגי זברה לספי תרשמיהם של מנות פרה-קליניות הרלוונטיות לחולייתנים גבוהים יותר.
- תומכת ברציפות תרגומית על ידי גישור בין מודלים של חשיפה סביבתית ופרמקולוגית.
- מספקת פלטפורמה לקידום מועמדים מבוססי מתכת בהתאמה לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת כימות זו, המבוססת על ICPMS, משולבת החל משלב הגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשרת ניתוח חסון של תגובה למספר (dose-response) ותובנה מכניסטית עבור תרכובות מבוססות מתכת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות כימות מינוני מתכת שהפנימו.
- סריקה: מספקת נתוני ספיגה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות ומיון תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות רגישות המותאמות למטריצה להשוואת ריכוזים ברקמות בין קבוצות ניסוייות.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני ספיגה בדגי zebrafish למידול מינונים פרה-קליני והתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה ניתנת להתאמה רחבה למחקרי חשיפה מגוונים המבוססים על מתכות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים של תרכובות מבוססות מתכת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של כימות ספיגת רקמות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של פיתוח (go/no-go) וניהול יעיל של הון בתיק הפרויקטים.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות טיפוליות ורעילות מבוססות מתכת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהפעלת ICPMS ובפרוטוקולי עיכול רקמות.
- מחייב גישה למ Реаגנטים ברמת טוהר גבוהה, לציוד עיכול עמיד בחומצה ולתשתית אנליטית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של נהלי כיול ובקרת איכות.
- ניתן להתאמה למספר תרכובות מתכת ולשלבי התפתחות שונים של דג הזברה באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- יש לקחת בחשבון הפרעות איזובאריות פוטנציאליות והשפעות של ריאגנטים בתכנון הניסוי.
