Name: גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: גלה שיטה מהירה לזיהוי עריכת RNA באמצעות אלקטרופורזה בגרדיאנט טמפרטורה מיקרו. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהימן של שינויים ב-RNA ללא צורך בריצוף ישיר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי מהחברה היפנית לקידום המדע (17H02204 ו- 18K19288). רוצ'יקה נתמכה כספית על ידי ממשלת יפן (מלגת MEXT). אנו מודים לגב' ראדהיקה ביאני (מעבדת טקאגי, JAIST) ולד"ר קירטי שארמה (תאגיד BioSeeds) על העזרה בניסויים הקשורים לאלקטרופורזה.

1. אופטימיזציה של קטע המטרה
הערה: ארבעה גנים ערוכים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה, כולל שני גנים גרעיניים (AT2G16586 ו- AT5G02670) מ - A. thaliana, והגנים המקודדים חלבון פלואורסצנטי כחול (BFP) וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) המתבטאים בתאי HEK293.
<ol><li>כדי לזהות שברי גנים עם פרופילי התכה שונים, המייצגים אזורים ערוכים לעומת אזורים לא ערוכים, ליצור עקומות התכה חזויות באמצעות הכלי מבוסס האינטרנט uMelt HETS, הרחבה של תוכנת uMeltהמקורית 13. הערה: כלי זה חוזה את הצורות של עקומות התכה עבור מוצרי הטרודופלקס והומודופלקס.</li>
	<li>עבור כל גן מטרה, עצבו שלושה זוגות של שברי גנים (באורך של 300-324 bp). כל זוג מורכב מקטע עם אתר ערוך ומקטע תואם מסוג פראי עם אתר לא ערוך, הממוקם בקצה 5'-מסוף, מיקום אמצעי או 3' -קצה קצה.</li>
	<li>בחר את הזוג הלא ערוך/ערוך שהראה את ההפרש המרבי בין אזורי ההיתוך בציר ההליקיטי לניתוח נוסף. לצורך ניתוח μTGGE, סינתז את קטע הגן שנבחר על ידי הגברת PCR, כמתואר בסעיף 2 להלן.</li>
	<li>תכנן את הפריימרים קדימה ואחורה באמצעות תוכנת DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) ואמת באמצעות הכלי NCBI Primer-BLAST.</li>
	<li>דילול הפריימרים במאגר TE (10 mM Tris-HCl המכיל 1 mM EDTA· Na2) ולאחסן אותם בריכוז של 100 pmol/μL. לפני השימוש, דיללו כל פריימר שנקבע לריכוז של 10 pmol/μL באמצעות מים מזוקקים.</li>
</ol>2. מיצוי RNA והגברת RT-PCR של מקטע המטרה
<ol><li>מיצוי RNA<ol>
<li>חלץ RNA כולל ממקור של גנים ערוכים ולא ערוכים בשיטות סטנדרטיות, כגון מיצוי TRIzol14 או ערכות זמינות מסחרית.</li>
		<li>בצע את הסינתזה של ה- cDNA המתאים באמצעות פרוטוקול RT-PCR סטנדרטי כמתואר בשלב 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמלול הפוך<ol>
<li>הוסיפו 1 μL של פריימר אוליגו(dT), 1 μL של תערובת dNTP של 10 mM, 10 μL של RNA כולל, ו-10 μL של מים מזוקקים סטריליים לצינור מיקרוצנטריפוג' נטול נוקלאז.</li>
		<li>מחממים את התערובת ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז דוגרים על קרח למשך דקה אחת לפחות.</li>
		<li>אסוף את תוכן הצינור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית (12,000 x g) עבור 2-3 שניות, והוסף 4 μL של 5x ReverTra Ace buffer, 1 μL של 0.1 M DTT, ו-1 μL של M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) הפוך תעתיק הפוך (200 U/μL, טבלת חומרים).</li>
		<li>מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות. אם אתה משתמש בפריימרים אקראיים, דגירה של הצינור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה של הצינור בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ולאחר מכן השביתו את התגובה על ידי חימום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, באמבטיה יבשה דיגיטלית / מחמם בלוקים.</li>
		<li>מדוד את ריכוז ה- cDNA באמצעות ספקטרופוטומטר ואחסן אותו בטמפרטורה של -25 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגברת PCR וריצוף מאשר של מוצרים
	<ol>
<li>הוסיפו את הריאגנטים הבאים לצינור מיקרו-צנטריפוג' נטול נוקלאזות: 4 μL של 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL של תערובת dNTP של 2 mM, 2 μL של 25 mM MgCl2, 1.6 μL של קבוצת הפריימרים (קדימה ואחורה; כל 10 mM), 2 μL של תבנית cDNA, 0.1 μL של Taq פולימראז (2.5 U/μL), ו-8.3 μL של מים מזוקקים סטריליים (נפח סופי, 20 μL).</li>
		<li>בצע PCR עם תנאי האופניים הבאים: דנטורציה ראשונית ב 95 °C (95 °F) למשך 2 דקות; 35 מחזורים של דנטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, חישול בטמפרטורה מתאימה (תלוי בערכת הפריימרים הספציפית המשמשת) במשך 30 שניות, והרחבה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ולאחר מכן הארכה סופית ב 72 °C (72 °F) למשך 7 דקות.</li>
		<li>כדי לטהר את מוצרי ה-PCR, הוסיפו 2 U של אקסונוקלאז I ו-0.5 U של פוספטאז אלקליין שרימפס (ExoSAP). דגירה של הצינור ברכיבה תרמית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן שמרו על 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.</li>
		<li>לריצוף מאשר, הוסף 11.5 μL של מים מזוקקים סטריליים, 2.5 μL של פריימר קדימה או אחורה, ו-1 μL של מוצרי PCR (עם ExoSAP) לצינור microcentrifuge חדש. הערה: השתמש בשירותי ריצוף דנ"א (למשל, Eurofins Genomics) לניתוח ריצוף.</li>
		<li>כדי לאמת את הספציפיות של מוצרי ה-PCR, בצע ריצוף עם פריימרים קדימה ואחורה. זוגות הפריימרים המשמשים בניתוח הייצוגי ניתנים בטבלה 1.</li>
		<li>דיללו את מוצרי ה-PCR המטוהרים לריכוז של 200 ננוגרם/מיקרול עם מים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, יש לערבב 6 μL של המוצר המטוהר עם 3 μL של 6x ג'ל טעינת צבע בצינור 250 μL ולהגדיל את הנפח הכולל ל 12 μL עם מים סטריליים. אחסן את מוצר ה-PCR (בטמפרטורה של -25 °C) עד שיהיה מוכן להמשיך עם μTGGE כמתואר להלן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח μTGGE
הערה: ניתוח μTGGE מבוצע באמצעות מערכת ממוזערת וכלכלית. סקירה כללית של המערכת כולה, כולל קלטות הג'ל, מחזיק קלטות הג'ל, פלטפורמת אלקטרופורזה אופקית של ג'ל, ספק כוח ומערכת הדמיית ג'ל, מוצגת באיור 2.
<ol><li>הרכבה של קלטות הג'ל<ol>
<li>קלטת הג'ל המשמשת לניתוח μTGGE מוצגת באיור 2A. העיצוב מורכב משלוש צלחות ג'ל בגודל 1 אינץ ': צלחת ג'ל תחתונה, צלחת ג'ל עליונה וצלחת לשעבר. כרכו את צלחת הג'ל העליונה בין שתי הצלחות האחרות והרכיבו במחזיק הקסטות של הג'ל לפולימריזציה של הג'ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד<ol>
<li>מוסיפים 7.2 גרם אוריאה לצינור של 50 מ"ל ומתמוססים ב-10 מ"ל של מים סטריליים. מחממים את הדגימה במיקרוגל במשך 20-30 שניות ואז מביאים אותה לטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הוסף 3 מ"ל של 5x טריס / בוראט / EDTA (TBE) חיץ (טבלת חומרים), 2.25 מ"ל של 40% (w / v) אקרילאמיד / ביס (19: 1), 75 μL של 10x אמוניום persulfate, ו 15 μL של טטרהמתילאתילנדיאמין לתמיסה.</li>
		<li>מיד לשפוך את תמיסת הג'ל לתוך מחזיק קלטת ג'ל לאט, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יצירת פרופילי התכה באמצעות יחידת μTGGE<ol>
<li>השתמשו בגרסה הממוזערת והחסכונית של מנגנון ה-μTGGE המוצגת באיור 2 עם שיפוע טמפרטורה (25-65 מעלות צלזיוס) הניצב לכיוון נדידת הדנ"א.</li>
		<li>השרו את רפידות מאגר האלקטרופורזה העליונות והתחתונות (0.5 ס"מ x 2.5 ס"מ) ב-2 מ"ל של מאגר TBE אחד.</li>
		<li>הניחו את קלטת הג'ל ביחידת תא האלקטרופורזה האופקית ומקמו את רפידות המאגר העליונות והתחתונות בהתאם, כפי שמוצג באיור 2.</li>
		<li>לאחר מכן, טען 10 μL של מוצר ה- PCR לבאר האמצעית (הארוכה יותר) ו- 1 μL של מוצר ה- PCR לכל באר צדדית.</li>
		<li>לאחר המתנה של דקה אחת, חבר את יחידת הכוח וספק 100 וולט למשך 12 דקות בשיפוע טמפרטורה ליניארי מ 25-65 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחר סיום הריצה, הוציאו את הקלטת והסירו את כיסוי הזכוכית העליון.</li>
		<li>יוצקים 300 μL של כתם זהב SYBR 10x על הג'ל. דמיינו את פרופילי ההיתוך באמצעות פנס ה-LED הכחול המותקן בהתקן האלקטרופורטי בגודל כף היד. הערה: יש לשמור קובץ רך של תמונת הג'ל עבור חישוב ציון דמיון תבנית (PaSS).</li>
		<li>חזור על כל ניסוי אלקטרופורטי פי 3 כדי לאשר את יכולת השכפול של הנתונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. חישובי PaSS
הערה: החישובים מבוצעים באמצעות תוכנת μTGGE Analyzer.
<ol><li>הורד ופתח את התוכנה.</li>
	<li>פתח את קובץ JPEG המכיל את תמונת הג'ל. שים לב שהתוכנה תקבל רק קבצים בפורמט JPEG.</li>
	<li>לחץ על כפתור מסגרת ובחר את האזור (מסגרת) המתאים של תמונת הג'ל.</li>
	<li>לחצו על הלחצן 'תיקון קואורדינטות ' והוסיפו שתי נקודות הפניות, כפי שמוצג באיור 1B.</li>
	<li>לחץ על לחצן הוספת נקודות תכונה והוסף נקודות לדוגמה כפי שמוצג באיור 1B. לאחר מכן שמור את נתוני תמונת הג'ל המעובדים בתבנית μTGGE (*.tgg).</li>
	<li>לחץ על הלחצן לדוגמה ובחר באפשרות חפש נקודות פשוטות כדי להשוות בין שתי תמונות או יותר.</li>
</ol>

<ol><li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li>
<li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+RNA+editing%3A+a+molecular+analysis+of+GluR2%2C+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li>
<li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li>
<li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li>
<li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li>
<li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+in+genetic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+biology%3A+Not+drowning+but+waving%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li>
<li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).</li>
<li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids%3A+analysis+of+conformational+transitions%2C+sequence+variations%2C+and+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li>
<li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+of+BFP%2C+a+point+mutant+of+GFP%2C+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).</li>
<li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+%28ADARs%29+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li>
<li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635(2021).</li>
<li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

עריכת רנ"א ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה; עם זאת, השיטות הנוכחיות לאיתור עריכת RNA, כגון כרומטוגרפיה וריצוף, מציבות מספר אתגרים בשל עלותן הגבוהה, דרישות הזמן המופרזות ומורכבותן. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאיתור עריכת RNA המשתמשת במערכת ניידת, מיקרו-גדולה, מבוססת TGGE. ניתן להשתמש במערכת זו כדי להבדיל בין גנים ערוכים ולא ערוכים לפני ריצוף סנגר. באופן ספציפי, ניתן להבחין בין גנים ערוכים ולא ערוכים עם שינויים בנוקלאוטידים חד-בסיסיים על סמך שינויים בפרופילי ההיתוך של TGGE. מכיוון שהיא משלבת 1 בג'לים, ה...

וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים (SNVs) ברנ"א גנומי, כולל גרסאות A-to-I, C-to-U ו-U-to-C, יכולות להצביע על אירועי עריכת RNA. עם זאת, זיהוי של SNVs ב- RNA נותר משימה מאתגרת מבחינה טכנית. באופן קונבנציונלי, היחס בין רנ"א ערוך לרנ"א לא ערוך נקבע על ידי ריצוף ישיר, תגובת שרשרת פולימראז ספציפית לאלל בזמן אמת (PCR), או דה-נטורציה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מתקרבת ל-1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה אינן חסכוניות במיוחד בזמן או באופן חסכוני במיוחד, והדיוקים הנמוכים שלהן, הנגרמים על ידי רמות גבוהות של רעש, מציבים צווארי בקבוק טכנולוגיים לזיהוי SNV מבוסס RNA 7,8. כאן נתאר פרוטוקול המבוסס על אלקטרופורזה של ג'ל שיפוע טמפרטורה (TGGE) לזיהוי פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) כשיטה חלופית המבטלת את הצורך בגישות ריצוף RNA ישירות לניתוחי עריכת RNA.
אלקטרופורזה היא שיטה מועדפת להפרדה וניתוח של ביומולקולות במעבדות מדעי החיים. TGGE מאפשר הפרדה של מקטעי דנ"א דו-גדיליים שהם באותו גודל אך בעלי רצפים שונים. הטכניקה מסתמכת על הבדלים הקשורים לרצף בטמפרטורות ההיתוך של שברי דנ"א ועל השינויים הבאים בניידות שלהם בג'לים נקבוביים עם שיפוע טמפרטורה ליניארי 9,10. התכה של מקטעי דנ"א יוצרת פרופילי התכה ספציפיים. ברגע שהתחום עם טמפרטורת ההיתוך הנמוכה ביותר מגיע לטמפרטורה המתאימה במיקום מסוים בג'ל, מתרחש המעבר ממבנה סלילי למבנה מומס חלקית, והנדידה של המולקולה תיעצר למעשה. לכן, TGGE משתמשת הן בניידות (מידע על גודל) והן במעברים מבניים המושרים על ידי טמפרטורה של מקטעי דנ"א (מידע תלוי רצף), מה שהופך אותה לגישה רבת עוצמה לאפיון מקטעי דנ"א. נקודות התכונה בתבנית התכה של TGGE, המתאימות לשלושה מעברים מבניים של מולקולת הדנ"א, הן נקודת הדיסוציאציה ההתחלתית של גדיל, נקודת הדיסוציאציה האמצעית של הגדיל, ונקודת הדיסוציאציה הסופית של הגדיל (איור 1). וריאציות רצף בתוך תחומים, אפילו הבדלים חד-בסיסיים, משפיעות על טמפרטורת ההיתוך, ולכן, מולקולות עם רצפים שונים יציגו דפוסי התכה בדידים (דנטורציה) בניתוחי TGGE. לכן, TGGE יכול לשמש לניתוח SNVs ברנ"א גנומי ויכול להיות שיטה בעלת תפוקה גבוהה שלא תסולא בפז לגילוי עריכת RNA. רווח זה בתפוקה גבוהה הולך לאיבוד כאשר נעשה שימוש ב- TGGE מסורתי מבוסס אלקטרופורזה של ג'ל. עם זאת, ניתן להשתמש בגרסה ממוזערת של TGGE, הנקראת microTGGE (μTGGE), כדי לקצר את הזמן האלקטרופורטי של הג'ל ולהאיץ את הניתוח עם עלייה של פי 100 בפרודוקטיביות11. הפשטות והקומפקטיות של שיטת μTGGE שופרו על ידי הצגת PalmPAGE12, מערכת אלקטרופורזה ג'לית ישימה בשדה, כף יד ובמחיר סביר.
כאן, פרוטוקול חדש המבוסס על TGGE משמש לבחינת שלושה סוגים של אתרי עריכת RNA (A-to-I, C-to-U ו-U-to-C) בארבעה גנים, כולל שניים מרקמות ה-Arabidopsis thaliana ושניים המתבטאים בתאי HEK293 של יונקים (איור 1A). הפרוטוקול משלב את השימוש ב-PalmPAGE (חומרה), מערכת ניידת לזיהוי מהיר של עריכת RNA, ו-uMelt (תוכנה)13. עם זמן ריצה ממוצע של 15-30 דקות, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מהיר, אמין וקל של עריכת RNA ללא צורך בגישות ריצוף RNA ישירות.

<table><tbody><tr><td>2U ExoI</td><td>טקארה</td><td>2650A</td><td>אקסונוקלאז I</td></tr><tr><td>40(w/v)%-אקרילאמיד/BIS (19:1)</td><td>תרמו-פישר</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>פרסולפט אמוניום (APS)</td><td>תרמו פישר</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיני ספין</td><td>אפנדורף</td><td>5452000034</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה יבשה דיגיטלית/מחמם בלוק</td><td>תרמו-פישר</td><td>נה</td><td></td></tr><tr><td>תערובת Gold Taq Polymerase Master</td><td>פרומגה</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>פולימראז LATaq DNA</td><td>טאקארה</td><td>RR002A</td><td>טאק פולימראז</td></tr><tr><td>מיקרו-TGGE&nbsp; מחזיק קלטות</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-GE-CH</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מיקרו-TGGE</td><td>Lifetech Corp.</td><td>TG</td><td></td></tr><tr><td>קלטת ג'ל מיקרו-TGGE</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-TGGE-C</td><td></td></tr><tr><td>ננודרופ 1000</td><td>תרמו-פישר</td><td>ND-1000</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>ערכת Plant Rneasy Mini</td><td>קיאגן</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace Master Mix</td><td>טויובו</td><td>TRT101</td><td>M-MLV (נגיף לוקמיה של מורין מולוני) הפוך של טרנסקריפטאז</td></tr><tr><td>ערכת Rneasy Mini</td><td>קיאגן</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>שרימפס אלקליין פוספטאז</td><td>טקארה</td><td>2660B</td><td></td></tr><tr><td>גוון ג'ל חומצה גרעינית SYBR Gold</td><td>תרמו-פישר</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>בופר TBE</td><td>תרמו-פישר</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>טטראמתילאתילנדיאמין (TEMED)</td><td>נקלאי טסקה</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>נבדקו אוריאה, נוקלאז ופרוטאז</td><td>נקלאי טסקה</td><td>35940-65</td><td></td></tr></tbody></table>

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת rna

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

עריכת RNA היא תהליך שמוביל לשינויים ברצף פוסט-טרנספורמטיבי ב-RNA. זיהוי וכימות של עריכת RNA מסתמכים בעיקר על ריצוף סנגר וטכניקות ריצוף RNA. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות יקרות וגוזלות זמן רב. בפרוטוקול זה, מערכת אלקטרופורזה ניידת של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) משמשת כגישת אי-ריצוף לזיהוי מהיר של עריכת RNA. התהליך מבוסס על עקרון האלקטרופורזה, המשתמשת בטמפרטורות גבוהות כדי לנטרל דגימות של חומצות גרעין בזמן שהן נעות על פני ג'ל פוליאקרילאמיד. על פני טווח טמפרטורות, מקטע דנ"א יוצר שיפוע של דנ"א דו-גדילי מלא לגדילים מופרדים חלקית ולאחר מכן לדנ"א חד-גדילי מופרד לחלוטין. אתרים שנערכו על ידי RNA עם בסיסי נוקלאוטידים מובחנים מייצרים פרופילי התכה שונים בניתוחי μTGGE. השתמשנו בגישה המבוססת על μTGGE כדי לאפיין את ההבדלים בין פרופילי ההיתוך של ארבעה מקטעי RNA ערוכים לבין השברים הלא ערוכים (מסוג פראי) המתאימים להם. ציוני דמיון תבניות (PaSSs) חושבו על ידי השוואת תבניות הפסים שהופקו על ידי ה-RNA הערוכים והלא ערוכים, ושימשו להערכת יכולת השכפול של השיטה. באופן כללי, הפלטפורמה המתוארת כאן מאפשרת לזהות אפילו מוטציות בסיס בודדות ברנ"א בצורה פשוטה, פשוטה וחסכונית. הצפי הוא שכלי ניתוח זה יסייע לממצאים חדשים של הביולוגיה המולקולרית.

שימוש ב- μTGGE לזיהוי שינויים בבסיס נוקלאוטידים בודדים באירועי עריכת RNA ארבעה גנים ערוכים שימשו לפרוטוקול זה (טבלה 1), כולל הגן BFP המיוצר בתאי HEK293 (עם עריכת RNA C-to-U על ידי אנזימי הדאמינאז של קומפלקס אנזימי העריכה של אפוליפופרוטאין B mRNA; APOBEC115), הגן EGFP המכיל את קודון עצירת האוכרה (TAA) המיוצר בתאי HEK293 (עם עריכת RNA A-to-I על ידי אדנוזין דאמינאז הפועלת על רנ"א 1; ADAR116), והגנים הגרעיניים AT2G16586 ו-AT5G02670 ב-A. ...

זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

עריכת RNA ממלאת תפקיד קריטי במחלות אנושיות. מדענים מוצאים יישום אינסופי בתרופות. פרוטוקול זה מדגים את היישום של טכנולוגיית אלקטרופורזה בטמפרטורה ניידת כגישה שאינה ריצוף לזיהוי מהיר ואמין של שינוי RNA בעריכת RNA ללא צורך בריצוף RNA ישיר.הגישה מבוססת האלקטרופורזה של מיקרו tTG שימשה לאפיון ההבדלים בין פרופיל ההיתוך של ארבעה מקטעי RNA ערוכים לבין הקטעים הלא ערוכים המתאימים להם. ציוני הדמיון בדפוס שימשו להערכת יכולת השכפול של השיטה. פלטפורמה זו מאפשרת זיהוי של אפילו החלפה חד-פעמית ב-RNA, בצורה פשוטה, פשוטה וחסכונית.הצפי הוא שכלי אנליטי זה יסייע לממצאים חדשים בביולוגיה מולקולרית בגין על ידי זיהוי שברי גנים בעלי פרופילי התכה שונים וייצור עקומות התכה חזויות באמצעות הכלי מבוסס האינטרנט Umelt HETS. תכנן שלושה זוגות של 300 עד 324 שברי גנים של זוגות בסיסים עבור כל גן מטרה. בחר את הזוג שאינו ערוך או ערוך המציג את ההבדל המרבי בין אזורי ההיתוך בציר ההליקיטי לניתוח נוסף.לניתוח micro-TGGE, סינתזו את מקטע הגן שנבחר על ידי הגברת PCR. תכנן את הפריימרים קדימה ואחורה באמצעות תוכנת דינמו DNA, ואמת את רצף הפריימרים באמצעות הכלי NCBI Primer-BLAST. חלץ רנ"א כולל ממקור של גנים ערוכים ולא ערוכים בשיטות סטנדרטיות.סינתזו את ה-cDNA המתאים, הכינו 20 מיקרוליטרים של תערובת תגובת ה-PCR והגדירו את ה-PCR כמתואר בכתב ה

a-nonsequencing-approach-for-the-rapid-detection-of-rna-editing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

בדיקה רגישה ביותר מבוססת ריבוזים, הניתנת ליישום לסינון תפוקה גבוהה של כימיקלים המכוונים לתהליך הייחודי של עריכת RNA בפתוגנים טריפנוזומטים, מתוארת במאמר זה. מעכבים יכולים לשמש ככלים לניתוח מונחה השערות של תהליך עריכת ה-RNA ובסופו של דבר כטיפולים.

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (&lt;35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ"א, חלבונים, וכו ') על...

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

גלה שיטה מהירה לזיהוי עריכת RNA באמצעות אלקטרופורזה בגרדיאנט טמפרטורה מיקרו. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהימן של שינויים ב-RNA ללא צורך בריצוף ישיר.

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

גלה סרטונים נוספים