Name: טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו שיטה לטיהור חלבוני p53 מיובקווינטים מתאי יונקים תוך שימור מצב הקישור של האוביקוויטין. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקידי היובקווינציה בויסות פעילות חלבונים בביוכימיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81972624) לד.ל.

הערה: תאי H1299 סופקו בחביבות על ידי בנק תאי הגזע, האקדמיה הסינית למדעים והוכחו כשליליים לזיהום מיקופלסמה.
1. תרבית תאים
<ol><li>עבור התרבית הראשונית, יש למקם 1 x 106 תאים של קו תאי אדנוקרצינומה בריאה אנושית, H1299 בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם 10-12 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גלוטמין 1%, 1% נתרן פירובט ואנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2. פצלו את התאים כל 2-3 ימים, תלוי מתי הם מגיעים למפגש של 80%-90%.</li>
	<li>יום אחד לפני ההעברה, הכינו 6-9 x 10 6 תאים לשלוש צלחות פטרי וצלחת 2-3 x 106 תאים בצלחת פטרי אחת בגודל 10 ס"מ המכילה 10-12 מ"ל בינוני כדי להשיג מפגש של 70%-90% במהלך ההעברה. הערה: תאי HEK293T יכולים לשמש גם לטיהור חלבונים המכילים יוביקוויטין בשל יעילות ההעברה הגבוהה שלהם ורמת ביטוי החלבון.</li>
</ol>2. טרנספקציה פלסמידית
<ol><li>הוסף 1.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל צינור כדי לבצע דילולים באופן הבא. צינור 1: 1 מיקרוגרם של פלסמיד דגל-p53, 12 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 2: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד His-HA-Ub (HH-Ub), ו-9 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 3: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד HH-Ub, ו-9 מיקרוגרם של פלסמיד Mdm2. הוסף סך של 0.2 מיקרוגרם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פלסמיד לכל צינור כדי לפקח על יעילות הטרנספקציה. הערה: יש לבצע ניסוי פיילוט כדי לקבוע את הכמויות האופטימליות של פלסמידים הדרושים להשגת ביטוי יעיל של חלבון מטרה בתאים.</li>
	<li>הוסף 78 μL של ריאגנט טרנספקציה ליפוזום ל-4.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל ליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ומאפשרים לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת הליפוזום המדוללת לכל צינור משלב 2.2 המכיל 1.5 מ"ל של תמיסת ה- DNA המדוללת. ערבבו היטב וצלבו את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות ב-RT. השתמשו בדנ"א פלסמיד: יחס ליפוזום של 1:2 (מיקרוגרם:μL) עבור כל טרנספקציה.</li>
	<li>השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו 9 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל מנה. מוסיפים 3 מ"ל מתערובת הליפוזום-DNA לכל מנה ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת קדימה ואחורה פי 3, ואז שמאלה וימינה פי 3 לפיזור שווה של התערובת בצלחת.</li>
	<li>תרבית את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. מחליפים את המדיום לאחר 4-6 שעות וממשיכים לתרבת את התאים במשך 24-36 שעות.</li>
</ol>3. איסוף תאים
<ol><li>לאחר 24-36 שעות, לטפל בתאים עם MG132 בריכוז סופי של 10 μM במשך 4-6 שעות. הערה: MG132 הוא אלדהיד פפטידי החוסם ביעילות את הפעילות הפרוטאוליטית של קומפלקס פרוטאזום 26S. ניתן להגדיל את כמויות החלבונים המכילים שרשראות פוליוביקוויטין המקושרות לליזין-48 (K48) לאחר טיפול בתאים ב-MG132 או במעכבי פרוטאזומים אחרים.</li>
	<li>יש להשליך את המדיום, לשטוף את התאים פי 2 (תוך הקפדה שלא לשטוף את התאים) בתמיסת מלח זרחתית קרה כקרח (PBS), ולשאוף את התאים עם פיפטים סרולוגיים.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של PBS לצלחת, להסיר את התאים על ידי גירוד עם מגרד נקי, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף כדורי תא.</li>
</ol>4. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים nondenaturing
<ol><li>יש להכין את חיץ התסיסה של פלאג (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), 1% טריטון X-100, 0.2% סרקוזי ו-10% גליצרול) בתוספת טרייה של קוקטייל מעכב פרוטאז לפני השימוש.</li>
	<li>הוסיפו 800 μL של חיץ Flag lysis קר כקרח לתאים בכל צינור, ערבבו את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ולאחר מכן דגרו את התערובת על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>נושא התערובת ל 5-10 פולסים קצרים של אולטרה סאונד. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. דגירה של התערובת על מסובב ב-40 סיבובים לדקה (סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות אולטרה סאונד ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.</li>
	<li>Aliquot 80 μL (1/10) של תמצית התא ולערבב עם 20 μL של 5x נתרן דודציל סולפט (SDS) טעינה חיץ. מרתיחים את הדגימות בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. השתמש בדגימות אלה כקבוצת הקלט כדי לנטר את ביטוי החלבון.</li>
	<li>יש להוסיף 30 μL של חרוזי נוגדנים מצומדים נגד דגל M2 (Flag/M2) לתמציות התאים הנותרות ולדגור על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות או למשך הלילה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ ליסיס פלאג קר כקרח לחרוזים וערבבו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. חזור על שלב 4.7 במשך 4-6 פעמים.</li>
	<li>הוסיפו 40 μL של פפטידי דגל בריכוז סופי של 200 ng/μL לחרוזים ודגרו על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לחמוק מהחלבונים הקשורים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.</li>
	<li>מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים את התערובת בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate משלב 4.10 ישירות בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם. הערה: ניתן להגדיל את כמות החלבונים המטוהרים המכילים יוביקוויטין על-ידי הגדלת מספר התאים וכמויות הפלסמידים שעברו טרנספקציה. ניתן להתאים אסטרטגיית תיוג אפיטופים כדי לטהר קומפלקסים תאיים הנקשרים במיוחד ל-p53 המצוי בכל מקום בתנאי טיהור מקומיים. על-ידי ביטוי משותף של Flag-p53, mdm2 ו-HA-ubiquitin, קומפלקס החלבונים p53 המצוי בכל מקום עשוי להיות משוקע על ידי אגרוז מצומד של דגל רציף ונוגדנים HA מתאי יונקים. כדי לשמור על שותפים קושרים של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום, יש להשתמש במאגר התזה BC100 המחמיר פחות (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% גליצרול, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 ומעכב פרוטאז 1x) במהלך תהליך הטיהור. הפלט מפפטיד HA נתון לספקטרומטריית מסות כדי לזהות את כל השותפים הנקשרים באופן ספציפי ל-p53 המצוי בכל מקום.</li>
</ol>5. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים denaturing
<ol><li>הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכדורי התא שהתקבלו בשלב 3.3 וערבבו באופן שווה. Aliquot 100 μL (נפח 1/10) של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge כמו דגימת קלט.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדורי התא. הוסף 80 μL של מאגר Flag lysis לדגימת הקלט, ערבב את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ותלה את התאים על הקרח במשך שעה אחת.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot 80 μL של supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>יש להוסיף 20 μL של מאגר טעינה 5x SDS לסופרנטנט, להרתיח בטמפרטורה של 98°C למשך 5-10 דקות, לקרר על קרח למשך 2 דקות ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.</li>
	<li>צנטריפוגה את 900 μL הנותרים של מתלה התא ב 700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C כדי לאסוף את גלולת התא. הוסף 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 1 (מאגר UB 1; 6 M guanidine-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), ו-0.2% Triton X-100, בתוספת טרייה של 10 mM β-מרקפטואתנול ו-5 mM imidazole) לכדורי התא וערבב מספר פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים באופן שווה. הערה: ריכוז האימידזול עשוי להשתנות בין 5 mM ל-20 mM כדי להפחית את קשירת החלבון הלא ספציפי על השרף הטעון ניקל. חיץ יוביקוויטין מכיל גואנידין הידרוכלוריד, אשר משבית הן ליגאזות והן DUBs. β-מרקפטואתנול הוא נוזל צלול וחסר צבע עם ריח חזק ולא נעים הדומה לביצים רקובות. תמיסה בריכוז גבוה תגרום נזק חמור לקרום הרירי, לדרכי הנשימה העליונות, לעור ולעיניים. יש ללבוש כפפות ומשקפי מגן ולפעול במכסה המנוע.</li>
	<li>נושא התא lysates ל 10-20 סיבובים של אולטרה סאונד עד הפתרון הוא כבר לא צמיג. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>הוסיפו 30 μL של שרף טעון ניקל לסופרנטנט ודגרו על מסובב שנקבע ב-15 סל"ד למשך 4 שעות או לילה ב-RT. צנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של מאגר UB 1, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 2 (מאגר UB 2; 8 M אוריאה, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ו-0.2% Triton X-100) לחרוזים, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x g למשך2דקות כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.</li>
	<li>לחרוזים, הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו עם סיבוב בשייקר במשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.</li>
	<li>חלבונים הקשורים לאלוטה על ידי דגירה של החרוזים עם 40 μL של אימידזול בריכוז סופי של 0.5 M למשך שעה אחת ב-RT. צנטריפוגה בגודל 1,500 x g למשך 2 דקות ב-RT.</li>
	<li>מעבירים את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים ב-98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate הלא מעובד בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם.</li>
</ol>6. זיהוי של חלבונים מטוהרים בכל מקום על ידי כתם מערבי
<ol><li>פתור את הדגימות משלבים 4.11 ו- 5.12 על ידי נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), ולאחר מכן העבר אותן לממברנה ניטרוצלולוז על ידי כתם מערבי כדי לזהות חלבוני מטרה באמצעות הנוגדנים המתאימים כמתואר18.</li>
	<li>בקצרה, דגירה על הממברנה על ידי טבילה ב-20 מ"ל של תמיסה חוסמת המכילה אבקת חלב 5% דפט בחיץ TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, תוספת טרייה עם 0.1% Tween-20 לפני השימוש) ב-RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, לדגור את הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ב RT במשך 2 שעות או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בנוגדנים הבאים עבור כל קבוצה. כל הנוגדנים הראשוניים שימשו בדילול של 1:1000.<ol><li>זהה חלבון p53 כולל, כולל p53 ubiquitinated, עם נוגדן חד-שבטי נגד p53 לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.</li>
		<li>זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן נגד HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.</li>
		<li>זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן חד-שבטי אנטי-p53 לאחר משיכת שרף טעון ניקל.</li>
		<li>זהה את סך כל החלבון המצוי בכל מקום עם נוגדן אנטי-HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר משיכת שרף טעון ניקל.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגום את הממברנה עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) ב-RT למשך שעה אחת לאחר שטיפה 3x עם חיץ TBST במשך 5 דקות כל אחד. כל הנוגדנים המשניים שימשו בדילול של 1:3000. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם חיץ TBST 3x במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>הפעל את מערכת ההדמיה chemiluminescence כדי לזהות אותות מכתם מערבי. הכן את פתרון המצע עבור תוכנית המענה ההומניטרי על-ידי ערבוב פתרונות A ו- B ביחס של 1:1.</li>
	<li>מניחים את קרום הניטרוצלולוז בקמרה אובסקורה עם הפנים כלפי מעלה ומצפים את תמיסת המצע באופן שווה על הממברנה באמצעות אקדח פיפטינג. בחר את הליך החשיפה האוטומטי כדי ללכוד אותות כימילומינסנטיים וכוונן ידנית את זמן החשיפה עד להשגת אות אידיאלי.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

יוביקוויטינציה ממלאת תפקיד קריטי כמעט בכל התהליכים התאיים הפיזיולוגיים והפתולוגיים2. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה בהבנת התפקיד המולקולרי של יוביקוויטין במסלולי איתות וכיצד שינויים במערכת האוביקוויטין מובילים למחלות אנושיות שונות2. הטיהור של חלבונים המכילים יוביקוויטין תורם לתובנה לגבי התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בתהליכים אלה. ניתן לטהר את התערובות של חלבונים מצומדים ליוביקוויטין מתאים בתנאי אי-דנטורציה ודנאטורציה. ניתן להשתמש ב-IMAC באמצעות שרפים של ניקל כדי לטהר ...

אוביקוויטין הוא חלבון משומר אבולוציונית של 76 חומצות אמינו 1,2,3. אוביקוויטין קושר באופן קוולנטי שאריות ליזין על חלבוני מטרה באמצעות מפלים המערבים אנזימים מפעילים (E1), מצומדים (E2) וליגאז (E3). יוביקוויטין מופעל תחילה על ידי האנזים E1 ולאחר מכן מועבר לאנזימים המצומדים E2. לאחר מכן, ליגאזות יוביקוויטין E3 מתקשרות הן עם אנזימי E2 טעונים ביוביקוויטין והן עם חלבוני סובסטרט ומתווכות את היווצרותו של קשר איזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לבין שאריות ליזין במצע 1,2,3,4,5. יוביקוויטינציה כרוכה בחיבור של יוביקוויטין מואטי לשאריות ליזין על חלבוני המצע או לעצמה, מה שמוביל למונוביקוויטינציה של חלבונים או לפוליוביקוויטינציה. תהליך זה של ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומסדיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. יוביקוויטינציה גורמת לפירוק חלבוני הסובסטרט באמצעות מערכת יוביקוויטין-פרוטאזומים 1,2,3,4,5. בנוסף, יוביקוויטינציה מווסתת לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, היווצרות קומפלקס חלבונים וסחר בחלבונים בתאים 3,5. ניתן להסיר יוביקוויטין מואטי הקשור לחלבוני סובסטרט על ידי דה-אוביקוויטין אנזימים (DUBs)6,7. יש לציין כי הדרכים השונות שבהן שרשראות יוביקוויטין מורכבות מספקות מספר עצום של אמצעים לוויסות תהליכים ביולוגיים שונים 1,5. התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד חלבון המצע עדיין אינם מובנים במלואם עד כה. הטיהור של חלבונים ubiquitinated תורם להבהרת ההשפעות של חלבון ubiquitination על מגוון רחב של תהליכים תאיים.
החלבון p53 הוא אחד החלבונים מדכאי הגידול החשובים ביותר והוא מציג מוטציות גנטיות או השבתה כמעט בכל סוגי הסרטן האנושיים 8,9,10,11. היציבות והפעילות של P53 מווסתות בעדינות in vivo על-ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים, כולל יוביקוויטינציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה12,13. לחלבון p53 יש זמן מחצית חיים קצר הנע בין 6 דקות ל-40 דקות בתאים שונים, מה שנובע בעיקר מהפוליוביקוויטינציה שלו ומפירוק פרוטאזומלי10,12 לאחר מכן. עכבר כפול דקה 2 (Mdm2) הוא ליגאז יוביקוויטין E3 של p53 הנקשר ל-N-terminus של p53 כדי לעכב את פעילות השעתוק שלו12,14,15. Mdm2 מקדם את הפוליוביקוויטינציה והפירוק הפרוטיאזומלי של p53 כדי לשלוט ביציבותו וגורם למונוביקוויטינציה של p53 כדי להקל על ייצוא הגרעין שלה12,14,15,16. כאן, יוביקוויטינציה p53 בתיווך Mdm2 משמשת כדוגמה להצגת שיטה לטיהור חלבונים יוביקוויטין מתאי יונקים בפירוט. ניתן לזהות את הרגולטורים המשפיעים על מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה באמצעות בדיקת יוביקוויטינציה in vivo זו כאשר הם מתבטאים יתר על המידה או מופלים/נדפקים בתאי יונקים. בנוסף, חלבונים המכילים יוביקוויטין יכולים לשמש כמצעים לבדיקת דאוביקוויטינציה במבחנה. ניתן לבצע בדיקת תפוקה גבוהה כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבוני מטרה על ידי דגירה של מצעים ubiquitinated עם DUBs בודדים. חלבונים הנמצאים בכל מקום עשויים לשמש כפיגום לגיוס חלבוני איתות במורד הזרם בתאים. קומפלקס חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום יכול להיות מטוהר על ידי מיצוי חיסוני רציף בתנאי טיהור מקומיים ולזהות על ידי ספקטרומטריית מסה. ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי באופן נרחב כדי לחקור את החלבונים התאיים המווסתים על ידי יוביקוויטינציה.
מספר שיטות הוקמו כדי לטהר חלבונים ubiquitinated, הכוללות שימוש ביוביקוויטין המתויג על ידי זיקה, נוגדני יוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין, ותחומים מבודדים הקושרים יוביקוויטין (UBDs)17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המשתמש ביוביקוויטין המתויג כמתווך לטיהור חלבונים הנמצאים בתאים של יונקים. השימוש ביוביקוויטין המתויג של פולי-היס מציע יתרונות על פני השיטות האחרות. חלבונים הנמצאים בכל מקום מטוהרים בנוכחות דנטורנטים חזקים, מה שמפחית קשירה לא ספציפית לשרף טעון ניקל על ידי ליניאריזציה של חלבונים תאיים ושיבוש אינטראקציות חלבון-חלבון. לעומת זאת, השימוש בנוגדנים ליוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין ו-UBDs מבודדים כמתווכים אינו יכול להוציא ביעילות שותפים קושרים מחלבון המטרה מכיוון שיש לבצע טיהור בתנאים פחות מחמירים. יתר על כן, טיהור עשוי גם להוביל לקשירה מוגברת של חלבונים שאינם קשורים באמצעות מתווכים אלה. בנוסף, קיימת נטייה מחייבת לסוגי קישור שונים של יוביקוויטין, כמו גם מונו ופולי-יוביקוויטינציה על ידי חלבונים קושרי יוביקוויטין או UBDs17 מבודדים. השימוש באוביקוויטין המתויג על-ידי פולי-היס תורם להורדת כל החלבונים הנמצאים בכל התאים הנמצאים בכל מקום. לחלופין, השימוש באגרוז מצומד נגד פלאג או אנטי-HA זמין מסחרית ומקל על חיסונית חלבוני מטרה מתויגים של דגל או HA בקנה מידה גדול בתנאים שאינם מתויגים. שלב טיהור שני, לדוגמה, על ידי שרף טעון ניקל המכוון ליוביקוויטין מתויג פולי-היס, יכול לשמש לרכישת חלבוני מטרה ubiquitinated עם טוהר גבוה לניסויים במורד הזרם. יש לציין כי אסטרטגיית טיהור תיוג אפיטופים יכולה להיות מותאמת כאשר לא ניתן לרכוש נוגדן מסוים לחלבוני מטרה חיסוניים יעילים. לבסוף, טיהור של חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים, בהשוואה לטיהור במבחנה, שומר על מצב הקישור של יוביקוויטין של חלבוני מטרה בתנאים פיזיולוגיים יותר.

<table><tbody><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סנגון ביוטק</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>אמרשם ECL עכבר IgG, AB שלם מקושר HRP (מכבשים)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>אנטיבדוי משני</td></tr><tr><td>אמרשם ECL עכברוש IgG, AB שלם מקושר HRP (מחמור)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>אנטי-בדוי משני</td></tr><tr><td>אנטי-דגל M2 זיקה ג'ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 חרוזים</td></tr><tr><td>נוגדן חד-קולונלי אנטי-GFP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-9996</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>אנטי-HA זיקה גבוהה</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>נוגדן חד-קולונלי אנטי-Mdm2 (SMP14)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-965</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>אנטי-p53 נוגדן חד-קולונלי (DO-1)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-126</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>ממס</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG פפטיד</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>הכן מאגר פליטה</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>תוסף</td></tr><tr><td>Guanidine-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>ממס</td></tr><tr><td>H1299</td><td>בנק תאי גזע, האקדמיה הסינית ל Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>ממס</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 ריאגנטים</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection מגיב</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>מעכב פרוטאזום HY-13259</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>ממס</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>ממס</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>ממס</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>ממס</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Agarose QIAGEN</td><td>30230</td><td>שרף טעון ניקל</td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז ממברנה סופגת</td><td>GE בריאות</td><td>10600002</td><td>0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>טרנספקציה בינונית</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סנגון ביוטק</td><td>E607011-0100</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז אנטיביוטי</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>01-100-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>בינוני Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>ממס</td></tr><tr><td>SDS טעינת מאגר</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>תוסף</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>ממס</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>ממס</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>תוסף</td></tr> מערכת <tr><td>הדמיה כימילומינסנציה רגישה במיוחד</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS +</td></tr> <tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>ממס</td></tr></tbody></table>

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination הוא סוג של שינוי posttranslational המסדיר לא רק את היציבות אלא גם את לוקליזציה ותפקוד של חלבון המצע. תהליך ה-ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומווסת כמעט את כל התהליכים הביולוגיים הבסיסיים של התאים. טיהור של חלבונים ubiquitinated מסייע לחקור את התפקיד של ubiquitination בשליטה על תפקוד של חלבונים המצע. כאן, הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים מתואר עם חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים מחמירים של אי-דנטורינג ודנאטורציה. סה"כ חלבון p53 המתויג כ-Flag טוהר באמצעות אגרוז מצומד נגד נוגדנים של פלאג בתנאים של אי-דנטורציה. לחלופין, סך כל החלבון התאי המתויג כיוביקוויטין טוהר באמצעות שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום באלואטים זוהו בהצלחה עם נוגדנים ספציפיים. באמצעות הליך זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, ובכך להקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון.

הדיאגרמה הסכמטית מציגה את חלבוני האוביקוויטין המתויגים בדגל (HH-Ub) (איור 1A). ההליכים המשמשים לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מסוכמים באיור 1B. ניתן לקשור יוביקוויטין מתויג של Poly-His לחלבונים ממוקדים בתאי יונקים. חלבונים הנמצאים בכל מקום יכולים להיות מטוהרים באמצעות חרוזי Flag/M2 בתנאים של אי-דנטורציה או על-ידי כרומטוגרפיה של זיקת יוני מתכת משותקים (IMAC) בתנאי דנטורציה (איור 1B). סך כל חלבון p53, כולל p53 ubiquitinated, היה חיסו...

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, מה שמקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון. טיהור של חלבונים הנמצאים בכל מקום בתאי יונקים בהשוואה לטיהור במבחנה שומר על מצב קישור האוביקוויטין של חלבוני המטרה במצב רדיולוגי יותר. התחל על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של בינוני סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר.הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל שפופרת והוסיפו 0.2 מיקרוגרם של פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לנטר את יעילות הטרנספקציה. הוסף 78 מיקרוליטרים של ריאגנט טרנספקציה של ליפוזום ל-4.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל את הליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ולאחר מכן מאפשרים לו לעמוד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת ליפוזום מדולל לתוך כל צינור המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת DNA מדולל. מערבבים היטב ומקשרים את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו תשעה מיליליטר של מדיום הסרום המופחת לכל מנה.מוסיפים שלושה מיליליטר מתערובת הדנ"א הליפוזום ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת הלוך ושוב שלוש פעמים ואז שמאלה וימינה שלוש פעמים לפיזור שווה של התערובת על הצלחת. תרבית את התאים באינקובטור

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים...

זיהוי של חלבון Ubiquitination

סרטון זה מתאר שיטה לחלץ ולטהר פפטידים יוביקוויטיניל המכילים שאריות פפטידים די-גליצין מתערובת פפטידים מורכבת. השיטה המוצגת עשויה לסייע בזיהוי אתרי יוביקוויטינציה מקוריים בחלבון.

מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאוביקוויטין של Streptococcus pneumoniae באמצעות ליזאט תאי יונקים או קומפלקס אנזימי יוביקוויטין טהור, ולאחר מכן טיפול בקומפלקס חלבון VCP/p97-UFD1-NPLOC4 מטוהר להערכת פעילותו הבקטריוליטית, ומאפשר חקר אפקטורים חיסוניים התלויים ביוביקוויטין.

In-vitro שיקום של יוביקוויטינציה חיידקית וחיסול בתיווך VCP/p97

למדו שיטה לטיהור חלבוני p53 מיובקווינטים מתאי יונקים תוך שימור מצב הקישור של האוביקוויטין. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקידי היובקווינציה בויסות פעילות חלבונים בביוכימיה תאית.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים