Name: כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: למד להפריד שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים באמצעות כרומטוגרפיית אי הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני תקשורת בין-תאית ולאפיין את תכולת הווזיקולות ביעילות ובאמינות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפן סטייט בהרנד ולקרן הבריאות Hamot על המימון, כמו גם למתקן המיקרוסקופיה של פן סטייט ביוניברסיטי פארק, פנסילבניה.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

SEC היא שיטה ידידותית למשתמש להפרדה נאותה של כלי רכב חשמליים מ-CCM מותנה. על מנת לבודד באופן ספציפי רכבים חשמליים שמקורם בתאים, יש לקחת בחשבון שיקול דעת זהיר של סוג CCM ותוספי התזונה שלו. מדיות רבות של תרביות תאים צריכות להיות משלימות FBS, המכילות כלי רכב חשמליים שמקורם בחיה שבה נקטף הסרום. כלי רכב חשמליים אלה בסרום עשויים להרוות ולהסוות כל אות המיוצר על ידי כלי רכב חשמליים שמקורם בתאים בתרבית26. לכן, בעת ביצוע ניסויים, יש להשתמש ב- FBS מדולדל EV במידת האפשר כדי להבטיח שניתן לייחס את כלי הרכב החשמ...

התפוצצות העניין בחקר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) לוותה בהתקדמות משמעותית בטכנולוגיות ובטכניקות המשמשות להפרדה ולמחקר של חלקיקים הטרוגניים בגודל ננומטרי. בזמן שחלף מאז גילוים לפני כמעט ארבעה עשורים1,2, נמצא כי מבנים ממברניים קטנים אלה מכילים שומנים ביו-אקטיביים, חומצות גרעין וחלבונים, וממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין-תאית 3,4. כלי רכב חשמליים משתחררים מכל סוגי התאים ולכן נמצאים בכל הנוזלים הביולוגיים, כולל פלסמה וסרום, רוק ושתן. כלי רכב חשמליים בתוך נוזלים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה לשמש כסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות שונות, כולל מחלות נוירו-דלקתיות ומחלות נוירודגנרטיביות, סרטן והפרעות אוטואימוניות 5,6,7. יתר על כן, ניתן לבצע מחקרים מכניסטיים במבחנה באמצעות טכניקות של תרביות תאים על ידי הפרדת כלי רכב חשמליים המשתחררים למדיום התרבית 3,8,9.
כדי להבין את תפקידם של כלי רכב חשמליים בפתופיזיולוגיה של מחלות, הפרדה נאותה מהנוזל שבו הם נמצאים היא בעלת חשיבות עליונה. תקן הזהב להפרדת EV הוא זה מכבר אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית (dUC)10, אולם נוצרו טכניקות מתוחכמות יותר להשגת הפרדה טובה יותר של כלי רכב חשמליים מרכיבים חוץ-תאיים אחרים. חלק מטכניקות אלה כוללות מעברי צבע של צפיפות, שבר זרימת שדה אסימטרי-זרימה (A4F), ציטומטריה של זרימה, אימונוקסטור, משקעי פוליאתילן גליקול וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)11,12,13. לכל טכניקה יש קבוצה משלה של יתרונות וחסרונות; עם זאת, הוכח כי SEC בפרט מפריד בין כלי רכב חשמליים לבין נוזלים ביולוגיים ותרבי-על של תרביות תאים בצורה יעילה למדי 8,14,15. ל-SEC יש גם את הבונוס הנוסף של היותה פשוטה יחסית וידידותית למשתמש.
SEC היא שיטה המפרידה בין רכיבים של נוזל בהתבסס על גודל. עם טכניקה זו, עמודה של שרף (או עשה בתוך הבית או נרכש מסחרית) משמש כדי לחלק מדגם. חלקיקים קטנים בדגימה נלכדים בין החרוזים בתוך השרף, בעוד שחלקיקים גדולים יותר מסוגלים לעבור דרך השרף בחופשיות רבה יותר, וכך לחמוק מוקדם יותר בתהליך. מאחר שרכבים חשמליים גדולים יותר בגודלם מחלבונים חוץ-תאיים רבים ומאגרגטים של חלבונים, כלי רכב חשמליים עוברים דרך העמודה מהר יותר ומתחמקים בשברים מוקדמים יותר מאשר חלבונים חוץ-תאיים14.
במאמר שיטות זה, מתואר השימוש ב-SEC להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים (CCM) מאוליגודנדרוציטים אנושיים תחת בקרה ותנאי עקה אנדופלסמיים של הרשתית (ER). באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי כלי רכב חשמליים המופרדים בטכניקה זו נמצאים בתוך שברים ספציפיים שניתן לאגד יחד ולרכז לאפיון במורד הזרם, וכי כלי הרכב החשמליים המופרדים מופקים מתאים ולא ממקור אקסוגני כגון סרום בקר עוברי (FBS) המשמש להשלמת CCM. נוכחותם של סמני EV קנוניים, CD63, CD81 ו- CD916,17,18,19 בשברים EV, והיעדרם בשברי החלבון מודגמת בכתם מערבי. באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM), כלי רכב חשמליים מוצגים באופן חזותי ומציגים את המורפולוגיה הצפויה ונצפים רק בחלק EV. חלקיקים נספרים גם בשברי EV וחלבון של תנאי בקרה ו-ER, ומספר רב של חלקיקים בטווח הגודל הצפוי של 50-200 ננומטר בקוטר נצפו בדגימות EV. יחד, נתונים אלה תומכים ברעיון ש-SEC היא שיטה יעילה ואפקטיבית להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli מאגר מדגם</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי, Ultracel, 3 KDa, 15 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>UFC900308</td><td>3 kDa חיתוך</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם ממברנת Ultracel-3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td> אמוניום <td>חיתוך 3 kDa</td></tr><tr><td> Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG, HRP מקושר נוגדנים</td> טכנולוגיית <td>איתות תאי</td><td>7074V</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן נגד קלנקסין</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-CD9 עכבר נוגדן חד-שבטי</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-GM130 נוגדן [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG, נוגדן מקושר HRP</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>7076V</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>אספן שברים אוטומטי</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת BCA מצלמת</td><td>CCD Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan</td><td>Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 עכבר אנטי אנושי</td><td>BD</td><td>556019</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>CD81 נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-23962</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>Cellstar מסנן כובע צלוחיות תרבית תאים</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>סיגמא</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין; ללא נתרן</td><td>Cytiva</td><td>SH300022. FS</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי בדרגה פרימיום</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מדולדל אקסוזום</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>ערך רב חלב יבש ללא שומן</td><td>אמזון</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG קו תאי אוליגודנדרוגליומה אנושי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science USA Ltd qev גודל אי הכללה עמודות 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול >99.8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN לוחות זכוכית</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>עם מרווחים של 0.75 מ"מ</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN לוחות קצרים</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין, תמיסה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4458-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מי מלח PBS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>ערכות בדיקת חלבון BCA פירס BCA וריאגנטים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>פירס PVDF ממברנות העברת</td><td>תרמו</td><td>מדעי 88518</td><td></td></tr><tr><td>פירס ווסטרן ספיגה מסנן נייר</td><td>תרמו Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן-20 (TWEEN 20), 500 מ"ל</td><td>ביו בייסיק</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז/פוספטאז (100X)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן רקומביננטי נגד TSG101 [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>סלודיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>פישר מדעי</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט,&ge; 99.0% (GC), כדורים ללא אבק</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX ערכת אקרילאמיד FastCast ללא כתמים, 10%</td> <td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>שידור FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 0.25% פרוטאז עם טריפסין חזיר, HBSS, EDTA; ללא סידן, מגנזיום</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta View תוכנה</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA</td></tr></tbody></table> תוכנה

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים הקשורים לממברנות ליפידים בגודל ננומטרי המשתחררים מכל התאים, נמצאים בכל הביופלואידים ומכילים חלבונים, חומצות גרעין ושומנים המשקפים את תא האב שממנו הם נגזרים. הפרדה נכונה של כלי רכב חשמליים מרכיבים אחרים במדגם מאפשרת אפיון של המטען הקשור אליהם ומעניקה תובנה לגבי הפוטנציאל שלהם כמתקשרים בין-תאיים וסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות רבות. במחקר הנוכחי, כלי רכב חשמליים שמקורם באוליגודנדרוציטים בודדו ממדיית תרביות תאים באמצעות שילוב של טכניקות חדישות, כולל אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל (SEC) כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים לבין חלבונים חוץ-תאיים אחרים וקומפלקסים של חלבונים. באמצעות עמודי SEC הזמינים מסחרית, הופרדו כלי רכב חשמליים מחלבונים חוץ-תאיים ששוחררו מתאי אוליגודנדרוגליומה אנושיים בתנאי בקרה ותנאי עקה אנדופלסמית רשתית (ER). סמני EV קנוניים CD9, CD63 ו- CD81 נצפו בשברים 1-4, אך לא בשברים 5-8. GM130, חלבון של מנגנון גולג'י, וקלקסין, חלבון אינטגרלי של ER, שימשו כסמני EV שליליים, ולא נצפו בשום שבר. יתר על כן, בעת איגום וריכוז שברים 1-4 כשבר EV, ושברים 5-8 כשבר החלבון, נצפה ביטוי של CD63, CD81 ו- CD9 בשבר EV. הביטוי של GM130 או calnexin לא נצפה באף אחד מסוגי השברים. השברים המאוגדים הן מתנאי הבקרה והן מתנאי ה-ER הודגמו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה ושלפוחיות נצפו בשברים EV, אך לא בשברים החלבונים. חלקיקים ב-EV ושברי חלבונים משני התנאים כומתו גם הם באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. יחד, נתונים אלה מראים כי SEC היא שיטה יעילה להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה מותנית של תרביות תאים.

כתם מערבי חושף הפרדה נאותה של כלי רכב חשמליים מ-CCM כדי להעריך את היעילות של ה-SEC להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים, הופעל כתם מערבי תוך שימוש בכל שבר בודד מדגימות הבקרה כדי לבחון את הביטוי של שלושת סמני ה-EV הקנוניים, CD9, CD63 ו-CD81, כמו גם GM130 ו-calnexin18, ששימשו כבקרות שליליות (איור 3). ביטוי אלבומין18 נבדק גם כדי להבטיח שניתן יהיה להפריד כראוי חלבונים חוץ-תאיים ב-CCM מרכבים חשמליים. ביטוי חזק של CD9, CD63...

הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

הפרדה של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים, כמו מדיה של תרבית תאים, יכולה לאפשר לחוקרים לאפיין את המטען הווסטיקולרי ולחקור את מנגנוני התקשורת התוך-תאיים שלהם. טכניקה זו מאפשרת הפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים וחלבונים חוץ-תאיים ממדיה מותנית של תרביות תאים, פשוטה וידידותית למשתמש. כדי להתחיל למקם PBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.שימו לב לביקורת ולצלוחיות תרבית תאים שטופלו בטוניקמיצין תחת מיקרוסקופ מורכב עם עדשה אובייקטיבית של 10 x ו-100 x. רשום לעצמך את כל ההבדלים בין הצלוחיות. הסר את המדיום מן הבקבוקון ומניחים אותו בצינור 50 מיליליטר.לאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את סופר natant לצינור חדש. צנטריפוגה את הצינור ב 2000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-super natant לצינור חדש ומניחים את הצינור על קרח.קח ארבעה 15 מיליליטר שלוש יחידות סינון אולטרה קילודלטון לחתוך ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS לכל צינור. ראש המסננים על ידי צנטריפוגה של היחידות ב 4, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת PBS מהיחידות, חלקו את הסופר-נאטנט מהבקרה ומהתנאים המטופלים לשתי יחידות סינון אולטרה שכל אחת מהן מכילה כ-12.5 מיליליטר מדיה בכל אחת מהן.צנטריפוגה את הצינורות ב 4, 000 G במשך שעה אחת 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס או עד מדיה מרוכזת או retentate בכל יחידה מרוכז ל 250 microliters או פחות. העבר את ה- retentate משתי יחידות הבקרה לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן של 1.5 מיליליטר ומיחידות מטופלות לצינור אחר. מדוד את הנפח הכולל של retentate בכל צינור צנטריפוגה מיקרו.אם הנפח קטן מ-500 מיקרוליטרים, הוסיפו PBS מסונן של 0.22 מיקרון עד שהנפח הסופי יהיה 500 מיקרוליטרים. מניחים את הצינורות במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הפעל את אספן השברים האוטומטי או את ה- AFC.מוציאים את העמוד מארבע מעלות צלזיוס ומאפשרים לעמוד להתחמם לטמפרטורת החדר. הסר דגימות retentate מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והנח אותן על קרח כדי להפשיר, בזמן ההמתנה, להגדיר שמונה צינורות מסומנים 1.5 מיליליטר בקרוסלת AFC עם מכסים הפונים פנימה. הכנס את העמודה ל- AFC כאשר הברקוד פונה לקורא והתאם את ההגדרות כדי לאסוף שמונה שברים של 500 מיקרוליטר כל אחד ונפח מאגר לברירת המחדל.לאחר מכן אמת את ההוראות שעל המסך כדי להתחיל את האיסוף. לאחר מאגר האחסון נספג לחלוטין בחלק העליון של מטריצת העמודות. התחל לשטוף את העמודה על-ידי הוספת 15 מיליליטר של PBS לעמודה.אין להוסיף PBS מוקדם מדי מכיוון שהוא ידלל את מאגר האחסון וימנע שטיפה מספקת. רגע לפני שכל 15 מיליליטר של PBS נספגים על ידי המטריצה לחץ בסדר כדי לעצור את השטיפה ולהסיר כל PBS שיורי מראש מטריצת העמודה עם מיקרו פיפטה. אל תיגע במטריצה.הוסף 500 מיקרוליטרים של דגימה למרכז העמודה ולחץ על אישור כדי להתחיל את הריצה. לאחר המדגם נספג במלואו לתוך המטריצה מיד להוסיף שמונה מיליליטר של PBS לעמודה. AFC מפזר באופן אוטומטי את נפח הריק למרכז הקרוסלה לפני שהוא אוסף את כל שמונת השברים של 500 מיקרוליטר כל אחד.לאחר הריצה, להסיר שברים מן הקרוסלה ומניחים אותם על קרח. לאחר מכן הסר את נפח הריק ממרכז הקרוסלה. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של PBS לעמודה כדי לשטוף כל דגימה שיורית מהעמודה.וברגע שהדגימה שחזרה בתשובה נשטפת במלואה הוסיפו 15 מיליליטר של PBS לעמודה. כאשר PBS הסופי נספג על ידי המטריצה להוסיף 500 microliters של 0.5 נתרן הידרוקסיד טוחן למרכז המטריצה של העמודה. לאחר מכן, כאשר נתרן הידרוקסידי נספג, להוסיף 30 מיליליטר של PBS לעמודה ולתת לו לשטוף דרך.לאחר סיום עם כל הדגימות לשמר את העמודה לשימוש מאוחר יותר על ידי הוספת 15 מיליליטר של 0.05% נתרן אזיד לעמודה. השאירו כחמישה מיליליטר של נתרן אזיד בחלק העליון של מטריצת העמודה. הסר את העמודה מה- AFC וחבר את המכסה העליונה והתחתונה לפני הצבת העמודה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון.בנה את יחידת הסינון האולטרה. השג שני מיליליטר, שלוש יחידות סינון אולטרה חיתוך קילודלטון לכל דגימה. כל יחידה מורכבת משלושה חלקים, חרוט, מסנן וזרימה דרך הצילינדר.תייג כל חלק כראוי. הוסיפו מיליליטר PBS אחד לחלק המסנן וכסו עם חתיכת החרוט. צנטריפוגה יחידת אולטרה-סינון צד צד כלפי מעלה ב 3, 500 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את PBS מסונן מן הזרימה דרך הגליל.הפוך את יחידת האולטרה-סינון במהופך וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1000 G בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל ה-PBS שנותר. שלב ארבעה 500 מיקרוליטר של כל שבר והוסף אותם ליחידת סינון אולטרה. ואז עמודי צנטריפוגה חופפים במשך שעה אחת, 45 דקות ב 3, 500 G בארבע מעלות צלזיוס או עד שרמת retentate הוא 100 microliters.הסר את הזרימה דרך הצילינדר והשלך את הזרימה דרכה. הפוך את יחידת הסינון האולטרה הפוך וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב- 1000 XG בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-retentate בקונוס לצינור של 1.5 מיליליטר והופכים את נפח הדגימה ל-150 מיקרוליטר עם PBS מסונן של 0.22 מיקרון לפני שמניחים את הצינורות במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.גוש מערבי מייצג של שברים בודדים הראה ביטוי חזק של CD9, CD63 ו- CD81. עבירות אחת עד ארבע עם מעט או ללא ביטוי עבירות חמש עד שמונה. לא נצפה ביטוי של GM130 או קלנקסין בשום שבר.אלבומין היה נוכח רק בשברים שש עד שמונה. כמו כן הוערכה היעילות של ריכוז שברי EV וחלבונים. ביטוי של CD9 ו- CD63 נצפה בתאים lysates.כל שלושת חלבוני ה-CD היו נוכחים בשברי בקרה של EV ובדגימות שטופלו בטוניקמיצין, אך לא בשברי החלבון. גן הרגישות לגידול 101 היה קיים בליסאטים של תאים, אך לא בשברים של EV או חלבונים. GM130 וקלנקסין נצפו רק בליסאטות התא.בכתם המערבי של מדיית תרביות התאים המדולדלת של אקסוזומים, סמני EV היו נוכחים בליזאטים של התא אך לא בדגימות התקשורת. ביטוי אלבומין נצפה בשברי החלבון וביטוי מינימלי בליסאטות התא. תצפיות TEM הדגימו מבנים כדוריים בשברי הבקרה של EV ובדגימות שטופלו בטוניקמיצין.מבנים אלה לא נצפו באף אחד משברי החלבון מסוג הדגימה. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים חושף הבדלים בריכוזי החלקיקים של הבקרה ובשברים המטופלים בשברי EV בהשוואה לבקרה, מעט יותר חלקיקים היו נוכחים בטיפול בטוניקמיצין. עם זאת, בשברי החלבון התגלו פחות חלקיקים ביחס לרכבים חשמליים.חשוב שיהיה נפח דגימה זהה עבור מצבי הבקרה והטיפול, מה שמאפשר השוואה קלה של כלי רכב חשמליים מהטיפולים השונים. לאחר הפרדת כלי רכב חשמליים ממצע תרבית התאים אנו יכולים לאפיין את תכולת החלבון, הרנ"א והשומנים של הבועיות באמצעות ריצוף RNA פרוטאומיקה וליפידומיקה.

size-exclusion-chromatography-for-separating-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: ווטסון, די.סי., ואחרים. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם חרוזי שרף נקבוביים כדי לבודד שלפוחיות חיידקים חוץ-תאיות (EVs) מתסנין תרבית חיידקים. EVs גדולים יותר נפלטים מוקדם על ידי עקיפת נקבוביות השרף, בעוד שחלבונים קטנים יותר נכנסים לנקבוביות ונפלטים מאוחר יותר.

בידוד שלפוחיות חיידקיות חוץ-תאיות באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל 

סרטון זה מתאר שיטה המבוססת על כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות או כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מערכת החיסון במוח – תאי המיקרוגליה. כלי הרכב החשמליים פועלים כמטען מולקולרי כדי לספק מתווכים, המווסתים תגובה חיסונית. לכן, כלי הרכב החשמליים המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה לחקר הדיבור בין תאי עצב למיקרוגליה במהלך תגובה חיסונית עצבית.

בידוד מבוסס SEC של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן במיקרוגליה: טכניקה לבידוד בועיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית מותנית במיקרוגליה

סרטון זה מדגים את שיטת הטיהור מבוססת צפיפות גרדיאנט אולטרה-צנטריפוגה לבידוד תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות המתאימות למחקרי אפיון.

טיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות: טכניקה לטיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה – כרומטוגרפיית אי הכללת גודל – להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות קרום חיצוני או OMV שמקורו בחיידקים. שלפוחיות אלה הן מבנים כדוריים בגודל ננומטרי ומופרדות לתת-אוכלוסיות גדולות וקטנות בהתבסס על גודלן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

אי הכללת גודל הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה של שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות: טכניקה להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של בועיות קרום חיצוני של חיידקים גראם-שליליים בהתבסס על גודלן

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (EVs) מסנין התרבית של Mycobacterium tuberculosis (Mtb). הטכניקה משתמשת בעמוד שרף נקבובי כדי להשיג שברים מטוהרים של כלי רכב חשמליים. החלקיקים הנקבוביים מאפשרים באופן סלקטיבי לחלבונים קטנים יותר להיכנס לנקבוביות, וכתוצאה מכך ההדבקה איטית יותר. במקביל, כלי רכב חשמליים אינם נכנסים לנקבוביות בשל גודלם הגדול יותר והם מדוללים ראשונים.

טכניקת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis...

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

שלל חיידקים ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה ויש להם יישומים ביוטכנולוגיה מבטיחים. ההטרוגניות של שלטי של שלל מסבכת ניתוח ושימוש; לכן, יש צורך בשיטה פשוטה לשחזור כדי להפריד בין גדלים שונים של שלשלות. כאן, אנו מדגימים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להפריד שלפוחיות הטרוגניות המיוצרות על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל לניתוח הטרוגניות ארסית קרום החיצוני של חיידקים

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של מיון שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המשתחררות על ידי תאי סטרומה מזנכימליים. בפרט, הוא מתמקד בהגדרת המכשיר ובאופטימיזציה של תנאי המיון. המטרה היא למיין שלפוחיות חוץ-תאיות תוך שמירה על המאפיינים שלהן.

הגדרת מיון מוצלח לבידוד שלפוחית חוץ-תאית

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למד להפריד שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים באמצעות כרומטוגרפיית אי הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני תקשורת בין-תאית ולאפיין את תכולת הווזיקולות ביעילות ובאמינות גבוהה.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

גלה סרטונים נוספים