כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

הפרדה של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים, כמו מדיה של תרבית תאים, יכולה לאפשר לחוקרים לאפיין את המטען הווסטיקולרי ולחקור את מנגנוני התקשורת התוך-תאיים שלהם. טכניקה זו מאפשרת הפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים וחלבונים חוץ-תאיים ממדיה מותנית של תרביות תאים, פשוטה וידידותית למשתמש. כדי להתחיל למקם PBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

שימו לב לביקורת ולצלוחיות תרבית תאים שטופלו בטוניקמיצין תחת מיקרוסקופ מורכב עם עדשה אובייקטיבית של 10 x ו-100 x. רשום לעצמך את כל ההבדלים בין הצלוחיות. הסר את המדיום מן הבקבוקון ומניחים אותו בצינור 50 מיליליטר.

לאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את סופר natant לצינור חדש. צנטריפוגה את הצינור ב 2000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-super natant לצינור חדש ומניחים את הצינור על קרח.

קח ארבעה 15 מיליליטר שלוש יחידות סינון אולטרה קילודלטון לחתוך ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS לכל צינור. ראש המסננים על ידי צנטריפוגה של היחידות ב 4, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת PBS מהיחידות, חלקו את הסופר-נאטנט מהבקרה ומהתנאים המטופלים לשתי יחידות סינון אולטרה שכל אחת מהן מכילה כ-12.5 מיליליטר מדיה בכל אחת מהן.

צנטריפוגה את הצינורות ב 4, 000 G במשך שעה אחת 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס או עד מדיה מרוכזת או retentate בכל יחידה מרוכז ל 250 microliters או פחות. העבר את ה- retentate משתי יחידות הבקרה לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן של 1.5 מיליליטר ומיחידות מטופלות לצינור אחר. מדוד את הנפח הכולל של retentate בכל צינור צנטריפוגה מיקרו.

אם הנפח קטן מ-500 מיקרוליטרים, הוסיפו PBS מסונן של 0.22 מיקרון עד שהנפח הסופי יהיה 500 מיקרוליטרים. מניחים את הצינורות במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הפעל את אספן השברים האוטומטי או את ה- AFC.

מוציאים את העמוד מארבע מעלות צלזיוס ומאפשרים לעמוד להתחמם לטמפרטורת החדר. הסר דגימות retentate מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והנח אותן על קרח כדי להפשיר, בזמן ההמתנה, להגדיר שמונה צינורות מסומנים 1.5 מיליליטר בקרוסלת AFC עם מכסים הפונים פנימה. הכנס את העמודה ל- AFC כאשר הברקוד פונה לקורא והתאם את ההגדרות כדי לאסוף שמונה שברים של 500 מיקרוליטר כל אחד ונפח מאגר לברירת המחדל.

לאחר מכן אמת את ההוראות שעל המסך כדי להתחיל את האיסוף. לאחר מאגר האחסון נספג לחלוטין בחלק העליון של מטריצת העמודות. התחל לשטוף את העמודה על-ידי הוספת 15 מיליליטר של PBS לעמודה.

אין להוסיף PBS מוקדם מדי מכיוון שהוא ידלל את מאגר האחסון וימנע שטיפה מספקת. רגע לפני שכל 15 מיליליטר של PBS נספגים על ידי המטריצה לחץ בסדר כדי לעצור את השטיפה ולהסיר כל PBS שיורי מראש מטריצת העמודה עם מיקרו פיפטה. אל תיגע במטריצה.

הוסף 500 מיקרוליטרים של דגימה למרכז העמודה ולחץ על אישור כדי להתחיל את הריצה. לאחר המדגם נספג במלואו לתוך המטריצה מיד להוסיף שמונה מיליליטר של PBS לעמודה. AFC מפזר באופן אוטומטי את נפח הריק למרכז הקרוסלה לפני שהוא אוסף את כל שמונת השברים של 500 מיקרוליטר כל אחד.

לאחר הריצה, להסיר שברים מן הקרוסלה ומניחים אותם על קרח. לאחר מכן הסר את נפח הריק ממרכז הקרוסלה. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של PBS לעמודה כדי לשטוף כל דגימה שיורית מהעמודה.

וברגע שהדגימה שחזרה בתשובה נשטפת במלואה הוסיפו 15 מיליליטר של PBS לעמודה. כאשר PBS הסופי נספג על ידי המטריצה להוסיף 500 microliters של 0.5 נתרן הידרוקסיד טוחן למרכז המטריצה של העמודה. לאחר מכן, כאשר נתרן הידרוקסידי נספג, להוסיף 30 מיליליטר של PBS לעמודה ולתת לו לשטוף דרך.

לאחר סיום עם כל הדגימות לשמר את העמודה לשימוש מאוחר יותר על ידי הוספת 15 מיליליטר של 0.05% נתרן אזיד לעמודה. השאירו כחמישה מיליליטר של נתרן אזיד בחלק העליון של מטריצת העמודה. הסר את העמודה מה- AFC וחבר את המכסה העליונה והתחתונה לפני הצבת העמודה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון.

בנה את יחידת הסינון האולטרה. השג שני מיליליטר, שלוש יחידות סינון אולטרה חיתוך קילודלטון לכל דגימה. כל יחידה מורכבת משלושה חלקים, חרוט, מסנן וזרימה דרך הצילינדר.

תייג כל חלק כראוי. הוסיפו מיליליטר PBS אחד לחלק המסנן וכסו עם חתיכת החרוט. צנטריפוגה יחידת אולטרה-סינון צד צד כלפי מעלה ב 3, 500 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את PBS מסונן מן הזרימה דרך הגליל.

הפוך את יחידת האולטרה-סינון במהופך וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1000 G בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל ה-PBS שנותר. שלב ארבעה 500 מיקרוליטר של כל שבר והוסף אותם ליחידת סינון אולטרה. ואז עמודי צנטריפוגה חופפים במשך שעה אחת, 45 דקות ב 3, 500 G בארבע מעלות צלזיוס או עד שרמת retentate הוא 100 microliters.

הסר את הזרימה דרך הצילינדר והשלך את הזרימה דרכה. הפוך את יחידת הסינון האולטרה הפוך וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב- 1000 XG בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-retentate בקונוס לצינור של 1.5 מיליליטר והופכים את נפח הדגימה ל-150 מיקרוליטר עם PBS מסונן של 0.22 מיקרון לפני שמניחים את הצינורות במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

גוש מערבי מייצג של שברים בודדים הראה ביטוי חזק של CD9, CD63 ו- CD81. עבירות אחת עד ארבע עם מעט או ללא ביטוי עבירות חמש עד שמונה. לא נצפה ביטוי של GM130 או קלנקסין בשום שבר.

אלבומין היה נוכח רק בשברים שש עד שמונה. כמו כן הוערכה היעילות של ריכוז שברי EV וחלבונים. ביטוי של CD9 ו- CD63 נצפה בתאים lysates.

כל שלושת חלבוני ה-CD היו נוכחים בשברי בקרה של EV ובדגימות שטופלו בטוניקמיצין, אך לא בשברי החלבון. גן הרגישות לגידול 101 היה קיים בליסאטים של תאים, אך לא בשברים של EV או חלבונים. GM130 וקלנקסין נצפו רק בליסאטות התא.

בכתם המערבי של מדיית תרביות התאים המדולדלת של אקסוזומים, סמני EV היו נוכחים בליזאטים של התא אך לא בדגימות התקשורת. ביטוי אלבומין נצפה בשברי החלבון וביטוי מינימלי בליסאטות התא. תצפיות TEM הדגימו מבנים כדוריים בשברי הבקרה של EV ובדגימות שטופלו בטוניקמיצין.

מבנים אלה לא נצפו באף אחד משברי החלבון מסוג הדגימה. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים חושף הבדלים בריכוזי החלקיקים של הבקרה ובשברים המטופלים בשברי EV בהשוואה לבקרה, מעט יותר חלקיקים היו נוכחים בטיפול בטוניקמיצין. עם זאת, בשברי החלבון התגלו פחות חלקיקים ביחס לרכבים חשמליים.

חשוב שיהיה נפח דגימה זהה עבור מצבי הבקרה והטיפול, מה שמאפשר השוואה קלה של כלי רכב חשמליים מהטיפולים השונים. לאחר הפרדת כלי רכב חשמליים ממצע תרבית התאים אנו יכולים לאפיין את תכולת החלבון, הרנ"א והשומנים של הבועיות באמצעות ריצוף RNA פרוטאומיקה וליפידומיקה.