בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק

תאי גזע מזנכימליים שמקורם ב-Infrapatellar Pad, או בקיצור, IFP-MSCs, הוא סוג תאי גזע יחסית פחות נחקר. פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור המדגימה את הבידוד של IFP-MSCs ממפרק מחניק עזים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי מספר גדול של IFP-MSCs באיכות גבוהה ניתן להשיג.

IFP-MSCs מבודדים יכולים להתבדל לשושלות מרובות ולהיות בעלי פוטנציאל התחדשות נרחב. בשל מיקומם האנטומי, IFP-MSCs צברו עניין בתיקון פגמים בסחוס ובהקלה על התדרדרות הסחוס בדלקת מפרקים ניוונית. לשיטה השלכות על טיפול מבוסס תאים בתחום הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.

הליך הבידוד, ההרחבה וההבחנה של IFP-MSCs יודגם על ידי ד"ר סוגטה הזארה ומר אמן מחאג'אן. כדי להתחיל את הבידוד של תאי גזע מזנכימליים של שומן אינפרא-כוכבי, או IFP-MSCs, לאסוף מפרקים פמורוטיביאליים עזים המקיפים כ -15 ס"מ של אזורי הירך והטיביאליות של הגפיים האחוריות בתיבת דגימת איסוף מעוקרת. אחסנו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס להובלה למעבדה להמשך עיבוד.

הניחו את הדגימה על צלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ והקפידו לעבד את הדגימה באופן אספטי וארון בטיחות ביולוגי לאורך כל ההליך. שטפו אותו ביסודיות עם PBS אוטומטי בתוספת אנטיביוטיקה. שמור על הדגימה hydrated באמצעות PBS.

בחן היטב את האזורים האנטומיים של הדגימה. לגישה נוחה, הסירו את הרקמות הנוספות משתי העצמות הארוכות לחלוטין על ידי החזקת המשטח הסופי של עצם הירך ביד אחת וחיתוך אורכי לכיוון המפרק באמצעות מספריים חדים. לאחר מכן, מבלי להפריע לרקמה המקיפה את קפסולת המפרק, הסר את השרירים ואת רקמת השומן מהעצם.

באופן דומה, לבצע חתך נוסף בקצה הטיביאלי של הדגימה ולהסיר את השרירים ורקמת השומן מהעצם הטיביאלית. ודא כי שתי העצמות הארוכות חשופות לחלוטין וכי הקפסולה המשותפת גלויה. לאחר מכן, בצע חתך משני צדי הממברנה הסינוביאלית כדי לחתוך את המפרק המפרק.

חותכים את הפטלה מהקרום הסינוביאלי והרצועות הפטאליות באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקרים טריים. מיד מניחים את הפטלה המופרדת בצלחת פטרי המכילה PBS. מהפטלה המופרדת, הסר את כל כרית השומן הקיימת על המשטח הפנימי באמצעות מספריים ומלקחיים.

אוספים אותו בצלחת פטרי טרייה אחרת, וטוחנים אותו באמצעות אזמל. כלול כלי ניתוח אחרים כדי להשיג את קטעי השומן הקטנים של כשניים עד שלושה מילימטרים. השתמשו במרית כדי להעביר את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ושטפו אותה שלוש פעמים עם PBS בתוספת אנטיביוטיקה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מבחנה.

לעיכול אנזימטי, יש לדגור על כחמישה גרם של הרקמה הטחונה ב-Modified Eagle Media של Dulbecco, או DMEM, מדיה דלת גלוקוז המכילה 1.5 מיליגרם למיליליטר של קולגן מסוג II ו-2% FBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. שאפו בזהירות את הרקמה המעוכלת וסננו אותה דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי להסיר כל חלק לא מעוכל. צנטריפוגה את התסנין בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ב 150 פעמים גרם במשך חמש דקות.

יש להסיר את הסופר-נטנט לפני שטיפת כדור התא עם DMEM דל גלוקוז פעמיים. השעה מחדש את הכדור ב- DMEM שלם, הידוע גם בשם מדיית הרחבה. זרעו את התאים על צלחת פטרי בקוטר 150 מילימטר ותרבבו אותם במדיית ההרחבה בתוספת חמישה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי, או BFGF, ו-50 מיקרוגרם למיליליטר 2-Phospho-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום.

דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתרבות. עקוב אחר ההתקשרות והצמיחה של התאים מדי יום. לתחזוקה נאותה והרחבה של IFP-MSCs, שנה את המדיה כל שלושה ימים.

תוך כדי שינוי המדיה, הוסיפו חמישה ננוגרם טריים למיליליטר BFGF ו-50 מיקרוגרם למילימטר של מלח טריסודיום חומצה 2-פוספו-L-אסקורבית ישירות לצלחת פטרי. ברגע שהתאים הופכים ל-80% עד 90% קונפלואנטים, תת-תרבות אותם על ידי הסרת מדיית ההתפשטות מצלחת הפטרי ושטיפת התאים עם 1X PBS. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לצלחת ודוגרים את התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.

לאחר ארבע דקות, הקש על הצלחת שעל צדה כדי לנתק את התאים. אשר את הניתוק המלא של כל התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר האישור, הוסף נפח שווה של מדיית הרחבה כדי לנטרל את הטריפסין.

השתמש פיפטה כדי לאסוף את התאים המנותקים האלה בצינור פוליפרופילן טרי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה שלהם ב 150 פעמים גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-supernatant והחזירו את הכדור בנפח הרצוי של מדיית ההרחבה. לספור את התאים בשיטת ספירת התאים הסטנדרטית ולתת להם תרבית להרחבה נוספת בצפיפות זריעה של 10, 000 תאים לסנטימטר מרובע בצלחת פטרי של 150 מיליליטר.

עבור כל המבחנים, השתמש במונו-שכבה מקבילה של תאים ממספר המעבר P2 עד P5. כאשר התאים המורחבים מגיעים למפגש של 80% עד 90%, יש לנתק את התאים באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA לפני שהם מפילים אותם בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-150 פעמים גרם למשך חמש דקות. ואז לתלות את הכדור בפלזמה עיזים בצפיפות של 2 מיליון תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פלזמה המכילה את התאים על צלחת פטרי מעוקרת בקוטר 90 מ"מ, ולאחר מכן הוסיפו סידן כלורי בריכוז סופי של 0.3% ערבבו היטב כדי לייצר הידרוג'ל פלזמה צולב.

לאחר דגירה של הידרוג'ל מפוברק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות, העבירו את ההידרוג'לים ללוחות תרבית רקמה של 24 בארות המכילות מדיה כונדרוגנית. החלף את המדיה כל שלושה ימים למשך 14 יום. ההידרוג'לים שגודלו בתרבית במדיית DMEM מלאה ללא TGF-beta 1 נחשבים לבקרות לא מושרות.

לאחר 14 ימים של התמיינות כונדרוגנית של תאים בהידרוג'ל פלזמה, שטפו את ההידרוג'לים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, וקבעו את הדגימות בפורמלין נייטרלי במשך שלוש שעות. IFP-MSCs מבודדים היו דבקים הומוגנית והשיגו מורפולוגיה מוארכת תוך 24 שעות מתרבית המבחנה. התאים התרבו ביעילות של 80% עד 90% מפגש תוך שישה ימים מההתפשטות והפגינו יכולת קלונוגנית, מה שמעיד על יכולות שגשוג והתחדשות עצמית יעילות.

כאשר טופלו כדי להתמיין לשושלת אדיפוגנית, התאים המבודדים ייצרו טיפות שומנים, אשר אושרו על ידי שמן אדום O מכתים בימים 14 ו -21. טיפות שמן כאלה לא נראו בתאים ללא גורמים גורמים מעוררים אדיפוגניים. התאים המבודדים העטופים בהידרוג'ל פלזמה הראו היווצרות של רקמות ניאו-רקמה לבנה ומבריקה לאחר 14 יום בקבוצה המושרה הציגו את הפוטנציאל הכונדרוגני.

לקבוצה שלא נגרמה הייתה רקמה לבנה חיוורת עם ברק מופחת. בנוסף, צביעה היסטולוגית חיובית עבור כחול אלקסיאני וספרנין O בקבוצה המושרה הצביעה על כך שהתאים יכולים להפריש גליקוזאמינוגליקנים סולפטיים, אחד המרכיבים העיקריים של מטריצת הסחוס. לעומת זאת, מקטעי ההידרוג'ל מהקבוצות הלא מושרות היו שליליים עבור כתמי ספרנין O וכחול אלקיאני, מה שאישר את פוטנציאל ההתמיינות הכונדרוגנית של תאי הגזע המזנכימליים רק בנוכחות גירויים כונדרוגניים.

התאים המבודדים המושרים במדיה אוסטאוגנית הראו כתמים חיוביים עבור phosphatase אלקליין, המאשר מינרליזציה בתום 14 ימים. לאחר 28 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית, נצפו תצהירים עם הכתמה אדומה של אליזרין. התוצאות הדגישו את פוטנציאל ההתמיינות של תאים מושרים לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות.

זה חיוני כדי לעבד את הדגימה בתנאים אספטיים כדי למנוע זיהום. חשוב גם לזהות את המיקום הנכון של patella. הליך זה פותח את הדרך לבודד סוגי תאים שונים, כגון כונדרוציטים מפרקיים, פיברובלסטים של רצועות ותאי גזע מסינוביום ונוזל סינוביאלי, עם יישומים נרחבים ברפואה רגנרטיבית.

לאחר בידוד של IFP-MSCs באמצעות טכניקה זו, יעילותה נחקרה במיוחד להתחדשות של רקמות שלד-שריר, כגון סחוס, עצם ורצועות באמצעות גישות נטולות פיגומים ופיגומים.