הכנה ואפיון של ביו-דיו הידרוג'ל ביו-היברידי תלת-ממדי מבוסס גרפן לנוירו-הנדסה היקפית

מערכת תאי הגזע נמצאת תחת השפעת מרכיביה החשובים. שימור והתמיינות של תאי גזע אינו עולה על הדעת ללא נוכחות של microenvironment שלהם. מיקרו-סביבה זו, הנקראת נישה של תאי גזע, מורכבת מתאים ופיגומים.

נוירופתיה היקפית יכולה להיות, ולעיתים, כגון פגיעה במקלעת הברכי, טראומה שונה, גידול, אנומליות אוטונומיות, הגדרה חיסונית ומחלות מטבוליות. שיטות תרבית תלת ממדיות שונות פותחו כדי לספק נישה טובה וטבעית יותר לתאי הגזע. היווצרות ספרואידים והדפסה ביולוגית תלת-ממדית הן שיטות חדשות ומבטיחות יחסית לתרבויות תלת-ממדיות.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית יכולה לשמש גם בלימודי נוירו-הנדסה. כתוצאה מכך, במסגרת מחקר זה, ביודיו מבוסס גרפן ומבוסס אלגינט/ג'לטין פותחו ונחקרו עבור תכונות ההתחדשות שלהם. בתור התחלה, תרבית תאי גזע מזנכימליים ג'לי של וורטון או WJMSCs בתווך DMEM F12 המכיל 10% נסיוב עגל עוברי או FBS, 1% עט/סטרפטוקוקוס ו-1%L-גלוטמין תחת זרימה למינרית סטרילית בטמפרטורת החדר.

כאשר התאים בתרבית נפגשים ב-80% בצלוחית, יוצקים את המדיום ושוטפים את התאים בחמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין ו 2.21 מילימולר נתרן EDTA ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הוסף 10 מיליליטר של מדיום DMEM F12 המכיל 10% FBS לתאים.

להשעות את התאים, לאסוף את המדיום ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים והשליכו את הסופרנאטנט לפני הזריעה מחדש של התאים בבקבוק חדש עם מדיום מזין טרי המכיל 10% FBS. כדי להכין את הביודיו של קבוצת הביקורת ללא גרפן, שוקלים 4.5 מיליגרם אלגינט ו -1.5 מיליגרם ג'לטין ומעבירים אותם לצינור צנטריפוגה.

לאחר מכן הוסף 50 מיליליטר של מדיום DMEM F12 המכיל 10% FBS לצינור. שוב, שוקלים 4.5 מיליגרם אלגינט ו 1.5 מיליגרם ג'לטין ומעבירים אותם לצינור צנטריפוגה. לאחר מכן להוסיף 50 מיקרוליטר של 0.1% גרפן לצינור ולהפוך את נפח 50 מיליליטר עם DMEM F12 בינוני המכיל 10% FBS.

ערבבו את הדיו הביולוגי על ידי פיפטינג וערבול לפני ביצוע אוטומטי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס מתחת ל-1.5. לחץ אטמוספרי במשך 20 דקות. לאחר autoclaving, צנטריפוגה את התמיסה כדי להסיר בועות שנוצרו ולמקם את bioinks על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מוכנים.

לאינטראקציית הדיו הביולוגי של התא, צור את קבוצות הדיו הביולוגי. הקבוצה הראשונה כוללת הדפסה בתלת-ממד-B ובתלת-ממד-G עם דיו ביולוגי להדפסה ביולוגית. הקבוצה השנייה כוללת ביודיו 3D-BS ו-3D-GS שעליהם נוצרו ספרואידים לאחר הדפסה ביולוגית.

עבור קבוצה אחת, ספור את התאים לאחד על 10 עד התאים השביעי ב 0.5 מיליליטר של בינוני. לאחר מכן הוסף 4.5 מיליליטר של דיו ביולוגי. מעבירים את התערובת למחסניות בארון הסטרילי באמצעות מזרקים.

התקן את המחסניות באזור המכבש המתאים של המדפסת הביולוגית. עבור הקבוצה השנייה, קח חמישה מיליליטר של ביו-דיו מכל אחת מקבוצות הביו-דיו והעבר אותם למחסניות סטריליות בעזרת מזרק. השתמש במדפסת הביולוגית עם שני ראשי הדפסה קואקסיאליים וטכנולוגיית אקסטרוזיה פנאומטית.

הגדר את רזולוציית XYZ לכל צעד מיקרו ל- 1.25 מיקרומטר, רוחב אקסטרוזיה ל- 400 מיקרומטר וגובה האקסטרוזיה ל- 200 מיקרומטר. השתמש ברשת של 20 על 20 על 5 מילימטר כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים. צור מודלים תלת-ממדיים באמצעות תוכניות CAD מבוססות אינטרנט בקוד פתוח.

עבור תהליך הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, הגדר את הלחץ הממוצע של המדפסת ל- 7.5 psi. לאחר מכן כוונו את טמפרטורת המחסנית והמיטה ל-37 מעלות צלזיוס ואת המהירות ל-60% מקמו את המערכת במצב ביתי במהלך שלב הכתיבה. מקם את הצירים באופן אוטומטי ובחר והגדר את המכבש לפני תחילת תהליך ההדפסה הביולוגית.

לאחר ההדפסה, הסר את הדגימה והנח אותה מתחת לארון זרימה למינרי. לאחר מכן, רססו את הדיו הביולוגי בתמיסת סידן כלוריד רגילה 0.1 או הוסיפו תמיסת מיליליטר אחת עם פיפטה בטמפרטורת החדר והמתינו 10 עד 20 שניות. לאחר מכן שטפו את התבניות המודפסות פעמיים עם PBS המכיל סידן ומגנזיום.

הוסף שני מיליליטר של מדיום DMEM F12 עם 10% FBS על גבי כל תא המכיל קבוצת דיו ביולוגי ודגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של מדיום ההשעיה המכיל אחד על 10 לתאים השישיים לכל קבוצה לדגור את הלוחות. לאחר 24 שעות, התבוננו וצלמו את כל אצוות הביו-דיו ליצירת ספרואידים תחת מיקרוסקופ הפוך עבור התמיינות WJMSCs לתאים דמויי נוירונים למעט קבוצת הביקורת.

מוסיפים שני מיליליטר של מדיום התמיינות נוירוגני לכל באר ומרעננים כל יומיים. עקוב במשך שבעה ימים כדי לצפות בהתמיינות עצבית. לאחר מכן, באמצעות הדמיית timelapse, לבחון את ההשפעות של גרפן על תאי גזע ולנטר אינטראקציות תאים בתוך bioink.

השפעת ריכוז הגרפן על התפשטות התאים מודגמת כאן. בהשוואה לקבוצת הביקורת, נצפתה ירידה משמעותית בריכוז הגרפן 0.001%. לא היו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות האחרות לבין קבוצת הביקורת.

אינטראקציות גרפן התא הראו כי גרפן נסבל במערכת הדו-ממדית ונלקח על ידי התאים באמצעות אנדוציטוזה. הדמיית Timelapse הראתה כי תאים ששרדו בתווך הגרפן התלת-ממדי שמרו על חיוניותם באמצעות בהירות GFP עד סוף הדגירה. תמונות SEM וניתוח FIIR של קבוצות הדיו הביולוגי 3D-B ו- 3D-G מוצגים כאן.

אינטראקציות תאי ביו-דיו הודגמו הן על פני השטח והן באופן פנימי. התאים היו עגולים מורפולוגית ומחוברים לחומר. בהתמיינות עצבית תלת-ממדית, נחשב כי גבולות תאי הספרואידים בשתי הקבוצות היו שקופים ומלאי חיים, והספרואידים בקבוצת הגרפן היו גדולים יחסית וכלאו את הגרפן בתוך התא.

Immunostaining של תאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים מוצג כאן. התמונות הירוקות מייצגות מבנים דמויי תאי עצב. דגימת הבקרה החיובית הדו-ממדית ביטאה פחות סמני מבנה דמויי נוירונים מאשר הדגימות התלת-ממדיות.

גילינו שביו-דיו מבוסס גרפן היה מוצלח יותר במונחים של התמיינות תאי גזע לתאים דמויי נוירונים. אנו מציעים כי ביו-דיו מבוסס גרפן יהיה כלי מצוין לטיפול בהפרעות עצביות היקפיות במחקרים נוספים. כיום, מערכת תאי הגזע יכולה להיווצר על ידי הנדסת רקמות עם ביו-חומרים טבעיים וסינתטיים יצירת רקמות מלאכותיות שיכולות להחליף רקמות חיות אשר ניתן להשתמש בהן בהתחדשות של רקמות אלה, הסרת הנזק ומתן תפקוד מסופק על ידי הנדסת רקמות.