Name: ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנא פשוטה וחסכונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: למד שיטת בידוד DNA פשוטה וחסכונית לניתוח דינמיקת מיקרוביוטה במעי עכברים עם זאבת. השיטה מספקת תוצאות איכותיות להשוואה לערכות מסחריות ומאפשרת מחקר מולקולרי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מעריכים את העזרה מהמעבדה הלאומית של ארגון ומהביואינפורמטיקאים המשתפים פעולה שלנו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.

לוקוס Cx3cr1 gfp/gfp של עכברי B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J הוחזר לעכברי MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) במשך 10 דורות כדי ליצור עכברי MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp. בדיקת גנום באמצעות לוחות פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) אישרה כי הרקע הגנטי של עכברים חדשים שנוצרו היה זהה ביותר מ-97% לזה של MRL/lpr. לאחר מכן, עכברים גודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם לדרישות הספציפיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק.
1. איסוף דגימות מיקרוביוטה מעכברים
<ol><li>הוציאו כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו. לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים. הערה: ניתן להשתמש במכל (לדוגמה,) כדי למקם את העכבר בזמן ההמתנה לדגימת הצואה. נקו את המיכל עם אתנול לפני ואחרי כל עכבר.</li>
	<li>הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל 2 מ"ל ששקל מראש. להקליט את משקל הצואה בגרמים, אשר צריך להיות בין 0.02-0.05 גרם לכל גלולה צואה.</li>
	<li>הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מ"מ, 500 מיקרון ליטר של חיץ ליזה (50 mM NaCl, 5 mM Tris ו-50 mM EDTA), ו-200 μL של 20% SDS.</li>
	<li>חרוז-להכות את הצינור במשך 4 דקות הומוגנייזר (בעוצמה מקסימלית), ואחריו 3-5 דקות של מערבולת.</li>
	<li>סובבו לזמן קצר כדי לחסל את הבועות והקצף (לחצו על הכפתור בצנטריפוגה עד שהיא מגיעה ל-1,000-1,200 x גרם, ואז שחררו).</li>
</ol>2. מיצוי דנ"א
<ol><li>העבר 350 μL של supernatant שהושגו בשלב 1.5 (תוך הקפדה שלא לשאת פסולת) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. הוסיפו 500 μL של תערובת פנול-כלורופורם-איזואמיל אלכוהול (PCI; 25:24:1, v/v) ומערבולת למשך דקה אחת. הערה: מעתה והלאה, יש לטפל בדגימות בתוך מכסה מנוע כימי. PCI הוא רעיל.</li>
	<li>סובב ב- 6,000 x g למשך 3 דקות ב- 4 °C. העבר 180 μL מהפאזה המימית (השכבה העליונה) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. מוסיפים 180 μL (1:1) של כלורופורם, היפוך וערבוב. הערה: צמצם את הזיהום מהשכבה התחתונה בעת העברת השכבה העליונה.</li>
	<li>סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבר 180 μL של הפאזה המימית לתוך צינור מכסה הצמדה חדש. הערה: לאחר השלכת PCI וכלורופורם, ניתן לבצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי.</li>
	<li>הוסיפו 180 μL של איזופרופנול קר ו-36 μL של 5M NH4Ac. הפוך כמה פעמים כדי לערבב, והניחו את הצינור על קרח למשך 20 דקות.</li>
	<li>סובב ב 18,400 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C. יוצקים כדי להשליך את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור מספר פעמים עם 500 μL של קר 70% אתנול תוך היפוך. הערה: אתנול צריך להיות מדולל עם מים סטריליים דה-יוניזציה כפולה.</li>
	<li>סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר אתנול שיורי.</li>
	<li>יש לייבש באוויר את הצינור במהופך על נייר טישו למשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. להשעות את הכדור ב 50 μL של מים ברמה מולקולרית. מחממים את הנוזל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי DNA גדולים.</li>
	<li>סובבו צינורות לאחר חימום כדי לשחזר טיפות עיבוי על המכסה (3,400 x גרם למשך דקה אחת).</li>
	<li>מדוד את הריכוז וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במים ברמה מולקולרית כריק. דנ"א באיכות טובה צריך להיות בעל יחסים של 260/280 הנעים בין 1.8 ל-2. הערה: תפוקת הדנ"א הצפויה היא לפחות 0.03 גרם לכל כדור צואה.</li>
</ol>3. הכנת דגימה לריצוף גנים 16S rRNA
<ol><li>שלח את דגימות הדנ"א למעבדה הלאומית ארגון, שם הן עוברות הכנה לספרייה ומרוצפות על האילומינה מיסק.<ol><li>שלח דגימות בלוחות 96 בארות מלאים, עם דגימות מסודרות בשורות (A1-A12, B1-B12 וכו '), ואטום עם אטמי לוחות נייר כסף.</li>
		<li>שלח נפח סופי של 20 μL לכל דגימה לכל באר, בריכוז הנע בין 1-50 ng/μL. הערה: דילולים צריכים להיעשות עם מים ברמה מולקולרית.</li>
		<li>לאחר הכנת הדגימות, סובבו ב-600 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני הקפאת הדגימות ב-80°C- למשך 24 שעות.</li>
		<li>יש לשלוח למשך הלילה על קרח יבש.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

מיקרוביוטה מאוזנת של המעיים יכולה להגן על גוף האדם מפני מחלות. ברגע שאיזון זה מופר על ידי טריגרים חיצוניים או פנימיים, התוצאות יכולות להיות הרסניות. שיטה זו מציגה דרך לנתח את הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של מורין. השיטה מתאימה לא רק להשוואות בין קבוצות, אלא גם למעקב אחר המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן כדי לזהות טוב יותר גורמים תלויי זמן המשבשים את המיקרוביוטה של המעיים.
כל העכברים בניסוי חייבים להיות מטופלים באותה סביבה. אחד הנושאים החיוניים שיש לקחת בחשבון בעת איסוף דגימות צואה הו...

בני אדם וחיידקים התקיימו בדו-קיום במשך זמן רב. הם יצרו מערכת יחסים של תלות הדדית עם השפעות מועילות הדדיות המשפיעות על תגובות החיסון של המארח בדרכים כמותיות ואיכותיות1. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין הרכב המיקרוביוטה של המעיים לבין הפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות הכוללות טרשת נפוצה 2, דלקת מפרקים שגרונית3, סוכרת מסוג2 4, מחלות מעי דלקתיות5 וזאבת אדמנתית מערכתית (SLE)6. עם זאת,עדיין לא ברור אם המיקרוביוטה של המעיים היא הגורם העיקרי או ההשפעה המשנית של המחלות האוטואימוניות הללו. באופן פוטנציאלי, מיקרוביוטה של המעיים עלולה להחמיר את המחלה במהלך שלב ההשפעה של הפרעות אוטואימוניות או למלא תפקיד בוויסות האינדוקציה של מחלות אלה8.
דווח על דיסביוזיס במעיים אצל נקבות הנוטות לזאבת MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr),ונצפו שינויים במיקרוביוטה של המעיים עם דלדול משמעותי של לקטובצילי 9. כאשר תערובת של חמישה זני לקטובצילוס ניתנה דרך הפה, תסמינים דמויי זאבת נחלשו במידה רבה בעכברים אלה, מה שמרמז על תפקיד חיוני של מיקרוביוטה בוויסות פתוגנזה של SLE.
הטכניקה הבאה של מיצוי DNA מאפשרת לעקוב אחר תנודות מיקרוביוטה ולנתח אותם איכותית וכמותית במהלך מחלת מורין SLE בעכברים נוטים זאבת. בין אם לבחון את המיקרוביוטה הבריאה של המעיים או להגדיר דיסביוזיס, חשוב לבחון באופן ביקורתי כיצד הנתונים נאספים והאם הם מדויקים וניתנים לשחזור10. כל שלב הוא קריטי בתהליך זה. יש להשתמש במתודולוגיה מתאימה כדי לחלץ דנ"א מיקרוביאלי, שכן כל בעיה אפשרית בהטיות במהלך תהליך מיצוי הדנ"א עלולה לגרום לייצוג מיקרוביאלי לא מדויק. בעוד ששיטת הפנול-כלורופורם מתוארת כאן, ישנן ערכות זמינות מסחרית לחילוץ דנ"א מחיידקים שעובדות היטב במקרים מסוימים11. עם זאת, השימושיות שלהם מוגבלת על ידי העלות וכמות המדגם הנדרשת.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני ודורש רק כמות קטנה של דגימה. הוא עובד מצוין עם כל סוג של דגימת צואה, והוא שימושי בחקר הדינמיקה של המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן, כמו גם בהשוואות בין קבוצות. הדנ"א מבודד בשיטה של טיהור אלכוהול, המשתמשת בפנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל. מיצוי על בסיס אלכוהול מסייע לנקות ולהסיר את הדגימה של חלבונים ושומנים, שם DNA הוא זירז בשלב האחרון. השיטה המוצעת היא בעלת יעילות ואיכות גבוהות משמעותית והוכחה כמדויקת בזיהוי אוכלוסיות חיידקים. הערה קריטית אחת במהלך ההליך היא שזיהום DNA יכול להתרחש, ולכן נדרש טיפול מתאים בדגימה12.
לאחר מכן, הדנ"א מנותח על ידי פלטפורמות הריצוף של הדור הבא עבור הגן 16S rRNA, כגון Illumina MiSeq. בפרט, אזור ההיפר-משתנה V4 מנותח כדי לספק כימות טוב יותר עבור טקסהבדרגה גבוהה 13. ניתוח הביואינפורמטיקה שלאחר מכן הוא במיקור חוץ, ואחריו ניתוח פנימי בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ישנן תוכנות ביואינפורמטיקה רבות בקוד פתוח הזמינות לריצוף במורד הזרם, וסוג הניתוחים המבוצעים תלוי במידה רבה בשאלה הביולוגית הספציפית המעניינת14. פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשלבי הניסוי לפני הריצוף ומספק שיטה רב-תכליתית, חסכונית, דומה ויעילה יותר להשגת דנ"א מדגימות צואה.

<table><tbody><tr><td>חרוזי זכוכית 0.1 מ"מ</td><td>BioSpec מוצרים</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מכסה בורג 2 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS</td><td>FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>SDS 20%</td></tr><tr><td>96% אתנול, ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T032021000CS</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט (5 מ')</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>סערת בלנדר כדורים 24</td><td>Next Advance</td><td>4116-BBY24M</td><td>הומוגנייזר</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-Assisted מים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין חומצה טטראצטית</td><td>FisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>חותם צלחת נייר כסף</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) עכברי</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומר Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: isoamylalchohol (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td><td>סולם PCI</td></tr><tr><td>עם 4 עשרוניים</td><td>מטלר טולדו</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>וורטקס</td><td>תעשיות מדעיות</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

למיקרוביוטה של המעיים יש תפקיד חשוב בחינוך מערכת החיסון. קשר זה חשוב ביותר להבנת מחלות אוטואימוניות שאינן מונעות רק על ידי גורמים גנטיים, אלא גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את הופעת המחלה ו/או להחמיר אותה. מחקר שפורסם בעבר על הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים אצל נקבות MRL/lpr המועדות לזאבת הראה כיצד שינויים במיקרוביוטה של המעיים יכולים לשנות את התקדמות המחלה. כאן מתואר פרוטוקול לחילוץ דגימות מייצגות מהמיקרוביוטה של המעיים למחקרים על אוטואימוניות. דגימות מיקרוביוטה נאספות מפי הטבעת ומעובדות, מהן מופק הדנ"א בשיטת פנול-כלורופורם ומטוהר על ידי משקעי אלכוהול. לאחר ביצוע PCR, אמפליקונים מטוהרים מרוצפים באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא במעבדה הלאומית ארגון. לבסוף, נתוני ריצוף הגנים של RNA ריבוזומלי 16S מנותחים. לדוגמה, מוצגים נתונים שהתקבלו מהשוואות מיקרוביוטה של המעיים של עכברי MRL/lpr עם או בלי CX3CR1. התוצאות הראו הבדלים משמעותיים בסוגים המכילים חיידקים פתוגניים כמו אלה שבגוף הפרוטאובקטריה, כמו גם בסוג ביפידובקטריום, שנחשב לחלק מהמיקרוביוטה הבריאה. לסיכום, שיטת בידוד הדנ"א הפשוטה והחסכונית הזו אמינה ויכולה לסייע בחקר שינויים במיקרוביוטה של המעיים הקשורים למחלות אוטואימוניות.

התוצאות מהמעבדה הלאומית של ארגון מנותחות על ידי ביואינפורמטיקאי מוסמך, ולאחר מכן ניתוח פנימי של הנתונים בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ניתוחי מיקרוביום טיפוסיים כוללים אשכולות של רצפים דומים ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) או וריאנטים של רצפי אמפליקון (ASVs) כפרוקסי למיקרואורגניזמים שונים בדגימה. לאחר מכן ניתן להשתמש בספירות של OTUs או ASVs על פני דגימות כדי לבדוק אם יש שינויים במגוון בתוך הדגימה (אלפא) ובגיוון בין הדגימות (בטא). הם יכולים לשמש גם כדי לבדוק עבור taxa כי הם נפוצים באופן דיפרנציאלי על פני קטגוריות מטא נתונ...

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

שיטת בידוד הדנ"א המוצעת יכולה לשמש לחקר הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של עכברי מחלות אוטואימוניות. שיטה רב-תכליתית, חסכונית ויעילה יותר מוצעת להשגת דנ"א מדגימות צואה הדומות לערכות הזמינות מסחרית. כדי להתחיל, להוציא כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו, לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים. הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל שני מיליליטר שנשקל מראש, ורשום את משקל הצואה בגרמים, שאמור להיות בין 0.02 ל -0.05 גרם לכל כדור צואה. הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מילימטר, 500 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ו-200 מיקרוליטרים של 20% נתרן דודציל סולפט.חרוז היכה את הצינור במשך ארבע דקות בהומוגנייזר, ואחריו שלוש עד חמש דקות של מערבולת. צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר כדי לחסל את הבועות ואת הקצף. כדי לחלץ דנ"א מדגימות המיקרוביוטה, העבירו 350 מיקרוליטרים של דגימה-על לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ללא כל פסולת.הוסף 500 מיקרוליטר של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל, ביחס של 25:24:1, ומערבולת במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, העבירו 180 מיקרוליטרים של הפאזה המימית העליונה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של כלורופורם, הופכים ומערבבים.מכאן, להעביר 180 microliters של הפאזה המימית לתוך צינור כובע הצמדה חדש. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של איזופרופנול קר ו-36 מיקרוליטרים של חמישה אצטט אמוניום טוחן. הפוך אותו כמה פעמים כדי לערבב, והנח את הצינור על קרח במשך 20 דקות.להשליך את supernatant, ואחריו לשטוף את הכדורים מספר פעמים עם 500 microliters של 70% אתנול קר. יש להשליך את הסופר-נט, ולייבש את הצינור במהופך על נייר טישו במשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. יש להשעות את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של מים ברמה מולקולרית, ולחמם את הנוזל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי דנ"א גדולים.לאחר החימום, צנטריפוגות אלה ב 3, 400 פעמים G במשך דקה אחת כדי לשחזר את טיפות העיבוי מן המכסה. מדוד את הריכוז, וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. היחס לדנ"א באיכות טובה הוא בדרך כלל בין 1.8 לשניים.צנטריפוגה של דגימות מוכנות ב 600 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, לפני קפיאה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, שלח 20 מיקרוליטרים של דגימות בריכוזים הנעים בין 1 ל-50 ננוגרם למיקרוליטר למעבדה הלאומית של ארגון לריצוף. לזן העכבר חסר הקולטן CX3CR1 יש הרכב מיקרוביוטה שונה של המעיים בהשוואה לעכברי MRL/lpr מסוג פראי, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, מראה הבדלים משמעותיים בסוגים מסוימים, הרלוונטיים לחיידקים פתוגניים פוטנציאליים כמו אלה שבגוף פרוטאובקטריה.היזהר עם זיהום המדגם. זה צריך להיות סטרילי. כמו כן, חשוב פיפטינג עם דיוק בעת העברת supernatant בצינור חדש.שיטה זו מתאימה לאנליזה מולקולרית כגון PCR, עיכול אנזימי הגבלה או בניית ספרייה גנומית. בזאבת הוכחנו קשר חזק בין מיקרוביוטה של המעיים לבין התקדמות זאבת.

analysis-fecal-microbiota-dynamics-lupus-prone-mice-using-simple-cost

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר פרוטוקול בידוד DNA מדגימות צואה של עכברים נושאי גידול במעי הגס. הדנ"א המופק מוגבר באמצעות PCR, והמוצר מנוקה עוד יותר באמצעות גישה מבוססת חרוזים מגנטיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של העשרה סביבתית על מיקרוביוטה המעי הגס ותמותת בעלי חיים.

בידוד דנ"א מיקרוביאלי בצואה: חקר השפעת העשרה סביבתית על מגוון המיקרוביום במודל הגידול המורין

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

העשרה סביבתית (EE) היא סביבת מגורים בעלי חיים המשמש כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס את החיבורים בין אורח חיים, מתח, מחלה. פרוטוקול זה מתאר הליך שבאמצעותו משתמש במודל עכבר של המעי הגס tumorigenesis, EE במיוחד להגדיר שינויים microbiota המגוון הביולוגי עשוי להשפיע התמותה בעלי חיים.

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

כאן אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור המינהל אנטיביוטיקה דרך הפה עכברים, איסוף דגימות צואה, הפקת דנ א, כימות של צואה חיידקים על ידי qPCR.

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות זאבת בעכברים. שני הליכים נוספים מוצגים כדי לאפיין זאבת נפריטיס בהתבסס על חדירת תאים ותצהיר חלבון בכליות.

ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת

המטרה כאן היא להתוות פרוטוקול לחקר המנגנונים של דיסביוזיס במחלות לב וכלי דם. מאמר זה דן כיצד לאסוף ולהשתיל דגימות צואה של מורין, לבודד מעיים ולהשתמש בשיטת "סוויס-רול", ואחריה טכניקות של צביעת מערכת החיסון כדי לחקור שינויים במערכת העיכול.

בידוד צואה מורין והשתלת מיקרוביוטה

פרוטוקול זה מתאר את השיטות המומלצות להעברת עכברים ללא חיידקים למבודדים ניסיוניים בכלוב יחיד (איזוקאז'ים) תוך שמירה על תנאים סטריליים. נדונות שיטות להשתלת צואה בעכברים נטולי חיידקים ואיסוף חיידקים ברי קיימא מעכברים "אנושיים" אלה ליישומים נוספים.

הכנה ותחזוקה של ניסוי כלוב איזופוזיטיבי להדרה ביולוגית להשתלת צואה אנושית בעכברים נטולי חיידקים

למד שיטת בידוד DNA פשוטה וחסכונית לניתוח דינמיקת מיקרוביוטה במעי עכברים עם זאבת. השיטה מספקת תוצאות איכותיות להשוואה לערכות מסחריות ומאפשרת מחקר מולקולרי מתקדם.

ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

גלה סרטונים נוספים