ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית
2 במאי 2022
פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.
שיטת בידוד הדנ"א המוצעת יכולה לשמש לחקר הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של עכברי מחלות אוטואימוניות. שיטה רב-תכליתית, חסכונית ויעילה יותר מוצעת להשגת דנ"א מדגימות צואה הדומות לערכות הזמינות מסחרית. כדי להתחיל, להוציא כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו, לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים. הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל שני מיליליטר שנשקל מראש, ורשום את משקל הצואה בגרמים, שאמור להיות בין 0.02 ל -0.05 גרם לכל כדור צואה. הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מילימטר, 500 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ו-200 מיקרוליטרים של 20% נתרן דודציל סולפט.
חרוז היכה את הצינור במשך ארבע דקות בהומוגנייזר, ואחריו שלוש עד חמש דקות של מערבולת. צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר כדי לחסל את הבועות ואת הקצף. כדי לחלץ דנ"א מדגימות המיקרוביוטה, העבירו 350 מיקרוליטרים של דגימה-על לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ללא כל פסולת.
הוסף 500 מיקרוליטר של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל, ביחס של 25:24:1, ומערבולת במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, העבירו 180 מיקרוליטרים של הפאזה המימית העליונה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של כלורופורם, הופכים ומערבבים.
מכאן, להעביר 180 microliters של הפאזה המימית לתוך צינור כובע הצמדה חדש. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של איזופרופנול קר ו-36 מיקרוליטרים של חמישה אצטט אמוניום טוחן. הפוך אותו כמה פעמים כדי לערבב, והנח את הצינור על קרח במשך 20 דקות.
להשליך את supernatant, ואחריו לשטוף את הכדורים מספר פעמים עם 500 microliters של 70% אתנול קר. יש להשליך את הסופר-נט, ולייבש את הצינור במהופך על נייר טישו במשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. יש להשעות את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של מים ברמה מולקולרית, ולחמם את הנוזל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי דנ"א גדולים.
לאחר החימום, צנטריפוגות אלה ב 3, 400 פעמים G במשך דקה אחת כדי לשחזר את טיפות העיבוי מן המכסה. מדוד את הריכוז, וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. היחס לדנ"א באיכות טובה הוא בדרך כלל בין 1.8 לשניים.
צנטריפוגה של דגימות מוכנות ב 600 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, לפני קפיאה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, שלח 20 מיקרוליטרים של דגימות בריכוזים הנעים בין 1 ל-50 ננוגרם למיקרוליטר למעבדה הלאומית של ארגון לריצוף. לזן העכבר חסר הקולטן CX3CR1 יש הרכב מיקרוביוטה שונה של המעיים בהשוואה לעכברי MRL/lpr מסוג פראי, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, מראה הבדלים משמעותיים בסוגים מסוימים, הרלוונטיים לחיידקים פתוגניים פוטנציאליים כמו אלה שבגוף פרוטאובקטריה.
היזהר עם זיהום המדגם. זה צריך להיות סטרילי. כמו כן, חשוב פיפטינג עם דיוק בעת העברת supernatant בצינור חדש.
שיטה זו מתאימה לאנליזה מולקולרית כגון PCR, עיכול אנזימי הגבלה או בניית ספרייה גנומית. בזאבת הוכחנו קשר חזק בין מיקרוביוטה של המעיים לבין התקדמות זאבת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה וכלכלית לבידוד DNA לצורך ניתוח שינויים במיקרוביוטה של מעי עכברים במהלך התפתחות של מחלה אוטואימונית. השיטה נועדה לחקר הדינמיקה של מיקרוביוטת המעי במודלים של עכברים למחלות אוטואימוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מיקרוביולוגיה
- אוטו-אימוניות
רקע
- הבנת מיקרוביוטת המעי היא קריטית במחקר של מחלות אוטואימוניות.
- שיטות נוכחיות לבידוד DNA עשויות להיות יקרות ומורכבות.
- מחקר זה מציע חלופה יעילה וכלכלית יותר.
- מדגמי צואה משמשים לניתוח שינויים במיקרוביוטה.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה להפקת DNA מדגימות צואה.
- הסקת עזר למחקר של מיקרוביוטת המעי במודלים של מחלות אוטואימוניות.
- השוואת היעילות של השיטה החדשה מול ערכות זמינות מסחרית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף פרטני של גללי עכברים.
- אחסון דגימות בטמפרטורה של -80 degrees Celsius.
- שימוש בכלים סטריליים לעיבוד הדגימות.
- הכנת דגימות באמצעות באפר ליזה וחרוזי זכוכית.
תוצאות עיקריות
- השיטה המוצעת מניבה איכות DNA הדומה לזו של ערכות מסחריות.
- היא יעילה וכלכלית עבור אנליזה של מיקרוביוטה.
- היא מקלה על מחקרים נוספים של מנגנוני מחלות אוטואימוניות.
מסקנות
- שיטה זו לבידוד DNA היא כלי בעל ערך עבור חוקרים.
- היא תומכת בחקירת מיקרוביוטת המעי בהקשרים של מחלות.
- היא מעודדת מחקר נגיש יותר בתחום autoimmune.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח מהימן של דינמיקת מיקרוביוטת המעי במודלים של מחלות אוטואימוניות הוא קריטי להבנת התרומות הסביבתיות והגנטיות להתקדמות המחלה. פרוטוקול בידוד DNA חסכוני זה מאפשר הפקה ניתנת להרחבה ולשחזור של DNA מיקרוביאלי מדגימות צואה של עכברים, ובכך תומך במחקרי מיקרוביום בעלי תפוקה גבוהה במחקר פרה-קליני. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בקישור בין שינויים במיקרוביוטה לפנוטיפים אוטואימוניים, ובכך מסייעת לגילוי מוקדם ולאסטרטגיות תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של אינטראקציות בין המיקרוביוטה למערכת החיסון במודלים של עכברים הרלוונטיים למחלה.
- תומך באימות תפקודי של מסלולים מועמדים המושפעים מהרכב המיקרוביום במעי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים מיקרוביאליים להתקדמות של מחלה אוטואימונית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק דגימות DNA סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור ריצוף ובדיקות מולקולריות המשך.
- מבטיח DNA כמותי ואיכותי המתאים ל-PCR ולתהליכי ריצוף מהדור הבא.
- מאפשר עיבוד דגימות בר-הרחבה עבור מחקרי מיקרוביום השוואתיים בין קבוצות ניסוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את אפיון המיקרוביוטה הפרה-קליני להתקדמות המחלה ולמאמצים לגילוי סמנים ביולוגיים.
- תומך ברצף מהממצאים שלב הגילוי ועד לאישור תרגומי (translational validation) במודלים של מחלות אוטואימוניות.
- מפחיתה עמימות ביולוגית בקישור בין גורמים סביבתיים לבין פנוטיפים של מחלות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול בידוד ה-DNA זה משתלב ברצף העבודה מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד למסלול הפרה-קליני, ומאפשר ניתוח מיקרוביום חסון במודלים של עכברים הנוטים ללופוס, תוך תמיכה בזיהוי מולקולות מובילות ובמחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: מסייע בבדיקת השערות על ויסות חיסוני המונחה על ידי מיקרוביוטה באוטו-אימוניות.
- סריקה: מספק תוצרי DNA כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פרופיל מיקרוביום מבוסס ריצוף.
- אנליזה: מספק קלט באיכות גבוהה להשוואה סטטיסטית של שינויים בקהילה המיקרוביאלית בין גנוטיפים או טיפולים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין ממצאי מיקרוביום פרה-קליניים לבין פיתוח פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים במחלות אוטו-אימוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול בר-הרחבה ובעל יעילות כלכלית, הניתן להתאמה למודלים עכבריים שונים ולתכנוני ניסויים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בקשרים בין מיקרוביוטה למחלות ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מיצוי DNA, המשפרת את השחזוריות והיכולת להרחבה (סקלאביליות) בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרת תרומות המיקרוביום למנגנוני מחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון של התערבויות מווסתות מיקרוביום בקווי פיתוח של מחלות אוטואימוניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בטיפול לדגמים סטריליים ובתהליכי עבודה של ביולוגיה מולקולרית.
- דורש גישה להומוגניזטורים, צנטריפוגות וספקטרופוטומטרים לצורך בקרת איכות.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי למזער זיהומים ושונות.
- ניתן להתאמה למודלים עכבריים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור סוגי דגמים שונים.
- תלוי בפיפטור מדויק ובטכניקה סטרילית כדי להבטיח את תקינות הנתונים.
