גיבוש ואפיון מערכת נשאי דופמין מבוססת אקסוזום

אקסוזומים עשויים להגיב לבועיות המופרשות על ידי תא בגודל של בין 14 ל -200 ננומטר, ומתפצלות מהמטען והתקשורת התוך-תאיים, המגיעים לתת-הקבוצה הקטנה ביותר של שלפוחיות חוץ-תאיות. אקסוזומים הנוצרים כתוצאה מהתמיינות האנדוזום, מקורם בקרום התא. ניתן לבודד את תאי הגזע ממקורות שונים כגון מח עצם או רקמות שומן.

אבל לתאי גזע מיובשים ברקמה בוגרת יש פוטנציאל אימונוגני גבוה יותר חסרונות בקפיצת גודל של אקסוזומים, נאמר כי זה עשה תפקיד חשוב במחלת מערכת העצבים המרכזית כי זה יכול לעבור דרך מחסום הדם במוח. כדי להתחיל, לשטוף את זרעי תאי גזע mesenchymal ג'לי של וורטון עם חמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA לפני הצבת הבקבוק באינקובטור.

לאחר הדגירה, לאסוף את התאים ואת הצנטריפוגה ב 1, 500 גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של DMEM-F12 המכיל 10% FBS לצינור. לשטוף תאים בתרבית עם PBS.

לאחר השטיפה, להוסיף מדיום DMEM-F12 ללא סרום לתאים ולמקם אותו באינקובטור. כדי לבודד את האקסוזומים, אספו את המדיה והצנטריפוגה ללא סרום ב-300 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור אחר ומעבדים אותו באמצעות צנטריפוגה טורית במהירויות גבוהות יותר.

לאחר הצנטריפוגה הסופית, מוציאים לאט את הסופרנאטנט וממיסים את הגלולה במיליליטר PBS. מערבבים על ידי מערבולת ולהמשיך עם ultracentrifugation ב 110, 000 גרם במשך 70 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף שלושה מיליליטר PBS לתרחיף האקזוזום שנאסף קודם לכן על ידי אולטרה-צנטריפוגה ועיקור את המתלה המדולל על ידי סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון.

לאחר מכן להעביר 500 מיקרוליטר של ההשעיה exosome מעוקר צינור אחר. לאחר מכן, ברצף, להוסיף 500 מיקרוליטר של 0.5 מיליגרם לכל מיליליטר תמיסת דופמין ו saponin לתוך ההשעיה מעוקר. לאחר הדגירה אולטרה צנטריפוגה את המתלים.

הדגימה יכולה לשמש לניתוח NTA ו-DLS כדי לאפיין אקסוזומים טעוני דופמין או לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. בניתוח של נת"ע, נקבע כי הגודל הממוצע של אקסוזומים שמקורם בג'לי וורטון הוא 98 ננומטר ואקסוזומים טעוני דופמין להיות 110 ננומטר. מספרי הננו-חלקיקים שנחשפו בניתוחי נת"ע ו-DLS תאמו זה את זה.

פוטנציאל הזטה של אקסוזומים שמקורם בג'לי וורטון נמדד כמינוס 15.7 ואקסוזומים טעוני דופמין כמינוס 17.6 מיליוולט. ניתוח HPLC של האקסוזומים טעוני הדופמין זיהה את שיא הדופמין לאחר 6.45 דקות. פרופיל שחרור התרופה המצטבר גילה כי 74.8% מהדופמין העטוף שוחרר מהאקסוזומים בשמונה השעות הראשונות.

נחקרה הציטוטוקסיות של האקסוזומים הטעונים בדופמין והחופשיים על פיברובלסטים. למרות שהאקסוזומים העמוסים בדופמין לא הדגימו השפעות ציטוטוקסיות, ספונין הפחית את יכולת הקיום של הפיברובלסט. בדיקת MTT הראתה יכולת קיום מוגברת של תאים כאשר הפיברובלסטים טופלו באקסוזומים טעוני דופמין.

המובהקות הסטטיסטית של התוצאות הוערכה על ידי ביצוע אנובה חד-כיוונית. בנוסף, ההשפעות ציטוטוקסיות של ריכוזים שונים של אקסוזומים חופשיים נחקרו על הפיברובלסטים. הכדאיות של הפיברובלסטים הייתה גבוהה יותר עם אקסוזומים חופשיים בריכוז של 25 מיקרוליטר למיליליטר.

חשוב מאוד שמערכת העצבים המרכזית תהיה גודל המטופל, תפקיד המשחק בתהליכים כמו פלסטיות, תגובה עצבית, תקשורת מצד לצד ויצירת תאי עצב במוח. בנוסף, הודות לפני השטח של אקסוזומים, הוא אומר, נצפה כי הם יכולים באינטראקציה עם התרופה תא המטרה ופעילות המועברת במהלך התרופה היא השלמה. בפעם הראשונה במחקר, פיתחנו נוסחה חדשה של תרופה על ידי עטיפת דופמין לתוך אקסוזומים שמקורם בתאי גזע.

הוא הציע כי ניסוח זה יהיה כל כך מבטיח לטיפול במחלת פרקינסון.