Name: תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למדו כיצד להמיר תאי גליה מולר לתאי תחילית רטינליים באמצעות טיפול במיקרו-רנ"א בתרביות תאים ראשוניות. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות הרכבות מיקרו-רנ"א לפני יישומים אינ-ויוו בחקר הרטינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר אן ביטון ולכל חברי המעבדה על התייחסותם לכתב היד. תודה מיוחדת לד"ר טום רה, ג'וליה פולק וראס טיילור על הצגת התרבויות הראשוניות של MG ככלי סינון ל- S.G.W. במהלך הכשרת פוסט-דוקטורט באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. המחקר מומן על ידי מענק תוכנית החדשנות של האימפריה (EIP) ל- S.G.W. וקרנות סטארט-אפ מ- SUNY אופטומטריה ל- S.G.W., כמו גם פרס R01EY032532 ממכון העיניים הלאומי (NEI) ל- S.G.W.

פטנט הכולל חלק מהממצאים בדו"ח זה הוגש על ידי אוניברסיטת וושינגטון עם הממציאים ניקולאס ג'ורסטאד, סטפני ג' וואהל ותומאס א' רה. הפטנט נקרא ''שיטות והרכבים לעידוד התחדשות הרשתית.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר מנותקות לצורך תכנות מחדש של מחקרים באמצעות miRNAs. כפי שהוכח ואושר במגוון מחקרים קודמים, הרוב המכריע (80%-90%) של התאים שנמצאו בתרביות אלה הם MG 20,23,24. שיטה זו היא טכניקה חזקה ואמינה מאוד וניתן לשחזר בקלות את התוצאות אם הפרוטוקול עוקבים אחריו נכון21,27. עם זאת, הצמיחה המוצלחת ויעילות התכנות מחדש של התרבות תלויות במגוון גורמים...

גליה מולר (באנגלית: Müller glia) היא הגליה השולטת ברשתית העצבית. יש להם תפקודים דומים בהשוואה לגליה אחרים בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים, הזנת נוירונים והגנה על הרקמה. ל-MG יש תכונה מרתקת נוספת: למרות שהם גליה בוגרים, הם עדיין מבטאים גנים רבים המתבטאים בתאי אב רשתית (RPCs) במהלך התפתחות מאוחרת 1,2. ההנחה היא שדמיון זה הוא הסיבה להתחדשות העצבית הטבעית המבוססת על MG ברשתית הדגים לאחר נזק לרשתית 3,4. במהלך תהליך זה, MG נכנסת מחדש למחזור התאים ומתמיינת מחדש ל-RPCs שלאחר מכן מתמיינים לכל ששת הסוגים של נוירוני הרשתית. למרות שתופעה זו מתרחשת באופן טבעי בדגים, יונקים MG אינם ממירים לנוירונים 5,6. עם זאת, ניתן לתכנת אותם מחדש. הודגם כי מגוון גורמים מתכנתים מחדש את MG ל-RPCs/נוירונים; בין גורמים אלה נמצא גורם השעתוק הבסיסי סליל-לולאה-סליל (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) המעורב בהתחדשות דגים 7,8. בעכברים, Ascl1 מתבטא רק ב-RPCs במהלך רטינוגנזה, אך הוא נעדר ב-MG בוגר או בתאי עצב ברשתית9.
תכנות מחדש של תאים ישירות in vivo הוא לא רק מאתגר מבחינה מתודולוגית, אלא גם דורש אישור מוועדה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. כדי לקבל אישור, נדרשים נתונים ראשוניים על הגורמים שבהם נעשה שימוש או שינוי, ריכוזים, השפעות מחוץ למטרה, מנגנונים בסיסיים, רעילות ויעילות. מערכות תרביות תאים מאפשרות בדיקה של קריטריונים אלה לפני השימוש במודלים in vivo. יתר על כן, מכיוון ש-MG מהווים רק כ-5% מכלל אוכלוסיית תאי הרשתית10, תרביות MG מאפשרות לחקור את תפקודן11 וכן את התנהגותן, כולל נדידה12,13, התפשטות14, תגובת עקה לפציעה/נזק15,16, האינטראקציה שלהן עם סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה17 או תאי גנגליון רשתית (RGCs)18, או הפוטנציאל הנוירוגני שלהם 19,20,21. חוקרים רבים משתמשים בקווי תאים מונצחים לצורך המחקרים שלהם מכיוון שיש להם פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל וניתן לתחזק אותם בקלות ולתמר אותם. תאים ראשוניים, לעומת זאת, עדיפים על מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית מאשר תאים מונצחים, שכן יש להם מאפייני תאים אמיתיים (ביטוי גנים וחלבונים), וחשוב מכך, הם מייצגים שלב מסוים בהתפתחות ולכן יש להם "גיל". גילו של בעל חיים (וכתוצאה מכך של התאים המתקבלים מבעל חיים) הוא גורם מכריע במיוחד בתכנות מחדש של התאים, שכן הפלסטיות של התאים פוחתת עם התקדמות שלב ההתפתחות22.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתכנת מחדש MG ראשוני עם miRNAs כשיטת מבחנה נוכחית לחקר התחדשות. מודל תרבית ראשוני זה של MG הוקם בשנת 2012 כדי להעריך את מאפייני התפשטות התאים של MG בעכברי נוק-אאוט P53 (trp53-/- עכברים)23. הודגם כי MG מתורבתים שומרים על תכונות הגליה שלהם (כלומר, ביטוי של חלבוני S100β, Pax6 ו-Sox2 שהוערכו באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי), וכי הם דומים ל-in vivo MG (מיקרו-מערך של MG מטוהר FACS)23. זמן קצר לאחר מכן, mRNA גליאלי וביטוי חלבונים אומתו ואושרו בגישה שונה באמצעות וקטורים נגיפיים20. כמה שנים לאחר מכן, אושר כי הרוב המכריע של התאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG על ידי שימוש בעכבר Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter24 הספציפי ל-MG. יתר על כן, כימות של קבוצת ה-miRNAs הן ב-MG המטוהר ב-FACS והן ב-MG ראשי מתורבת הראה כי הרמות של MG miRNAs (mGLiomiRs) אינן משתנות הרבה ב-MG מתורבת במהלך שלב הצמיחה. עם זאת, תקופות תרבית מוארכות גורמות לשינויים ברמות ה-miRNA וכתוצאה מכך ברמות ה-mRNA ובביטוי החלבון, שכן miRNA הם מווסתים תרגומיים25.
בשנת 2013, מודל תרבית MG זה שימש לבדיקת מגוון גורמי שעתוק ביחס ליכולתם לתכנת מחדש את MG לנוירונים ברשתית20. Ascl1 נמצא כגורם תכנות מחדש חזק ואמין מאוד. ביטוי יתר של Ascl1 באמצעות וקטורים ויראליים גרם לשינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמנים עצביים ורכישת תכונות אלקטרופיזיולוגיות עצביות. חשוב מכך, התובנות והתוצאות שהתקבלו מניסויים ראשונים אלה במבחנה הועברו בהצלחה ליישומי in vivo 22,26, מה שמדגים כי תרבויות MG ראשוניות מייצגות כלי מוצק ואמין להקרנות גורמים ראשוניות ולהערכה של תכונות גליה לפני יישום in vivo.
לפני מספר שנים, הוכח כי miRNA miR-124 המועשר במוח, אשר מתבטא מאוד גם בתאי עצב ברשתית, יכול לגרום לביטוי Ascl1 בתרבית MG21. ביטוי Ascl1 בתאים חיים הודגם באמצעות עכבר כתב Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). עכבר עיתונאי הוא עכבר מהונדס גנטית שיש לו גן עיתונאי המוחדר לדנ"א שלו. גן מדווח זה מקודד לחלבון עיתונאי, שנמצא במחקר זה tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום. חלבון כתב זה מדווח על ביטוי של גן בעל עניין, במקרה זה, Ascl1. במילים אחרות, תאים המבטאים Ascl1 יהפכו לאדומים. מכיוון ש- Ascl1 מתבטא רק ב- RPCs9, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl זה מאפשר מעקב אחר המרת MG ל- Ascl1 המבטאת RPCs, כלומר המרת תאים תבטא חלבון כתב tdTomato פלואורסצנטי אדום. זהו תיוג בלתי הפיך מכיוון שהדנ"א של תאים אלה משתנה. כתוצאה מכך, כל התמיינות עצבית עוקבת תודגם מכיוון שהתווית tdTomato נשארת בתאים מתמיינים. אם Ascl1 מבטא RPCs שמקורם ב-MG (עם תווית tdTomato) מתמיינים לנוירונים, נוירונים אלה עדיין יהיו בעלי התווית האדומה שלהם. עכבר זה, אם כן, מאפשר לא רק תיוג של RPCs שמקורם ב-MG להדמיית תאים חיים, אלא גם מאפשר מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של RPCs אלה שמקורם ב-MG (אדום). לאחרונה זוהתה קבוצת miRNA ב-RPCs ותרביות MG של Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter עכברים שימשו לסינון ובדיקת ההשפעה של miRNA אלה על יכולת התכנות מחדש והיעילות27. מועמד אחד, ה-RPC-miRNA miR-25, נמצא מסוגל לתכנת מחדש את MG בתרבית לתאים המבטאים Ascl1 (Ascl1-Tomato+). תאים מתוכנתים מחדש אלה מאמצים תכונות עצביות לאורך זמן, כולל מורפולוגיה עצבית (סומטה קטנה ותהליכים עדינים קצרים או ארוכים), ביטוי של תעתיקים עצביים הנמדדים באמצעות scRNA-Seq, כמו גם ביטוי של חלבונים עצביים המאומתים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי27.
כאן, הפרוטוקול מפרט כיצד לגדל ולהחליף MG מעכברי P12 שהותאמו מהעבודה הקודמת 21,24,27. נבחר לפרוטוקול זה הוא miRNA miR-25 הנ"ל, miRNA המבוטא מאוד ב-RPCs, עם רמות ביטוי נמוכות ב-MG או בתאי עצב ברשתית. על מנת לבטא יתר על המידה miR-25, מורין miR-25 מחקה, כלומר, מולקולות miRNA מלאכותיות משמשות. כבקרה, נבחרים חיקויים של miRNA מ- Caenorhabditis elegans, שאין להם שום תפקיד בתאי יונקים. ההדמיה של ההמרה של MG ל-RPCs נעשתה באמצעות עכבר הכתב RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), עכבר עם רקע מעורב (זני C57BL/6, S129 ו-ICR). עם זאת, תרבות זו יכולה להתבצע עם כל זני העכברים, כולל זנים מסוג בר. בשנים האחרונות, הפרוטוקול המקורי שונה כדי לקצר את משך שלב הגדילה ואת תקופת התרבית הכוללת ולהבטיח מצב חזק יותר של תאי גליה ולמזער את מידת הניוון התאי, המתרחשת בתקופות תרבית ממושכות. חלון הזמן הרגיל של הטרנספקציה הוארך גם הוא מ-3 שעות ליומיים. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתאר תרביות MG ככלי למחקרי התחדשות, השיטה לא רק שימושית לבדיקת גורמי תכנות מחדש, אלא יכולה להיות מותאמת גם ליישומים אחרים, כולל מחקרים על התנהגות נודדת או התפשטות של MG, פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים, ו/או זיהוי מנגנונים ומסלולים בסיסיים.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#012882</td><td>עכברי Ascl1-CreERT הוכלאו עם עכברי tdTomato</td></tr><tr><td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&nbsp; ב6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#007914</td><td>נדרשת גנוטיפ כדי לזהות Ascl1CreER חיובי לעכברים</td></tr><tr><td><חזקים>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-הידרוקסיטאמוקסיפן &ge; 98% איזומר Z</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H7904-5MG</td><td>משוחזר באתנול, מכסות קפואות</td></tr><tr><td>16% תמיסה מימית של פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>2% PFA עשוי עם מי מלח עם פוספט (PBS), מכסות קפואות</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד עזים IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן Otx2 אנטי אנושי, R& דילול D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>1:500</td></tr><tr><td>נוגדן MAP2 נגד ארנב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>דילול 1:250</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון פלואורסצנטי אנטי אדום (RFP)</td><td>נוגדנים - דילול ABIN334653 מקוון</td><td></td><td>1:500</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>משוחזר ב- PBS,</td></tr><tr><td>תוסף תזונה B-27 קפוא</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>17-504-044</td><td>קפוא aliquots</td></tr><tr><td>Brain Phys Neuronal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>המשמש כמדיום עצבי בסעיף 1.2, אחסן ב-4 מעלות; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>reconstruct את המדריך הבא, 4&deg; C</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>משוחזר בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), מכסות קפואות</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Opti-MEM סרום מופחת בינוני, תוסף GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות; סי</td></tr><tr><td>גיבקו&nbsp; TrypLE Express Enzyme (1X), פנול אדום</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>המשמש כתמיסה המכילה טריפסין, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>חלבון עכבר למינין, טבעי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-017-015</td><td> קפוא aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>25-030-081</td><td>קפוא</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA חיקוי אופק בקרה שלילית</td><td></td><td>CN-001000-01-50</td><td>משוחזר במים נטולי RNase (200 ומיקרו; M),</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p מחקה</td> את <td>Horizon</td><td>C-310564-05-0050</td><td>משוחזר במים נטולי RNase (200 ומיקרו; M), אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>N-2 תוסף</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-103-049</td><td>המשמש למדיום גידול בסעיף 1.1, אחסן ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>C פפאין מערכת דיסוציאציה</td><td>וורת'ינגטון ביוכימית</td><td>LK003153</td><td>משוחזרת בתמיסת המלח המאוזנת של ארל, אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-140-122</td><td>אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין הידרוברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4538-50MG</td><td>משוחזר במים מעוקרים, קפואים כמויות</td></tr><tr><td>רקומביננטיות חלבון BDNF אנושי</td><td>R& D Systems</td><td>248-BDB-050/CF</td><td>שוחזר ב-PBS ו-FBS מעוקרים, עליות קפואות</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי חלבון EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td><td>שוחזר ב-PBS מעוקר, אליקוטים קפואים</td></tr><tr><td>Recombinant Rat GDNF Protein</td><td>Fisher Scientific</td><td>512GF010</td><td>משוחזר ב-PBS מעוקר, מכסות</td></tr> <tr><td>קפואותרודמין אדום 570 - AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד חולדות IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>שקופיות הרכבה בינונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה (ליפופקטמין 3000)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>L3000015</td><td>חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>plasticware/supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L טיפ&nbsp; פילטר סטרילי&nbsp; טיפים לפיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; L טיפ&nbsp; פילטר סטרילי טיפים לפיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L TIP פילטר סטרילי טיפים פיפטה פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 ומיקרו; L טיפ&nbsp; פילטר סטרילי קצות פיפטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות מתכווננות בנפח (2.5, 10, 20, 100, 200 ו-1000 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>צלחות העברה חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מולטיוול עם תחתית שטוחה עם מכסים, מס' בארות = 12</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מולטיוול עם תחתית שטוחה עם מכסים, מס' בארות = 24</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; מסנן סטרילי 10 מ"ל סרולוגי חד פעמי Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; מסנן סטרילי 50 מ"ל צנרת סרולוגית חד פעמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; מסנן סטרילי 5 מ"ל צנרת סרולוגית חד פעמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>כפפות לבחינת ניטריל ללא אבקה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים עגולים (קוטר 12 מ"מ, עובי 0.17 - 0.25 מ"מ)מסנן</td><td></td> ואקום <td>Fisher Scientific</td> 22293232<td></td></tr><tr><td>, גודל נקבוביות = 0.22 ומיקרו; m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Thermo Scientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>זום דו-עיני סטריאו מיקרוסקופ</td><td>Vision Scientific</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים (קוטר 100 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 מלקחיים מעוקלים - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2231000508 מספריים עדינים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים McPherson-Vanas, 8 ס"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>שריון מעבדה לאמבט חרוזי מתכת</td><td></td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>מערבל אגוזים, חשמלי = 115V, 60Hz, מהירות = 24 סל"ד</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מצופה סיליקון (90 מ"מ קוטר)</td> <td>מכשור מערכות חי</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה, כלכלה #5</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 מעטפת מים</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller glia (MG) הם הגליה השולטת ברשתית העצבית ויכולים לתפקד כמקור רגנרטיבי לנוירונים ברשתית. אצל בעלי חוליות נמוכים יותר כגון דגים, התחדשות מונעת MG מתרחשת באופן טבעי; ביונקים, לעומת זאת, נדרש גירוי עם גורמים מסוימים או מניפולציה גנטית/אפיגנטית. מכיוון ש-MG מהווה רק 5% מאוכלוסיית תאי הרשתית, יש צורך במערכות מודל המאפשרות לחקור את אוכלוסיית התאים הזו באופן בלעדי. אחת ממערכות המודל הללו היא תרביות MG ראשוניות הניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן למגוון יישומים, כולל סינון וזיהוי של מולקולות/גורמים, בדיקת תרכובות או גורמים, ניטור תאים ו/או בדיקות פונקציונליות. מודל זה משמש לחקר הפוטנציאל של מורין MG להמיר לנוירונים ברשתית לאחר תוספת או עיכוב של מיקרו-רנ"א (miRNA) באמצעות טרנספקציה של miRNA מלאכותיים או מעכביהם. השימוש בעכברי דיווח ספציפיים ל-MG בשילוב עם תיוג אימונופלואורסצנטי וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אישר כי 80%-90% מהתאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG. באמצעות מודל זה, התגלה כי miRNAs יכולים לתכנת מחדש את MG לתאי אב רשתית (RPCs), אשר לאחר מכן מתמיינים לתאים דמויי נוירונים. היתרונות של טכניקה זו הם שניתן לבחון מועמדים ל-miRNA על יעילותם ותוצאתם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo .

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר P12 וכיצד לתכנת מחדש את התאים האלה עם miR-25 לנוירונים ברשתית באמצעות עכבר הכתב Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. שיטה זו שימשה בעבודה קודמת המדווחת בפירוט על miRNAs מתאימים אחרים (מחקים או מעכבים, כמולקולות בודדות או בשילוב) כדי לתכנת מחדש את MG ל-RPC שמאמצים לאחר מכן את מאפייני התא העצבי27. שיטה זו שונתה כדי לגדל תרביות מהר יותר ובכך למזער את השינויים התאיים הנגרמים על ידי הסביבה המלאכותית לאורך זמן 24,28,29.<sup class="x...

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את הפוטנציאל והיכולת של Muller glia להמיר לתאי אב ברשתית לאחר טיפול בגורמים ספציפיים כגון מיקרו-רנ"א. היתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבחון מועמדים למיקרו-רנ"א על יעילותם ותוצאותיהם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo. מי שיעזור להדגים את ההליך יהיה Seoyoung Kang, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה של סטפני וואהל.ראשית, טבלו את גלגל העין שהוסר לזמן קצר לתוך צינור עם אתנול כדי למנוע נשיאה של חיידקים מהחיה. לאחר מכן, לשטוף את גלגל העין לזמן קצר בצלחת פטרי 10 ס"מ לפני הנחתו לתוך צלחת 24 באר על קרח. לאחר הסרת גלגלי העיניים וניקוים, הניחו עין אחת בכלי הנתיחה הממוקמת מתחת למיקרוסקופ מנתח עם מקור אור.כעת תקן גלגל עין אחד על ידי תפיסת עצב הראייה ורקמת החיבור שמסביב סביב הסקלרה עם מלקחיים עדינים של Dumont 5 ולחץ עליו בזהירות כנגד צלחת הנתיחה. לאחר מכן, צור חור במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 מד כדי לאפשר גישה קלה יותר למספריים הוורידיים. לאחר מכן, נתחו את הקרנית סביב הגוף הציליארי באמצעות מספריים ורידיים והסירו בזהירות את הקרנית, העדשה, הקשתית והגוף הזגוגי בעזרת מלקחיים עדינים של Dumont 5.מאוחר יותר לנתח את הסקלרה עם מספריים ורידיים עד שמגיעים לעצב הראייה ולחלץ בזהירות את הרשתית באמצעות Dumont 5 מלקחיים עדינים. עכשיו להשתמש השני Dumont 5 מלקחיים עדינים לדחוף נגד הרשתית לחלוטין להסיר את הגוף הזגוגי. מעבירים את הרשתיות לחתוך כ 2.5 ס"מ של קצה פיפטה העברה סטרילית כדי להגדיל את הקוטר.כעת, בעזרת קצה זה, הרימו רשתיות שלמות מבלי לפגוע ברקמה והעבירו את הרשתיות לצלחת פטרי סטרילית חדשה עם HBSS קר ונדנדו את המנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה סטרילית חדשה, דחפו בזהירות את הרשתיות מסביב כדי לשטוף את תאי אפיתל פיגמנט הרשתית. מיד מניחים את הרשתית המבודדת בבאר נקייה חדשה של צלחת 24 הבאר המלאה במיליליטר אחד של HBSS תוך שמירה על צלחת 24 הבאר על הקרח במהלך הנתיחה.הכינו את תערובת הדיסוציאציה של פפאין DNase I כמתואר בכתב היד. עכשיו עם פיפטה העברת קצה מוגדל, להרים את הרשתיות. המתן עד שהרשתיות ישקעו בתחתית הקצה ושחרר את הרשתיות ללא HBSS מוגזם לתוך הצינור המכיל תערובת פפאין DNase I.לאחר מכן, מניחים את הצינור על נוטור באינקובטור ודוגרים במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ועם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לנתק את התאים על ידי pipetting בזהירות למעלה ולמטה עם פיפטה מיליליטר אחד. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 275 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז אובומוקואידי מתוך ערכת הדיסוציאציה של פפאין כדי לנטרל את הפפאין ולערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.מכניסים צינורות לתוך צנטריפוגה ומסתובבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות בעוצמה צנטריפוגלית יחסית של 300. הוסף את גורם הצמיחה האפידרמלי לנפח המחושב של מדיום הצמיחה שהתחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה.מבלי לגעת בכדור שבתחתית הצינור, יש להסיר את הסופר-נטנט בזהירות ובאופן מלא. עכשיו להשעות את גלולת התא עם 500 microliters של גורם גדילה אפידרמלי בתוספת מדיום גדילה. לאחר מכן, העבר את מתלה התא לבאר אחת של צלחת 12 הבאר המסומנת.שטפו את הצינור בעוד 500 מיקרוליטרים של גורם הגדילה האפידרמלי בתוספת מדיום גדילה והוסיפו אותו לבאר. נדנדו את צלחת הבאר בזהירות ואז הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם פחמן דו חמצני. התחל על-ידי בדיקת מפגש תאים של 90% עד 100%.לאחר מכן, להסיר את המדיום ולהוסיף מיליליטר אחד של HBSS קר לשטוף את הבאר. נדנדנדו בעדינות את הצלחת והסירו את HBSS ללא עקבות שנותרו. מאוחר יותר, להוסיף 500 microliters של טריפסין מחומם מראש המכיל תמיסה כדי לנתק את התאים מן הבאר.רוק בעדינות ודגרה במשך שתי דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העברת הצלחת מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגי, שאפו את התמיסה המכילה טריפסין תוך כדי הטיה. פזרו אותו בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין.לאחר מכן, להעביר את זה השעיה התא צינור סטרילי 1.5 מיליליטר ולשים צינורות לתוך צנטריפוגה. סובבו 300 פעמים גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזירו צינורות לארון הבטיחות הביולוגי. יש להסיר את הסופר-נטנט מבלי לגעת בכדור.כעת יש להשעות בזהירות את גלולת התא על ידי הוספת 600 מיקרוליטרים של מדיום גדילה שחומם מראש וצינורות למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים. לבסוף, זרע 100 מיקרוליטר של ההשעיה התא המתקבל במרכז שישה תלושי כיסוי מצופים של צלחת 24 באר. הניחו את הצלחת על האינקובטור ותנו לתאים להסתפק בטרנספקציה הבאה באמצעות חיקוי מיקרו-רנ"א.האיור מראה תנאי בקרה חמישה ימים לאחר ההעברה עם כמה תאים חיוביים Ascl1-Tomato נוכחים. עם זאת, לאחר טיפול miR-25, נמצאו תאים חיוביים רבים נוספים של Ascl1-Tomato. הכימות גילה עלייה של פי ארבעה במספר התאים החיוביים Ascl1-Tomato בבארות שטופלו ב-miR-25 בהשוואה לקבוצת הביקורת.והכי חשוב, הרוב המכריע של התאים החיוביים Ascl1-Tomato שנמצאו בבארות שטופלו ב-riR-25 אימצו מורפולוגיה עצבית. תכונות של מורפולוגיה עצבית זו כללו גודל סומה תא מופחת, פיתוח של תהליכים עדינים והיווצרות של רשתות זעירות. הכימות גילה כי כ-70% מכל התאים החיוביים ל-Ascl1-Tomato היו בעלי תכונות עצביות.תיוג אימונופלואורסצנטי מראה כי תאים חיוביים Ascl1-Tomato עם מורפולוגיה עצבית מבטאים את הסמנים העצביים OTX2 ו- MAP2, המאשרים את הזהות העצבית. הכימות של תאים אלה גילה כי לאחר ביטוי יתר של miR-25, קיימים כ-40 תאי עצב חיוביים ל-Ascl1-Tomato לכל שדה, בהשוואה לחמישה תאים עצביים לכל שדה בבקרות. תאי העצב שזוהו מהווים כ-70% מכלל אוכלוסיית התאים החיוביים Ascl1-Tomato של דגימות miR-25 שטופלו.יתר על כן, כימות המספר המוחלט של תאי עצב בעלי ביטוי משותף של OTX2 ו-MAP2 הראה כי לאחר טיפול ב-miR-25, נמצאו כ-60 תאי עצב לכל שדה, לעומת 10 נוירונים לכל שדה בבקרות. חובה לעבוד בסביבה נקייה ומחוטאת עם כלים נקיים וסטריליים ולעבוד בזהירות על ידי הימנעות מכל טיפול קשה. יישומים במורד הזרם יכולים להיות, למשל, כימות חלבונים, ניתוח DNA או RNA, או מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.טכניקה זו סייעה לנו לחקור שאלות ראשוניות על תכנות מחדש גרעיני השייך לתחום הרפואה הרגנרטיבית. ויש מגוון רחב של גורמים ותנאים שניתן לבחון על מנת לחקור שאלות חדשות.

primary-cell-cultures-to-study-regeneration-potential-murine-mller

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

סרטון זה מדגים את הרבייה של תאי גליה מולר (MG) שבודדו מרשתיות עכבר. הרשתית מנותקת לתרחיף חד-תאי באמצעות אנזימי עיכול. לאחר מכן מגדלים תאים בתווך עם גורם גדילה המקדם התרבות תאי MG ותמותת תאים עצביים. תאי עצב מתים מוסרים תוך כדי מעבר, ותאי MG גדלים לניתוח נוסף.

הקמת תרבית תאי גליה מולר המתקבלת מרשתיות עכבר

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

למדו כיצד להמיר תאי גליה מולר לתאי תחילית רטינליים באמצעות טיפול במיקרו-רנ"א בתרביות תאים ראשוניות. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות הרכבות מיקרו-רנ"א לפני יישומים אינ-ויוו בחקר הרטינה.

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

גלה סרטונים נוספים