Name: זיהוי זן וולבציה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למדו ארבע שיטות לזיהוי חיידקי Wolbachia בתאי Aedes albopictus באמצעות מיקרוסקופיה, PCR ואימונופלואורסצנציה. פרוטוקול זה משפר את הדיוק בזיהוי זיהומים תוך-תאיים ותומך במחקר אינטראקציות מארח-פתוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר שין-רו וואנג מאוניברסיטת מינסוטה על הצעות והדרכה תובנות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81760374).

1. חומרים וריאגנטים
<ol><li>השתמש בתמיסות ובמדיה ללא פירוגן עבור תרבית תאים (ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>השתמש במים אולטרה-פורים כדי להכין את כל הפתרונות.</li>
	<li>היזהרו בבחירת סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית תאים, לאחר תהליך בדיקה רב. הערה: מכיוון שהרבה FBS כפופים לשינויים קבועים, אי אפשר לציין את הקטלוג הרלוונטי ואת מספרי המגרשים בפרוטוקול זה.</li>
	<li>זני תאי Aa23 נבחרים שמקורם בביצי A. albopictus, המתאימים ל-Aa23-T נטול וולבצ'יה.</li>
</ol>2. תרבית תאים
<ol><li>הכינו 25 ס"מ2 צלוחיות תרביות תאים עם 4 מ"ל של המדיום של שניידר עם 10% FBS.</li>
	<li>דגירה של הצלוחיות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת לאטמוספירה של 5% CO2 למשך 5 עד 7 ימים 7,24.</li>
	<li>התבוננו בתאי Aa23 ו-Aa23-T לא מוכתמים בצלוחיות באמצעות מיקרוסקופיית אור בהגדלה של פי 100 (איור 1).</li>
</ol>3. מיצוי דנ"א
<ol><li>תרבית את התאים למשך 5-7 ימים עד 70-80% מפגש לכל בקבוקון (שלב 2). קציר את התאים עם צנרת ידנית מ 1 מ"ל של מדיום תרבית resuspended על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 100 × גרם ב microcentrifuge.</li>
	<li>הסר את ה-supernatant לפי שאיפה ואחסן את גלולת התא שנוצרה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).</li>
	<li>בצעו החייאה של הכדורים ב-0.40 מ"ל של מלחים עם מאגר פוספט (PBS), הניחו 50 μL של התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסיפו 5 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) ודגרו ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לבסוף, חממו את הצינורות האלה בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשיג את הדנ"א הגולמי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. זיהוי חומצת גרעין וולבצ'יה
<ol><li>ניתוח PCR<ol>
<li>בצע PCR בנפח תגובה כולל של 20 μL, המכיל 8 μL של ddH2O, 10 μL של Taq פולימראז (ראה טבלת החומרים), 1 μL של תבנית DNA (משלב 3), 0.5 μL של פריימרים קדימה ואחורה (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC AGAAAC 3') ו - wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, בהתאמה.</li>
		<li>השתמש בתנאי ה- PCR הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 95 ° C למשך 5 דקות, ואחריה 35 מחזורים של דנטורציה ב - 94 ° C, חישול ב - 55 ° C, והרחבה ב - 72 ° C; לאחר מכן, הארכה סופית ב 72 °C (72 °F) למשך 7 דקות.</li>
		<li>זהה את הדנ"א על ג'ל אגרוז של 1% (1% w/v agarose ב-PBS) באמצעות מצלמת ג'ל.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח qPCR<ol>
<li>נתח את עותק הגנום של וולבצ'יה עבור שלושה שכפולים ביולוגיים (n = 6) מהדנ"א שחולץ (שלב 3) באמצעות פריימרים wsp 183 F (5' AAGGAACCGAGAAGTTCATG 3') ו - QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, מנורמל עם חלבון ריבוזומלי S6 (RPS6) פריימרים קדימה ואחורה (5' GAAGTTGAGAACGTATCGTTTC 3' ו- 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', בהתאמה)3.</li>
		<li>צור עקומה סטנדרטית עבור wAlbB ו- RPS6.<ol>
<li>חלצו דנ"א מ-PMD-18T (וקטור מיוחד לשיבוט יעיל של תוצרי PCR (שיבוט TA)) רקומביננטי פלסמיד המכיל מקטעי גנים wsp ו-rps6 (קובץ משלים) ומדדו את ריכוז הדנ"א של הפלסמיד (ראו טבלת החומרים).</li>
			<li>המרת ריכוז הדנ"א של הפלסמיד להעתקת ריכוז המספרים באמצעות Eq (1). מספר עותק של פלסמיד = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>דיללו את מספר העתק הפלסמיד מ-101 עד 108 במים אולטרה-פוריים, וקחו 3 שכפולים לכל שיפוע ריכוז.</li>
			<li>בצע הגברת qPCR באמצעות TB Green ומערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת החומרים), ותעד את התוצאות של כל תגובה. השתמש בערך Ct כדי לפתח עקומה סטנדרטית. נתחו את הדנ"א בנפח תגובה כולל של 20 μL, הכולל 7 μL של ddH2O, 10.4 μL של TB Green (ראו טבלת החומרים), 1 μL של תבנית DNA (המסופקת על ידי שלב 3) ו-0.8 μL של פריימרים קדימה ואחורה (10 μM). השתמש בתנאי התגובה הבאים: דנטורציה ראשונית בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות, וחישול ב-60 מעלות צלזיוס במשך 35 שניות.</li>
			<li>חשב את מספרי העתקת הגנים WSP ו- RPS6 בתאים על פי עקומת התקן שנקבעה והצפיפות היחסית של וולבצ'יה לפי מספר העותק של wsp/RPS6. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t דגימות עצמאי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח כתמים מערביים של חלבון וולבצ'יה<ol>
<li>מיצוי חלבונים<ol>
<li>אסוף 2 × 107 תאי Aa23 ו- Aa23-T מלוח ששת הבארות (משלב 2) בצינור microcentrifuge, שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS, וצנטריפוגות אותם ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>הכינו 1 מ"ל ליזאטים עם מאגר ליזה RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% נתרן דאוקסיכלאט, 0.1% נתרן דודציל סולפט [SDS], 2 mM נתרן פירופוספט, 25 mM β-גליצרופוספט, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין) ו-PMSF (ריכוז סופי של 1 mM).</li>
			<li>הוסיפו 200 μL של חיץ ליזיס לכדור התא ושמרו במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה את הליזאטים ב 12,000 × g במשך 10 דקות ב 4 °C (74 °F) ולהסיר את supernatant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בדקו את ריכוז ה-wsp של ה-supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבונים של חומצה ביצ'ינצ'ונינית (BCA) (ראו טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>טען כמויות שוות של חלבון על ג'ל SDS-PAGE של 15% [10% מים מזוקקים; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% אמוניום פרסולפט), 0.04% TEMED].</li>
		<li>מעבירים את החלבון לממברנות ניטרוצלולוז, חוסמים את הממברנות עם 5% חלב דל שומן למשך 2 שעות 26,27 בטמפרטורת החדר, ואז שוטפים את הממברנות שלוש פעמים עם TBST (1 מ"ל של Tween 20 ב-1 L של TBS) (ראו טבלת החומרים).</li>
		<li>דגירה של הממברנות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם 100 μL של נוגדן פוליקלונלי נגד wsp (מוכן בתוך הבית, ראה קובץ משלים)), שהוכן על ידי דילול הנוגדן העיקרי עם 5% חלב דל שומן (1:12,000).</li>
		<li>לשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים עם TBST.</li>
		<li>דגירה של הממברנות ב-100 μL של נוגדן משני מצומד חזרת (HRP) על שייקר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST, ולערבב 20 μL של פתרון A (HRP מצע לומינול מגיב) ו 20 μL של פתרון B (HRP מצע פרוקסיד מגיב) בערכת זיהוי chemiluminescence ביחס של 1:1. לטבול את כל הממברנה לתוך תמיסת luminescence באותו זמן, ולצפות באותות באמצעות מערכת הדמיה רב תכליתית.</li>
	</ol></li>
	<li>לוקליזציה אימונופלואורסצנטית של חלבון וולבצ'יה<ol>
<li>דגירה 5 × 105 תאי Aa23 ו-Aa23-T בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על צלחת פטרי קונפוקלית בלייזר בעובי של 0.17 מ"מ בתחתית, תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 3 עד 4 ימים 7,24. המתן עד שהתא יהיה 60%-70% מפגש ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
		<li>תקן את התאים במשך 20 דקות ב 4 °C ב 1 מ"ל של 4% (w / v) paraformaldehyde ב- PBS.</li>
		<li>שטפו את התאים הקבועים באמצעות PBST (0.2% v/v Triton X-100 ב-PBS) למשך 5 דקות ושטפו את התאים שוב פעמיים עם PBS.</li>
		<li>דגירה של השקופיות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-1 מ"ל של 3% (w/v) אלבומין בסרום בקר ב-PBS.</li>
		<li>דגירה של המגלשות למשך הלילה ב-100 μL של נוגדנים פולישבטיים נגד wsp של עכברים (מוכנים בבית) וסרום עכברים (דילול של 1:1,000 ב-PBS) בקופסה רטובה (היא יכולה לשמור על לחות ולמנוע אידוי לחות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הסר את המגלשות מהקופסה הרטובה והחזיר אותן לטמפרטורת החדר; לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS ולהסיר את PBS. הערה: משלב 4.4.7 ואילך, יש להגן על כל הפעולות מפני אור.</li>
		<li>הדגירה של המגלשות עם 100 μL של נוגדן אלקסה פלואור 488-מצומד נגד עכברים (1:2,000 דילול ב-PBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>דגירה של שקופיות הדגימה עם 50 מיקרול של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI מדולל ב-PBS ל-10 מיקרוגרם/מ"ל, נקשר חזק לדנ"א) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז שטפו אותן שלוש פעמים עם PBS.</li>
		<li>התבונן בכישרון החיסוני תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.<ol>
<li>הפעל את הכוח ואת הלייזר.</li>
			<li>הפעל את המנורות הרגילות והכספית של המיקרוסקופ.</li>
			<li>הפעל את המערכת והפעל את תוכנת ההפעלה. שים טיפה של שמן ארז על שקופיות הדגימה, מקם את שקופיות הדגימה על שלב המיקרוסקופ, והזיז את הבמה למיקום המתאים.</li>
			<li>לחצו על כפתור התצפית של מנורת הכספית בתוכנה, פתחו את תריס מנורת הכספית והתבוננו בדגימה מתחת למיקרוסקופ הפוך כדי להתמקד.</li>
			<li>השתמש בלוח הבקרה הידני כדי לבחור פלואורסצנציה ירוקה וכחולה כדי לצלם תמונות פלואורסצנציה תחת הגדלה של פי 100.</li>
			<li>כבו את כפתור התצפית על מנורת הכספית והתחילו לרכוש תמונות.</li>
			<li>כדי להבטיח איכות תמונה טובה, סרוק מראש לפי גודל סריקה (512 פיקסלים x 512 פיקסלים). התאם את גודל הסריקה כדי לקבל תמונות ברורות (1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים).</li>
			<li>בצע הפחתת רעש אם רעשי הרקע גבוהים מדי.</li>
			<li>הפסק לסרוק ולשמור את התמונות.</li>
			<li>כבו את מנורת הכספית והלייזרים.</li>
			<li>נגב את המטרה עם 75% אלכוהול והורד את המטרה למיקום הנמוך ביותר.</li>
			<li>כבו את עוצמת התריס והמיקרוסקופ.</li>
			<li>לאחר שהמכשיר התקרר, מכסים אותו בכיסוי האבק.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Patholology%22%5BJournal%5D)">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li>
<li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biologial+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li>
<li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li>
<li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li>
<li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evoution%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li>
<li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li>
<li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+Developmental+Biology+-+Animals%22%5BJournal%5D)">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li>
<li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+species+are+infected+with+Wolbachia%3F-A+statistical+analysis+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li>
<li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%3A+master+manipulators+of+invertebrate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li>
<li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li>
<li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neill%2C+SL+%22Influential+passengers%3A+inherited+microorganisms+and+arthropod+reproduction%22">Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction</a>. , Oxford University Press. (1997).</li>
<li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+insecticides%3A+new+thinking+on+an+ancient+problem%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li>
<li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li>
<li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li>
<li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).</li>
<li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).</li>
<li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue%2C+Chikungunya%2C+and+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li>
<li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).</li>
<li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase%2C+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li>
<li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li>
<li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).</li>
<li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).</li>
<li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Royal+Society+Publishing.+Proceedings+B%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li>
<li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li>
<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

זיהוי של זיהום וולבצ'יה תוך-תאי חיוני לחקר אינטראקציות וולבצ'יה-מארח ולאישור של טרנספקציה מוצלחת של תאים עם זנים חדשים. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי ברמות חומצת הגרעין והחלבון. ארבע שיטות ניסיוניות אלה אימתו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של תאים. 
PCR שימש לזיהוי נוכחות של זיהום וולבצ'יה של תאים ברמת חומצת הגרעין. עם זאת, מכיוון שהוא אינו מכמת את רמות הזיהום28,29,...

יתוש הטיגריס האסייתי Aedes albopictus (Skuse) (דיפטרה: Culicidae), שהוא וקטור מפתח של נגיף הדנגי (DENV) באסיה ובחלקים אחרים של העולם1, הוא מארח טבעי של שני סוגים של החיידקים התוך תאיים, וולבצ'יה (wAlbA ו-wAlbB), המופצים לאורך קו הנבט והרקמה הסומטית 2,3. קו התאים Aa23 שמקורו בעוברי A. albopictus מורכב משני סוגי תאים מורפולוגיים לפחות, שניהם תומכים בזיהום4 וניתן לרפא אותם מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה (Aa23-T). בהתחשב בכך ש- Aa23 שומר רק על wAlbB, זהו מודל שימושי לחקר אינטראקציות פונדקאי-אנדוסימביונט 4,5,6.
וולבצ'יה מועברת באופן אימהי ומדביקה כ-65% ממיני החרקים 8,9 ו-28% ממיני היתושיםבני 10. הוא מדביק מגוון רקמות ויוצר מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארח, בדרך כלל גורם לחוסר תאימות ציטופלסמית (CI)11 ולהחלפת אוכלוסייה על ידי מניפולציה של מערכת הרבייה המארחת 12,13. תגובות פונדקאיות אלה נצפו באוכלוסיות טבעיות של דרוזופילה סימולנס14 וב-A. aegypti בכלוב מעבדה ובניסוי שדה15. מניפולציה לא-רבייתית חשובה שנוצרה על ידי וולבצ'יה היא עמידות מארח מושרית למגוון פתוגנים, כולל DENV, נגיף צ'יקונגוניה (CHIKV) ונגיף הנילוס המערבי (WNV)16,17, שעשוי להיות מתווך על ידי מערכת חיסונית מולדת משופרת של הסימביונט18,19, תחרות בין וולבצ'יה לנגיפים על משאבים מארחים חיוניים20, ומניפולציה של מסלולי הגנה נגיפיים מארחים21 .
פרוטוקול זה פותח לחקר המנגנונים הבסיסיים האלה של תגובות אנטי-ויראליות של פונדקאי המושרה על-ידי וולבצ'יה. הוא משתמש בארבע שיטות לגילוי של זיהום וולבצ'יה תוך תאי של תאי Aa23. שיטות אלה מספקות בסיס תיאורטי חזק למחקרים על זיהום וולבצ'יה תוך-תאי של מינים מארחים אחרים. השיטה הראשונה, PCR - טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הגברה אנזימטית של אזורים ספציפיים בדנ"א מבלי להשתמש בהליכי שיבוט קונבנציונליים - שימשה לאיתור דנ"א של וולבצ'יה ולקבוע את נוכחותו/היעדרו של זיהום וולבצ'יה 22. השיטה השנייה מודדת את צפיפות העתקת הדנ"א של וולבצ'יה באמצעות PCR כמותי (qPCR) לזיהוי ומדידה אמינים של מוצרים שנוצרו במהלך כל מחזור PCR, אשר פרופורציונלי ישירות לכמות התבנית לפני PCR23. השיטה השלישית מזהה נוכחות של חלבוני וולבצ'יה תוך-תאיים, תוך שימוש בכתם מערבי - אחד הכלים החזקים ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בתערובות מורכבות על ידי שילוב של כוח ההפרדה הגבוה של אלקטרופורזה, הספציפיות של נוגדנים ורגישות של תגובות אנזימטיות כרומוגניות. השיטה הסופית היא בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA) המשלבת אימונולוגיה, ביוכימיה ומיקרוסקופיה כדי לזהות את חלבון פני השטח של וולבצ'יה (wsp) באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדן כדי לאשר את הספיגה התאית של וולבצ'יה ולקבוע את לוקליזציה התאית שלה.
מאמר זה מתאר את ארבע השיטות המפורטות לעיל כדי לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם וולבצ'יה האקסוגנית עברה בהצלחה טרנספקציה והוולבצ'יה בתא נוקתה. לאחר קביעה אם וולבצ'יה קיימת בתאים או לא, ניתן לבצע מגוון ניתוחים שונים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מטבוליקה. פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי של וולבצ'יה באמצעות תאי Aa23, אך ניתן להשתמש בו גם בתאים אחרים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר סייטיפיק</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>פיפטמן</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis תוכנה</td><td>שפותחה על ידי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerium מסומם איטריום אלומיניום נופך</td><td>MSE אספקה</td><td></td><td>Ce: Y3Al5O12, YAG מצעי גביש יחיד</td></tr><tr><td>מחזיק שבב</td><td>שפותח בבית</td> תוכנת בקרה שפותחה <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> בבית <tr><td>שמן טבילה</td><td>מעבדות Cargille</td><td>16482</td><td>סוג A צמיגות נמוכה 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX פלטפורמת inSituX</td><td>שפותחה</td><td></td><td></td>בבית</tr><tr><td>מקור אור IR&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED עם עדשת זכוכית, 1085 ננומטר, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>טבעת חיצונית&nbsp;</td><td>לייזר משאבה שפותח</td><td></td><td></td>בחברה</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 ננומטר, 400 מגה-וואט, ואוסלאש; 9 מ"מ, קוד סיכה E, דיודת לייזר</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבעת שמירה</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 טבעת שמירה עבור &Oslash; צינורות עדשה ותושבות 1 אינץ'</td></tr><tr><td>קריסטל קוורץ ללא זרעים</td><td>ופלים של אוניברסיטת בע"מ.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>קוטר 25.4 מ"מ חיתוך Z עובי 0.05 מ"מ פוליש צד כפול 8 מ"מ על -</td></tr><tr><td>X Shim</td><td>פיתח</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בבית עצירת קרן רנטגן</td><td>פותח</td><td></td><td></td> בבית</tr></tbody></table>

זיהוי זן וולבצ'יה walbb ב aedes albopictus קווי תאים

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

כאנדוסימביונטית בעלת נמל אימהי, וולבצ'יה מדביקה שיעורים גדולים של אוכלוסיות חרקים. מחקרים דיווחו לאחרונה על ויסות מוצלח של העברת נגיפי RNA באמצעות יתושים שעברו טרנספקציה של וולבצ'יה. אסטרטגיות מרכזיות לשליטה בווירוסים כוללות מניפולציה של רבייה של מארח באמצעות אי-תאימות ציטופלסמית ועיכוב של תעתיקים נגיפיים באמצעות תעתיקים חיסוניים ותחרות על משאבים שמקורם במארח. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של התגובות של יתושים שעברו וולבצ'יה לזיהום ויראלי אינם מובנים היטב. מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי במבחנה של זיהום וולבצ'יה ברמות חומצת הגרעין והחלבון בתאי Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 כדי לשפר את ההבנה של יחסי הגומלין בין וולבצ'יה לבין וקטורים החרקים שלה. באמצעות שימוש משולב בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי, כתם מערבי ושיטות אנליטיות אימונולוגיות, תואר פרוטוקול מורפולוגי סטנדרטי לזיהוי תאים נגועים בוולבצ'יה שהוא מדויק יותר משימוש בשיטה אחת. גישה זו עשויה להיות מיושמת גם על זיהוי של זיהום וולבצ'יה בטקסות חרקים אחרות.

לפני שוולבצ'יה זוהתה, תאי Aa23 ו-Aa23-T נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-Aa23-T יש לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך אין הבדל מורפולוגי ברור בין שני סוגי התאים (איור 1). כאן, תאי Aa23 שימשו כמערכת מודל לזיהוי זיהום וולבצ'יה באמצעות ארבע שיטות. הגברה חיובית של הגן Wolbachiawsp באמצעות פריימרים אבחנתיים 81F/691R הייתה אפשרית בתאי Aa23 (נתיבים 1 ו-2) אך לא בתאי Aa23-T (נתיבים 3 ו-4) (...

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ'יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

פרוטוקול זה מסייע לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, המהווה את הבסיס להבנת האינטראקציה בין וולבצ'יה לפונדקאי שלה. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי, אשר אימת ושיפר את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של תאים. המדגים את ההליך יהיה Qiuqiu Xiao, בוגר תואר שני מהמעבדה המרכזית לביולוגיה ומאפיינים מודרניים של פתוגנים.התחל על ידי התבוננות בתאי Aa23 ו- Aa23-T שאינם מוכתמים בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ אור. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-70%-80% מפגש לכל בקבוקון. באמצעות פיפטה, להעביר 1 מ"ל של מדיום התרבית לצינור microcentrifuge.צנטריפוגה ב 100 RCF במשך חמש דקות כדי לקצור את התאים. הסר את הסופרנטנט ואחסן את גלולת התא המתקבלת במינוס 20 מעלות צלזיוס. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-90%-100% מפגש לכל בקבוקון.החזירו את הכדורים ב-0.40 מ"ל של PBS והעבירו 50 מיקרוליטרים של פתרון זה לצינור מיקרו-סנטריפוג'. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינז K ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן דגירו את הצינורות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשיג את הדנ"א הגולמי ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.כדי לבצע PCR, הכינו תערובת תגובה כוללת של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. זהה את הדנ"א על ג'ל אגרוז 1% באמצעות מדמה ג'ל. בצע הגברה כמותית של PCR באמצעות TB Green במערכת PCR בזמן אמת ורשום את התוצאות של כל תגובה.נתחו את הדנ"א בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR הכמותיים כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את מספרי העתקת הגנים WSP ו- RPS6 בתאים על פי עקומת התקן שנקבעה. לאחר מכן חשב את הצפיפות היחסית של וולבצ'יה לפי מספר העותק של wsp/RPS6.נתח את הנתונים באמצעות מבחן t דגימות עצמאי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכדור התא ודגרו על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הליזאטים ב 12, 000 RCF במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשאוף את supernatant.נתחו את ריכוז ה-wsp של ה-supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, בהתאם להוראות היצרן. טענו כמויות שוות של חלבון על ג'ל SDS-PAGE של 15%. מעבירים את החלבון לקרומי ניטרוצלולוז וחוסמים את הקרומים עם 5% חלב דל שומן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר מכן לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST. דגירה של הממברנות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן פוליקלונלי נגד wsp שהוכן על ידי דילול הנוגדן העיקרי עם 5% חלב דל שומן. לשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים עם TBST.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מצומד של חזרת פרוקסידאז לממברנות והדביקו אותו על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST ולערבב 20 microliters של פתרון A ו 20 microliters של פתרון B בערכת זיהוי chemiluminescence ביחס של אחד לאחד. לטבול את כל הממברנה לתוך תמיסת luminescence בו זמנית ולצפות באותות באמצעות מערכת הדמיה רב תכליתית.על צלחת פטרי קונפוקלית בלייזר, הדגירה של תאי Aa23 ו-Aa23-T למשך שלושה עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי. כאשר התא מגיע למפגש של 60 עד 70%, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לתקן את התאים במ"ל אחד של 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.שטפו את התאים הקבועים באמצעות PBST במשך חמש דקות ושטפו מחדש את התאים פעמיים באמצעות PBS. הדגירה של צלחת הפטרי במ"ל אחד של אלבומין בסרום 3% בקר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים לשקופיות 100 מיקרוליטרים של נוגדנים פוליקלונליים נגד wsp עכברים וסרום עכברים ומדגרים אותו למשך הלילה בקופסה רטובה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.מוציאים את צלחת הפטרי מהקופסה הרטובה ומחזירים אותה לטמפרטורת החדר. לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS ולהסיר את PBS. הגן על ההליכים הבאים מפני אור.הדגירו את צלחת הפטרי עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן נגד עכברים מצומדים של אלקסה פלואור 488 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. דגירו את צלחת הפטרי לדוגמה עם 50 מיקרוליטרים של DAPI מדוללים ב-PBS ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואז שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS. התבונן בכישרון החיסוני תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.לפני גילוי וולבצ'יה, נצפו תאי Aa23 ו-Aa23-T תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-AA23-T היו לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך לא נצפו הבדלים מורפולוגיים נראים לעין בין שני סוגי התאים. באמצעות פריימרים אבחנתיים 81F/691R, הגברה חיובית של הגן Wolbachia wsp זוהתה בתאי Aa23 אך לא בתאי Aa23-T.הניתוח של צפיפות וולבצ'יה בקווי התאים הראה יחס wsp/rps6 של 2.4 בתאי Aa23 אך ללא וולבצ'יה בתאי Aa23-T. ניתוח כתמים מערביים של תמציות חלבון הראה אות wsp חזק עבור Aa23, אך לא זוהה אות עבור Aa23-T. בדיקת האימונופלואורסצנציה העקיפה זיהתה את חלבון ה-wsp בתאי Aa23, בעוד שרק דנ"א מוכתם ב-DAPI זוהה בתאי Aa23-T.ודא שבקבוקי התרבית דוגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי למשך חמישה עד שבעה ימים. הליך זה יכול להיות מלווה במיקרוסקופיית אלקטרונים שבה יש לשים לב במיוחד להכנת דגימה ולחתך. ארבע השיטות הניסוייות ששימשו במחקר זה אישרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה בתאים, אשר חל גם על סוגים אחרים של תאים ורקמות.

detecting-wolbachia-strain-walbb-in-aedes-albopictus-cell-lines

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Wolbachia זיהום חיידקי ב תסיסנית

וידאו זה מתאר שיטה לטיהור Wolbachia pipientis מקו תא אנופלס gambiae ואז culturing endosymbiont במדיום הסלולרי חינם. Assay עבור הכדאיות של החיידק הוא הוכיח.

שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם

ניתוחי RNA-Seq הופכים חשובים יותר ויותר לזיהוי היסודות המולקולריים של תכונות הסתגלות באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, מתואר פרוטוקול לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין יתושי Aedes albopictus שאינם דיאפאוזה, מגידול יתושים, ועד לריצוף RNA וניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני RNA-Seq.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia שוחררו לאוכלוסיות טבעי לדכא את השידור של arboviruses. אנו מתארים שיטות האחורי Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia במעבדה ניסויים ולשחרר שדה, נקיטת אמצעי זהירות כדי למזער את עיבוד מעבדה ובחירה.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים זיהום ויראלי ויוו דרוזופילה melanogaster באמצעות שיטת ננו-הזרקת טכניקות בסיסיות כדי לנתח וירוס-פונדקאי אינטראקציה.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

פרוטוקול לתרבות הטפיל המיקרו-ספיורידיאן אדהאזרדיה אדיס. הטפיל הוא מעבר מדור אחד של יתושי Aedes aegypti למשנהו באמצעות העברה אופקית בשלב הזחל ואחריו שידור אנכי בשלב המבוגר. נבגים חיים שורדים לטווח ארוך בביצים נגועות.

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

קהילות מיקרוביאליות ביתושים טומנות בחובן הבטחה גדולה לאסטרטגיות הדברה ביולוגית וקטורית. רוב הסימביונטים אינם ניתנים לטיפוח, ודורשים ניתוחים מטגנומיים. אנו מתארים שיטה לנתח נקבות יתושים ולהפריד בין השחלות, המעי התיכון ובלוטות הרוק למניעת זיהום צולב, להקל על מחקרי מיקרוביום ברמת האיברים, ולשפר את ההבנה של תפקידי המיקרואורגניזמים בביולוגיה של יתושים.

דיסקציה של שחלות יתושים, מעי האמצע ובלוטות הרוק לצורך ניתוח מיקרוביום ברמת האיברים

קווי תאים שימושיים במחקרים על אורגניזמים תוך-תאיים שלא ניתן לגדל מחוץ לתאים המארחים שלהם. למרות שקווים נגועים בוולבכיה אפשרו תגליות רבות, ההטרוגניות בתוך קווים אלה יכולה להוביל לתוצאות ניסוי משתנות. אנו מציגים פרוטוקול ליצירת שיבוטים של תאים בודדים ותרביות רציפות מתאי JW18 נגועים בוולבכיה.

יצירת תרביות חד-שבטיות מקו התאים של Drosophila melanogaster JW18 נגוע בוולבכיה

למדו ארבע שיטות לזיהוי חיידקי Wolbachia בתאי Aedes albopictus באמצעות מיקרוסקופיה, PCR ואימונופלואורסצנציה. פרוטוקול זה משפר את הדיוק בזיהוי זיהומים תוך-תאיים ותומך במחקר אינטראקציות מארח-פתוגן.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

גלה סרטונים נוספים