ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות
28 באפריל 2022
ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.
פיזור אחורי של נייטרונים מודד דיפוזיה גלובלית ודינמיקה פנימית של חלבונים ומי הידרציה ללא נזקי קרינה. ספקטרוסקופיית נייטרונים ניגשת בו זמנית למתאמים מרחביים ובזמן ברמה המולקולרית. בחומר רך ובחומרים ביולוגיים, מעניין במיוחד לקבל מידע עקיף על הסדר המקומי על מערכות אי-סדר ארוכות טווח אלה.
לכן ניתן להשתמש בפיזור לאחור של נייטרונים כדי לחקור דינמיקה בביולוגיה, כימיה או חוש חומרי. תחום חזק נוסף הוא אנרגיה, עם מחקרים, למשל, על סוללות ותאי דלק. פיזור לאחור של נייטרונים שימש בהצלחה לחקר הדינמיקה המולקולרית של חלבונים המעורבים במחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר ופרקינסון.
התוצאות המתקבלות עוזרות לנו להבין טוב יותר את סימני ההיכר המולקולריים של פתולוגיות אלה ועשויות לסלול את הדרך לפיתוח אבחון טוב יותר. כדי להכין את מחזיק הדגימה, התחל על ידי ניקוי יסודי של מחזיק דגימת אלומיניום שטוח ואטם חוט אינדיום שלו וברגים עם מים, ולאחר מכן אתנול, ולאחר מכן לתת לו להתייבש. שקול את החלקים השונים של מחזיק הדגימה, כולל התחתית, המכסה וחוט האינדיום, בנפרד על איזון מדויק.
הניחו את אטם חוט האינדיום במילימטר אחד בחריץ של החלק התחתון של מחזיק הדגימה, והשאירו חפיפה קטנה במקום שבו שני הקצוות מתחברים. הוסף סביב 100 מיליגרם של חלבון lyophilized כך שהוא ממלא את פני השטח הפנימיים של החלק התחתון של מחזיק הדגימה. לאחר מכן, הניחו את מחזיק הדגימה במייבש עם צלחת פטרי המכילה אבקת תחמוצת זרחן למשך 24 שעות כדי לייבש לחלוטין את אבקת החלבון.
שקול את החלק התחתון המיובש של מחזיק הדגימה המכיל את חותם האינדיום ואת האבקה המיובשת כדי לקבל את המסה של הדגימה המיובשת. הסר את תחמוצת הזרחן מן מייבש ולשים צלחת פטרי עם תחמוצת דאוטריום, כמו גם את הדגימה בפנים עבור לחות האבקה. חזור על הייבוש והלחות שלוש פעמים להחלפת מימן מלאה לדאוטריום.
מדדו את מסת האבקה באופן קבוע כדי לבדוק את רמת ההידרציה, וכאשר ההידרציה מעט מעל הרמה הרצויה, המתינו עד שהמסה תרד לאט. לאחר קבלת ההידרציה הרצויה, הניחו במהירות את המכסה על החלק התחתון וסגרו תחילה את מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים כדי לעצור את חילופי האדים. מניחים ומהדקים את כל הברגים הנותרים עד שלא נראה רווח בין החלק התחתון למכסה.
שקלו את מחזיק הדגימה האטום כדי לבדוק אם יש אובדן הידרציה פוטנציאלי כתוצאה מדליפות לאחר ניסוי הנייטרונים. כדי להכין את דגימת המצב הנוזלי, יש להמיס את החלבון במאגר המפורק. באמצעות מים, לקבוע את נפח הנוזל המתאים לשים במחזיק הדגימה.
לפני הטיפול בחומר כלשהו, יש לוודא שמינון הקרינה המייננת נמוך מ-100 מיקרוסיוורטים לשעה. לאחר מכן, יבש היטב את מקל הדגימה והסר כל דגימה קודמת. הניחו את הדגימה על מקל הדגימה, בדקו אם יש מרכוז נכון ביחס למרכז הקרן והכניסו את מקל הדגימה לכבשן הקריו.
כדי להשיג נתונים ב- Nomad, עבור אל כרטיסיית הביצוע וגרור ושחרר בקר קריוסטט תנור לתוך כן השיגור. כוונו את הטמפרטורה ל-200 קלווין. השתמש במצב מהיר ופסק זמן של 30 דקות כדי שלטמפרטורה יהיה זמן להתייצב.
לחץ על סמל הרענון כדי להפעיל את רמפת הטמפרטורה ברקע לרכישת נתונים במהלך ירידת הטמפרטורה. גרור ושחרר את בקר ההגדרות IN16 Doppler לתוך נקודת ההתחלה. הגדר את פרופיל המהירות למהירות מדויקת, הגדר על ידי דלתא E מקסימלית, קיזוז האנרגיה ל- 0.00 מיקרו אלקטרון-וולט, ומספר הערוצים ל- 128 כדי לקבל תצורת סריקות חלון קבועה אלסטית.
גרור ושחרר בקר ספירה לתוך נקודת הזינוק, מלא את שדה הכתוביות בשם המאפשר זיהוי קל של הנתונים, והגדר סריקות של 30 שניות עם 60 חזרות. לאחר מכן, גרור ושחרר את בקר ההגדרות של דופלר IN16 לתוך נקודת השיגור. הגדר את פרופיל המהירות לחתימה, את הגדר לפי מהירות עם ערך של 4.5 מטר לשנייה, ואת מספר הערוצים ל- 2048 כדי לקבל תצורת פיזור נייטרונים קוואזי אלסטי.
גרור ושחרר בקר ספירה ומלא את שדה הכתוביות בשם המאפשר זיהוי קל של הנתונים. הגדר סריקות של 30 דקות עם ארבע חזרות. עבור כבש הטמפרטורה, גרור ושחרר בקר קריוסטט תנור, הגדר את הטמפרטורה ל -310 קלווין, והגדר את הרמפה לנקודה עם דלתא של 0.05 קלווין למשך שש שניות.
השתמש בפסק זמן של 200 דקות. השתמש בלולאה עם 65 חזרות. בפנים, הכנס בקר הגדרות דופלר IN16, ואחריו בקר הספירה והגדר סריקה יחידה של 30 שניות.
לאחר מכן, הכנס הגדרות דופלר IN16 כפי שתואר קודם לכן, אך באמצעות היסט אנרגיה של 1.5 מיקרו אלקטרון-וולט ו-1024 ערוצים. לאחר מכן, הכנס את בקר הספירה והגדר סריקה אחת של שלוש דקות. כדי לקבל את פיזור הנייטרונים האלסטי האחרון של 312 קלווין, גרור ושחרר את הגדרות דופלר IN16 ואת בקרי הספירה שהוגדרו כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר מכן, לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את הסקריפט. סריקות החלון הקבוע האלסטי והבלתי אלסטי הראו עלייה באות בהעברת תנע נמוכה והעברת אנרגיה נמוכה, בעוד שהאות בהעברת אנרגיה גבוהה והעברת תנע נמוכה ירד. המרכז הראשוני של מקדם דיפוזיית המסה היה 15 אנגסטרום בריבוע לננו-שנייה, אשר ירד באופן אקספוננציאלי עם הזמן.
בטמפרטורות גבוהות מ-220 קלווין, מי ההידרציה סביב סיבי הטאו היו ניידים יותר באופן משמעותי מאשר סביב מונומרי הטאו. שבריר מולקולות המים שעברו תנועה תרגומית ומקדמי הדיפוזיה התרגומית והסיבוב של מולקולות המים גדלו סביב סיבים. ריכוז החלבון צריך להיות 2000 מיליגרם למ"ל או לפחות 20 מיליגרם למ"ל עבור חלבונים חלבונים עקב מגבלות פיזור גב נייטרונים משטף נייטרונים או רקע חיץ מחזיק דגימה.
פיזור לאחור של נייטרונים יושם לאחרונה, למשל, כדי להבין כיצד מים, שהם החלבונים הסביבתיים הטבעיים, יכולים להיות מוחלפים במלואם על ידי פולימר סינתטי ליישום ביוטכנולוגי כמו, למשל, אספקת תרופות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
ספקטרוסקופית פיזור ניטרונים אחוריים מספקת שיטה לא הרסנית וללא תווית לחקר הדינמיקה של חלבונים ומים ההידרציה שלהם. מאמר זה דן בשתי מחקרים המתמקדים בחלבונים עמילואידים, ובאופן ספציפי בדינמיקה המורכבת מהזמן של ליזוזים במהלך הצטברות ובדינמיקה של מים ההידרציה של טאו במהלך היווצרות סיבים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביוכימיה
רקע
- פיזור ניטרונים אחוריים מודד את הדיפוזיה הגלובלית והדינמיקה הפנימית של חלבונים.
- הוא מאפשר את המחקר על מים ההידרציה ללא נזק קרינתי.
- טכניקה זו שימושית בהבנת הדינמיקה המולקולרית בחומרים ביולוגיים.
- יש לה יישומים בחקר מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מטרת המחקר
- לחקור את הדינמיקה של חלבונים עמילואידים.
- לחקור את הדינמיקה של מים ההידרציה הקשורה להצטברות חלבונים.
- לספק תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ספקטרוסקופיית פיזור ניטרונים אחוריים
- מדידות מורכבות מהזמן
- ניתוח של הצטברות חלבונים
- חקר הדינמיקה של ההידרציה
תוצאות עיקריות
- אפיון הדינמיקה של ליזוזים במהלך הצטברות.
- תובנות לגבי הדינמיקה של מים ההידרציה של חלבון טאו.
- הוכחת האפקטיביות של פיזור ניטרונים אחוריים בחקר הדינמיקה של חלבונים.
- תרומה להבנת הבסיס המולקולרי של מחלות הקשורות לעמילואיד.
מסקנות
- פיזור ניטרונים אחוריים הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה של חלבונים.
- הטכניקה מספקת תובנות חשובות על התנהגותם של חלבונים במערכות ביולוגיות.
- הממצאים עשויים לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-resolution neutron spectroscopy enables biopharma R&D teams to interrogate protein and hydration water dynamics on the picosecond to nanosecond scale, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This nondestructive, label-free approach provides quantitative insight into molecular mobility and aggregation relevant to neurodegenerative disease targets. Integrating these measurements enhances predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of protein internal dynamics and center-of-mass diffusion for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing aggregation states and their dynamic signatures.
- Provides quantitative data to inform predictive models of disease-relevant protein behavior.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated protein samples for reproducible dynamic measurements.
- Delivers standardized, quantitative outputs for assay calibration and benchmarking.
- Enables robust comparison of compound effects on protein mobility and aggregation propensity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular dynamics data with disease-relevant phenotypes, such as amyloid aggregation.
- Supports continuity from biophysical discovery to preclinical model selection and validation.
- Provides translational biomarker candidates based on hydration water and protein mobility changes.
Pipeline & Workflow Integration
Neutron backscattering spectroscopy fits within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational research for neurodegenerative and protein-misfolding disorders.
- Discovery Biology: Quantifies protein and hydration water dynamics to clarify aggregation mechanisms and biological risk.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound screening and assay development.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of diffusion coefficients and dynamic transitions for comparative analysis.
- Translational Research: Links molecular mobility changes to disease-relevant phenotypes and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for dynamic studies across diverse protein targets and formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable dynamic measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through early de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and modalities based on dynamic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neutron spectroscopy and sample preparation for deuteration and hydration control.
- Needs access to specialized instrumentation such as neutron backscattering spectrometers and cryogenic sample environments.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and data analysis protocols.
- Adaptation across protein systems may require optimization of concentration and buffer conditions.
- Sample throughput and neutron flux limitations may constrain large-scale screening applications.
