Name: ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למד כיצד לבסס אורגנואידים מהשן האנושית לחקר ביולוגיית תאי גזע דנטליים ויישומים רגנרטיביים. מודל זה מאפשר הרחבה אמינה של תאי גזע אפיתליים ופיענוח תהליכי יצירת האמייל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל אנשי הצוות של כירורגיית הפה והסתות (MKA) של UZ Leuven, כמו גם למטופלים, על עזרתם שלא תסולא בפז באיסוף טוחנות שלישיות שזה עתה הוצאו. ברצוננו להודות גם לד"ר ריינהילדה ג'ייקובס ולד"ר אליזבת טייסקנס על עזרתם באיסוף הדגימות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- KU Leuven (BOF) ו- FWO-Flanders (G061819N). ל.ה. הוא עמית דוקטורט ב-FWO (1S84718N).

<ol><li>Yu, T., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+tooth+development%2C+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair.</a> Development (Cambridge). 147 (2), (2020).</li>
<li>Arrow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+enamel+defects%2C+caries+experience+and+oral+health-related+quality+of+life%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study.</a> Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsiadis%2C+TA+%22Dental+Stem+Cells%3A+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Potential.+Stem+Cell+Biology+and+Regenerative+Medicine%22">Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine</a>. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Orsini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+a+new+era+in+dentistry%3A+stem+cell-based+approaches+for+tooth+and+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration.</a> Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).</li>
<li>Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+dental+stem+cell-based+research+approaches%3A+the+future+of+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry.</a> Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).</li>
<li>Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+epithelial+cell+rests+of+malassez+can+differentiate+into+ameloblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).</li>
<li>Davis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epithelial+cell+rests+of+Malassez+on+the+bicentennial+of+their+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Dentistry%22%5BJournal%5D)">A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).</li>
<li>Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adult+epithelial+stem+cells+from+the+periodontal+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament.</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).</li>
<li>Kim, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+establishment+of+dental+epithelial-like+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2F+epithelial+rests+of+malassez+cell+line+from+human+periodontium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium.</a> Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+the+stem+cell+markers+in+human+hertwig%27s+epithelial+root+sheath%2FEpithelial+rests+of+Malassez+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells.</a> Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).</li>
<li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+odontogenic+epithelial+cells+derived+from+epithelial+rests+of+Malassez+possess+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).</li>
<li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+and+application+of+3D-organoid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+pituitary+as+a+novel+research+model+toward+pituitary+stem+cell+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Schutgens, F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+tools+for+understanding+biology+and+treating+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases).</a> Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).</li>
<li>Hemeryck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+human+tooth+showing+epithelial+stemness+phenotype+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).</li>
<li>Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+organoids%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Oral organoids: progress and challenges.</a> Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
<li>Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+rests+of+malassez+contain+unique+stem+cell+populations+capable+of+undergoing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).</li>
<li>Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath.</a> Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).</li>
<li>Fukumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+functions+of+enamel+matrices+in+calcified+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Dental+Science+Review%22%5BJournal%5D)">New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues.</a> Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).</li>
<li>Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERM+functions%2C+EGF+and+orthodontic+movement+or+Why+doesn%27t+orthodontic+movement+cause+alveolodental+ankylosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Press+Journal+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis.</a> Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).</li>
<li>Guajardo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+epidermal+growth+factor+in+cat+paradental+tissues+during+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Orthodontics+and+Dentofacial+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+quantitative+reduction+of+rests+of+Malassez+according+to+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age.</a> Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+Model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADULT+%28acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth%29+syndrome%3A+a+case+report+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Dermatology+Online+Journal%22%5BJournal%5D)">ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India.</a> Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).</li>
<li>Future Health Biobank. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://futurehealthbiobank.com/ch-en/">https://futurehealthbiobank.com/ch-en/</a> (2022).</li>
<li>Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-culture+of+human+intestinal+organoids+and+lamina+propria-derived+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).</li>
<li>Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+cell+communication+in+cancer+with+organoids%3A+Making+the+complex+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyisocyanide+hydrogels+as+a+tunable+platform+for+mammary+gland+organoid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation.</a> Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).</li>
<li>Mollaki, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+organoid+use%5BTitle%5D)+AND+%22BioTech%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in organoid use.</a> BioTech. 10 (3), 12(2021).</li>
</ol>

המחבר המתאים מבטיח שכל המחברים חשפו את כל ניגודי העניינים.

פרוטוקול זה מתאר את הדור היעיל והניתן לשחזור של אורגנואידים החל מהשן האנושית. למיטב ידיעתנו, זוהי המתודולוגיה הראשונה לביסוס אורגנואידים בעלי מושג נוכחי (אפיתל) החל מרקמת השיניים האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך ומציגים פנוטיפ של גבעול אפיתל השן, תוך שכפול DESCs שדווחו בעבר בתא ה-ERM של ה-DF7. יתר על כן, האורגנואידים משכפלים מאפייני DESC/ERM פונקציונליים, כולל התגלגלות של תהליך התמיינות אמלובלסט 7,25,26<sup class="...

לשיניים יש תפקידים חיוניים במזון, בדיבור וברווחה הפסיכולוגית (דימוי עצמי). השן האנושית מורכבת מרקמות שעברו מינרליזציה גבוהה בצפיפות ובקשיות שונות1. אמייל דנטלי, המרכיב העיקרי של כתר השן, הוא הרקמה המינרלית הגבוהה ביותר בגוף האדם. במהלך היווצרות אמייל (amelogenesis), כאשר השיניים מתפתחות, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים (DESCs) מתמיינים לתאים יוצרי אמייל (ameloblasts). לאחר שנוצר, האמייל הוא רק לעתים רחוקות מתוקן או מתחדש עקב אובדן apoptotic של ameloblasts בתחילת התפרצות השן1. שחזור של רקמת אמייל פגומה, כפי שנגרם על ידי טראומה או מחלה חיידקית, נעשה כיום באמצעות חומרים סינתטיים; עם זאת, אלה מוטרדים מחסרונות חשובים כגון microleakage, osseointegration נחות ומעגן, אורך חיים סופי, והיעדר תיקון פונקציונלי מלא2. לפיכך, תרבית חזקה ואמינה של DESCs אנושיים עם היכולת ליצור אמלובסטים והפוטנציאל לייצר רקמה מינרלית תהיה צעד גדול קדימה בתחום ההתחדשות הדנטלית.
הידע על פנוטיפ DESC אנושי ותפקוד ביולוגי הם נדירים 3,4,5. באופן מעניין, DESCs של שיני אדם הוצעו להתקיים במשענות תאי האפיתל של מלאסז (ERM), אשכולות תאים הנמצאים בתוך זקיק השיניים (DF), המקיף שיניים לא משוננות, ונשארים נוכחים ברצועת החניכיים סביב השורש ברגע שהשן מתפרצת1. נמצא כי תאי ERM בתרבית משותפת עם עיסת שיניים מתמיינים לתאים דמויי אמלובסט ומייצרים רקמה דמוית אמייל6. עם זאת, מחקרים מעמיקים על התפקיד הספציפי של תאי ERM ביצירת אמייל (re-) היו מוגבלים בשל היעדר מודלים מחקריים אמינים7. מערכות התרביות החוץ-גופיות הנוכחיות של ERM נפגעות על ידי אורך חיים מוגבל ואובדן מהיר של פנוטיפ בתנאים הדו-ממדיים הנמצאים בשימוש סטנדרטישל 8,9,10,11,12. לפיכך, יש צורך רב במערכת חוץ גופית הניתנת להרחבה, למידה והבחנה נאמנה של DESCs אנושיים.
במהלך העשור האחרון, טכניקה רבת עוצמה לגידול תאי גזע אפיתליאליים במבחנה יושמה בהצלחה בכמה סוגים של רקמות אפיתל (אנושיות) כדי לחקור את הביולוגיה שלהן, כמו גם מחלה 13,14,15,16. טכנולוגיה זו מאפשרת לתאי הגזע של אפיתל הרקמה להתפתח בעצמם למבנים תלת-ממדיים של תאים (כלומר, אורגנואידים) כאשר הם נזרעים לתוך מטריצה חוץ-תאית (ECM) המחקה פיגום (בדרך כלל, Matrigel) ותרבית במדיום מוגדר המשחזר את האיתות ו/או את ה-embryogenesis של נישת תאי הגזע של הרקמה ו/או את ה-embryogenesis. גורמי גדילה אופייניים הדרושים להתפתחות אורגנואידים כוללים גורם גדילה אפידרמלי (EGF) ומפעילי אתר אינטגרציה מסוג MMTV ללא כנפיים (WNT) 14,15,16. האורגנואידים המתקבלים מאופיינים בנאמנות מתמשכת בחיקוי תאי הגזע האפיתליאליים המקוריים של הרקמה, כמו גם ביכולת הרחבה גבוהה תוך שמירה על הפנוטיפ והתכונות התפקודיות שלהם, ובכך להתגבר על זמינות הרקמות האנושיות הראשוניות המוגבלות לעתים קרובות כפי שנרכשו מהמרפאה. כדי לבסס אורגנואידים, אין צורך בבידוד תאי הגזע האפיתליאליים מהרקמה ההטרוגנית (כלומר, המורכבת מסוגי תאים אחרים כגון תאים מזנכימליים) לפני התרבות, שכן תאים מזנכימליים אינם מתחברים ל-ECM או משגשגים בו, וכתוצאה מכך בסופו של דבר האורגנואידים האפיתליאלייםגרידא 13,16,17,18,19 . טכנולוגיה מבטיחה ורב-תכליתית זו הובילה לפיתוח מודלים אורגנואידיים מניפולטיביים מרקמות אפיתל אנושיות שונות. עם זאת, אורגנואידים שמקורם בשיניים אנושיות, בעלי ערך למחקר מעמיק של התפתחות שיניים, התחדשות ומחלות, עדיין לא הוקמו20,21. לאחרונה הצלחנו לפתח מודל אורגנואידי חדש כזה המתחיל מרקמת DF מטוחנות שלישיות (שיני בינה) המופקות מחולים מתבגרים19.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידיות אפיתליאליות מהשן האנושית הבוגרת (כלומר, מה-DF של הטוחנות השלישיות) (איור 1A). האורגנואידים המתקבלים מבטאים סמני גבעול הקשורים ל-ERM תוך שהם ניתנים להרחבה לטווח ארוך. באופן מסקרן, בניגוד לרוב המודלים האורגנואידיים האחרים, ה-EGF הנחוץ בדרך כלל מיותר להתפתחות וצמיחה אורגנואידית חזקה. באופן מעניין, האורגנואידים של הגבעול מראים תכונות התמיינות של אמלובלסט, ובכך מחקים תכונות ותהליכים של ERM/DESC המתרחשים ב-vivo. המודל האורגנואידי החדש והייחודי המתואר כאן מאפשר לחקור ביולוגיה של DESC, פלסטיות ויכולת הבחנה ופותח את הדלת לנקיטת הצעדים הראשונים לקראת גישות להתחדשות שיניים.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>48 בארות צלחות תחתונות שטוחות</td><td>קורנינג</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td>SML0788</tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר (דרגת תרבית תאים)</td><td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן AMELX</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>Gibco</td><td>15200018</td><td></td></tr><tr><td>B27 (ללא ויטמין A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>קלטת</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7202191 קטלאז מכבד בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>כולרה טוקסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>CK14 נוגדן</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher 375353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12 ללא Fe</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>אבקת DMEM גלוקוז גבוה</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 -</td> תחנת עבודה להטמעת 10 מ"ל<td></td></tr><tr><td>, 220 עד 240 Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט, &ge; 99.8% (EtOH)</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (= FGF בסיסי)</td><td>R& D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>כולל 1% &בטא;-מרקפטואתנול מומס במאגר ליזה</td></tr> זכוכית <tr><td>פסטר פיפטה</td><td>ניקו מנגנוני</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632 (מעכב ROCK, RI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 נוגדן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל (גורם גדילה מופחת; ללא פנול אדום)</td><td>שקופית מיקרוסקופ 15505739</td><td></td><td></td>קורנינג</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV יחידת מסנן מזרק, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>עיט בינוני חיוני מינימלי (ואלפא; MEM)</td> <td>עכבר סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>IgG (Alexa 555) נוגדן משני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>נוגין</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן P63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>עט פאפ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z377821-1EA</td><td>עט סימון</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA), 16%</td> <td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקוק)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td> <td>פטריקורנינג</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (P20, P200, P1000)</td><td>אפנדורף או אחרים</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת העברת פלסטיק (3.5&nbsp; mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>ארנב IgG (Alexa 488) נוגדן משני</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (p38i)</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>אזמל (להב כירורגי)</td><td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>תבניות סיליקון (בלוק חימום)</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>נתרן-פירובט (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher מערכת</td><td>PCR מדעית</td><td></td> בזמן אמת</tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP יחידת מסנן עליון צינור צנטריפוגה סטרילי, 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 1000 &mu; קצות פיפטה L עם פילטר</td><td>גריינר</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 20 &mu; קצות פיפטה L עם פילטר</td><td>גריינר</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 200 &mu; קצות פיפטה L עם ובלי פילטר</td><td>גריינר</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי H2O</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>מלח סטרפטומיצין סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III סינתזת גדיל ראשון סופרמיקס</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>ערכת שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>מעבד רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12505356</tr><tr><td>Transferrin</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית + DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td><td>Antifade מדיום הרכבה עם DAPI</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>Biotechne (Tocris)</td> <td>5036-WN-500</td><td></td></tr><tr><td>קסילנים, 99%, לביוכימיה והיסטולוגיה</td><td>VWR</td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

שיניים הן בעלות חשיבות מרכזית בחיים לא רק עבור מסטיק מזון ודיבור אלא גם עבור רווחה פסיכולוגית. הידע על התפתחות השיניים והביולוגיה האנושית הוא נדיר. בפרט, לא הרבה ידוע על תאי הגזע האפיתליאליים של השן ותפקודם. הצלחנו לפתח מודל אורגנואידי חדשני המתחיל מרקמת השן האנושית (כלומר, זקיק שיניים, מבודד משיני בינה שנלקחו). האורגנואידים ניתנים להרחבה באופן חזק וארוך טווח ומשחזרים את תא תאי הגזע המוצעים של אפיתל השיניים האנושיות במונחים של ביטוי סמנים כמו גם פעילות תפקודית. בפרט, האורגנואידים מסוגלים לפרוש תהליך התמיינות אמלובלסט כפי שמתרחש in vivo במהלך אמלוגנזה. מודל אורגנואידי ייחודי זה יספק כלי רב עוצמה לחקר לא רק התפתחות השיניים האנושיות אלא גם פתולוגיה דנטלית, ועשוי לסלול את הדרך לטיפול בשיניים רגנרטיביות. החלפת שיניים אבודות בשן ביולוגית המבוססת על מודל אורגנואידי חדש זה עשויה להיות חלופה מושכת להשתלה הסטנדרטית הנוכחית של חומרים סינתטיים.

התפתחות אורגנואידית בשיניים אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביסוס תרביות אורגנואידיות מרקמת DF אנושית שנרכשו בעקבות עקירת שן בינה (איור 1A). DF מבודד מנותק באופן אנזימטי ומכני. התאים המתקבלים מתורבתים בתרבית בתוך BMM במדיה שהוגדרה אמפירית להתפתחות וצמיחה אופטימלית של אורגנואידים (תווך אורגנואידי שן; טום)19.
האורגנואידים מתפתחים בדרך כלל תוך שבועיים לאחר זריעת תאי DF (P0; איור 2א). האורגנואידים ני...

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידים אפיתליאליות החל מהשן האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה חזקה ומשקמים מחדש את תאי הגזע האפיתליאליים של השן, כולל יכולת התמיינות האמלובלסט שלהם. המודל האורגנואידי הייחודי מספק כלי מבטיח לחקר הביולוגיה הדנטלית האנושית (תאי גזע) עם פרספקטיבות לגישות התחדשות שיניים.

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

מודל אורגנואידי חדש זה שמקורו בשיניים אנושיות מספק את הכלי רב העוצמה הראשון לפענוח הביולוגיה של תאי גזע דנטליים אנושיים עם פרספקטיבות כלפי יישומים רגנרטיביים של שיניים. נכון לעכשיו, מודל אורגנואיד השן הזה הוא הכלי היחיד הזמין לגדל ולהרחיב באופן אמין וחזק תאי גזע אפיתל שן אנושיים. ניתן ליישם פרוטוקול אורגנואידי זה כדי לבסס מודלים מחקריים, לא רק משיניים בריאות, אלא גם משיניים חולות כגון גידולים דנטליים והשפעה חיידקית.חקר מודלים של מחלות כאלה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות חדשות. מודל אורגנואידי זה מסייע מאוד בפענוח תהליך היווצרות האמייל בשן האנושית, ועשוי לאפשר בנייה של חלקי שיניים כגון אמייל למטרות גנרטיביות. תדגים את ההליך תהיה לארה המריק, דוקטורנטית בקבוצת המחקר שלי.כדי להתחיל, לאסוף את הטוחנות השלישיות עם זקיקי שיניים הקשורים במדיום האיסוף הניח על קרח ולהעביר את התוכן של הצינורות לצלחת פטרי. החזיקו את השן עם פינצטה ובודדו בזהירות את הזקיקים הדנטליים באמצעות להב כירורגי. שטפו את הדם הנותר מהזקיקים הדנטליים על ידי הנחת רקמות הזקיקים הדנטליים לזמן קצר בבאר הראשונה של 70% אתנול למשך 20 שניות, ואז העבירו אותה לצלחת האתנול הבאה למשך 20 שניות והלאה לבאר האתנול השלישית.יש להמשיך לשטוף אותו בבארות מלוחות עם מאגר פוספט שלוש פעמים ולאחר מכן לשטוף את הזקיקים הדנטליים בשלושת הזקיקים הדנטליים הנותרים לאסוף בארות בינוניות למשך 20 דקות לכל היותר. מעבירים את הזקיקים הדנטליים השטופים לצלחת פטרי חדשה. חותכים חתיכה קטנה של אחד הזקיקים הדנטליים לקיבוע פרפורמלדהיד ומאחסנים אותה בצינור מיקרו-סנטריפוג המכיל 500 מיקרוליטרים של מדיום איסוף למשך שש שעות לכל היותר.מצמצמים את שאר זקיקי השיניים לחתיכות קטנות ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטרים המכיל ארבעה מיליליטרים של מדיום דיסוציאציה מוכן מראש, ואז דוגרים את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמבט מים. כל 15 דקות, פיפטה את מדיום הדיסוציאציה של זקיקי השיניים ומערבבים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה מזכוכית כדי להאיץ את התפוררות הרקמה. כאשר חתיכות של זקיקים דנטליים כבר לא נצפות, המשיכו עם הדיסוציאציה באמצעות פיפטת פסטר מצומצמת ומלוטשת באש.בינתיים, להכין 10 מיליליטרים של בינוני A המכיל 100 מיקרוליטרים של DNase ולהוסיף חמישה מיליליטרים של מדיום זה לכל צינור עם זקיקי שיניים מנותקים. דגירה לדקה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את המסנן במיליליטר אחד של A בינוני.שלבו את מספר הצינורות של זקיקי שיניים מנותקים ממטופל אחד בשלב זה וצנטריפוגה של תרחיף התא המסונן ב-200 פעמים גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.הסר את ה-supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור במיליליטר אחד של מדיום מוגדר ללא סרום והעבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מיליליטר. חשב את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי וחשב את מספר הבארות שניתן לזרוע.התמהיל הסופי מורכב מתרחיף תאים ומטריצת קרום מרתף ביחס של 30 עד 70. הסר את הכמות המתאימה של סופרנטנט ובצע בו החייאה איטית כדי לקבל יחס של 70 ל-30 של מטריצת קרום מרתף קר כקרח לתרחיף התא לציפוי. לאחר ההחייאה במטריצת קרום המרתף, שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח כדי למנוע התמצקות של מטריצת ממברנת המרתף.פיפטה את 20 המיקרוליטרים של טיפות מטריצת קרום המרתף במרכז צלחת התרבית המחוממת מראש של 48 בארות. הופכים את הצלחת על פיה ומניחים אותה כך שתתמצק בחממת פחמן דו חמצני של 1.9% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסיפו את מעכב קינאז ואמפוטריצין B הקשורים ל-rho למדיום האורגנואידי של השן והוסיפו את המדיום לפני החימום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.קח את צלחת 48 הבאר מהאינקובטור. מניחים אותה זקופה ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של המדיום המוכן מראש לכל באר עם טיפת מטריצה של קרום מרתף המכילה את התאים ומחזירים את הצלחת לחממת הפחמן הדו-חמצני. כדי לרענן את המדיום, הטה את הצלחת בזווית של 45 מעלות.הסר בעדינות את המדיום הקודם, תוך הימנעות מלגעת בטיפת מטריצת ממברנת המרתף והוסף 250 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי חדש של שיניים מעודנות מראש כל יומיים-שלושה. כדי לבצע את המעבר של האורגנואידים, להסיר את המדיום מן הבארות עם אורגנואידים מאגר עד ארבע בארות confluent. כדי לאסוף את האורגנואידים, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של תווך מוגדר ללא סרום קר כקרח לבאר ישירות על טיפת מטריצת הממברנה, וטפטפו שוב ושוב את המדיום למעלה ולמטה עד שהטיפה כולה תפורק.אם בארות מרוכזות, העבירו את 400 המיקרוליטרים מהבאר הראשונה לבאר הבאה כדי לעקור את האורגנואיד המכיל טיפות. מעבירים את מכלול האורגנואידים המנותקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר וחוזרים על התוספת של תווך מוגדר ללא סרום עד שכל המבנים האורגנואידים נאספים מהבארות. צנטריפוגה זה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס.מוציאים את הסופרנט מצינור הצנטריפוגה ומחזירים את הכדור באליקוט מוכן מראש של טריפלה אקספרס. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח כדי להשבית את האנזים ולצנטריפוגה שלו ב-200 פעמים גרם במשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant.מצפים מראש קצה עם תווך מוגדר ללא סרום קר כקרח ומניחים מחדש את הכדור האורגנואידי במצב סטרילי. השעו מחדש את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח לשיטת המעבר הנמוך. דחפו את קצה הפיפטה המרוקן לחלוטין לתחתית צינור המיקרו צנטריפוגה כדי להקטין את קוטרו.פיפטה למעלה ולמטה במשך חמש דקות כדי לשבש מכנית את האורגנואידים. עבור שיטת המעבר הגבוהה יותר, החיזרו את הכדור ב-700 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח עם קצה P1000. הוסיפו טיפ P200 לקצה P1000 זה והתכוננו מראש עם מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח.מנע היווצרות בועות אוויר על ידי התאמת הגדרת עוצמת הקול של הפיפטה. לשאוף לפחות 90% מהנפח הבינוני עם אורגנואידים ופיפטה למעלה ולמטה במשך חמש דקות כדי לשבש מכנית את האורגנואידים. האורגנואידים מתפתחים בדרך כלל שבועיים לאחר זריעת תאי זקיק דנטליים.האורגנואידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך עד 11 קטעים. זריעה של כ-20, 000 תאים לכל טיפת מטריצת קרום מרתף מניבה צפיפות אופטימלית של אורגנואידים, בעוד שזריעה של מספרי תאים גבוהים יותר מובילה לצמיחת אורגנואידים לא אופטימלית עם אורגנואידים דומים בצפיפות גבוהה מדי בשל חוסר מספיק מקום לגדול. האורגנואידים שפותחו מראים מראה צפוף ומכילים תאים המציגים יחס נוקלוציטופלסמי גבוה.יתר על כן, האורגנואידים מבטאים את סמן ERM cytokeratin 14 המאשר את מקור האפיתל שלהם וסמני ERM מוצעים אחרים, כגון P63, CD44 ואינטגרין אלפא-6. אורגנואידים מבטאים SOX2, סמן DESC ידוע בעכברים. מעניין, המרכיב העיקרי של מטריצת האמייל, amelogenin, לידי ביטוי גם באורגנואידים.האורגנואידים שומרים על פנוטיפ גבעול ה-ERMM שלהם במהלך המעבר, כפי שמוצג על ידי הביטוי היציב של סמנים. עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים לטווח ארוך, חיוני להשתמש בשיטות המעבר המומלצות שמשמעותן או במעבר הנמוך או בשיטות המעבר הגבוהות יותר. לאחר היווצרותם, ניתן להשתמש באורגנואידים כדי לבחון את תהליך האמלוגנזה עוד יותר ותצהיר מטריצת האמייל אינו מושג כיום במחקר רפואת שיניים.טכניקה זו מאפשרת לחקור את הביולוגיה של תאי גזע אפיתל דנטליים, את תהליך היווצרות האמייל ואת האינטראקציה עם מזנכימי השן, יחסי גומלין החיוניים להיווצרות נכונה של שיניים.

establishing-organoids-from-human-tooth-as-powerful-tool-toward

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

השן החותכת העכבר הולך ומתרחבת מספקת מודל ללימוד חידוש רקמות שיניים מתאי גזע שיניים אפיתל (DESCs). מערכת חזקה בעקביות ובאמינות קבלת תאים אלה מהשן החותכת והרחבתן במבחנה הוא דיווח כאן.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

פרוטוקול זה מציג שיטה לתרבית ולצמיחה תלת-ממדית של תאים דמויי אמלובלסט במיקרו-כבידה כדי לשמור על צורתם המוארכת והמקוטבת, כמו גם על ביטוי חלבונים ספציפיים לאמייל. כמו כן מתוארים תנאי תרבית לתרבית של מבנים הנדסיים פריודונטליים ואיברי ריאה במיקרו-כבידה.

ריבוי תאים ואיברים דנטליים ונשימתיים במיקרו-כבידה

זקיק השיניים מכיל אוכלוסייה אפיתל ותאים mesenchymal. אוכלוסיית האפיתל נבחרה מתוך אוכלוסיית תאי הזקיק הדנטליים ההטרוגניים על ידי מתן מדיום תרבותי מובהק. תאי אפיתל שרדו ויצרו מושבות במדיום נטול סרום.

בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

דוגמה לטיפול גנטי אדנו-ויראלי בקרניות אנושיות בתרבית איברים סוכרתיים מוצגת לקראת נורמליזציה של ריפוי פצעים מושהה והפחתה ניכרת בביטוי סמני תאי גזע אפיתל בקרניות אלה. הוא גם מתאר את האופטימיזציה של תהליך זה בתרביות אפיתל לימבליות מועשרות בתאי גזע.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

למד כיצד לבסס אורגנואידים מהשן האנושית לחקר ביולוגיית תאי גזע דנטליים ויישומים רגנרטיביים. מודל זה מאפשר הרחבה אמינה של תאי גזע אפיתליים ופיענוח תהליכי יצירת האמייל.

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

גלה סרטונים נוספים