Name: חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: חקור מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של כוחות מנוע חלבוניים בהקשר היררכי של ציטוסקלטון תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מלגת המחקר של מועצת הסטודנטים לתארים מתקדמים של אוניברסיטת מיסיסיפי (OA), מכללת המצטיינים של אוניברסיטת מיסיסיפי סאלי מקדונל-בארקסדייל (JCW, JER), קונסורציום מענקי החלל של מיסיסיפי תחת מענק מספר NNX15AH78H (JCW, DNR), ואיגוד הלב האמריקאי תחת מענק מספר 848586 (DNR).

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

מחקר במבחנה באמצעות פינצטה אופטית בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית בוצע כדי לחקור את הדינמיקה של הרכבי מיוזין המקיימים אינטראקציה עם חוטי אקטין. צרורות אקטין-מיוזין-אקטין הורכבו באמצעות מיוזין שריר II, רודמין אקטין בתחתית הצרור ועל משטח הכיסוי, וסיבי אקטין בעלי תווית של 488 ביוטינילים בחלק העליון של הצרור. חלבון אקטין משרירי ארנב עבר פולימריזציה וייצוב באמצעות מאגרי אקטין כלליים (GAB) ומאגרי פילמור אקטין (APB). GAB ו-APB חייבים להיות מוכנים טריים מדי יום במעבדה באמצעות ATP, מאגר FC ומאגר TC. מיוזין שריר II שימש ליצי...

חלבונים מוטוריים חיוניים לחיים, וממירים אנרגיה כימית לעבודה מכנית 1,2,3. מנועי מיוזין מתקשרים עם חוטי אקטין על ידי נקיטת צעדים לאורך החוטים הדומים למסלול, והדינמיקה של רשתות אקטין-מיוזין מבצעת התכווצות שרירים, תנועתיות תאים, טבעת התכווצות במהלך ציטוקינזיס ותנועת מטען בתוך התא, בין שאר המשימות החיוניות 3,4,5,6,7,8 . מאחר שלמיוסינים יש כל כך הרבה תפקידים חיוניים, כשל בתפקוד של רשת המיוזין-אקטין יכול להוביל להתפתחות מחלות, כגון מוטציות בשרשרת הכבדה של המיוזין הגורמות להיפר-התכווצויות יתר של הלב בקרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM)9,10,11,12,13,14 . בהתכווצות שרירים, מנועי מיוזין בודדים משתפים פעולה זה עם זה על ידי עבודה כאנסמבל כדי לספק את האנרגיה המכנית הנדרשת המבצעת את ההחלקה היחסית של AFs 4,15,16,17,18. מנועי מיוזין יוצרים גשרים צולבים בין AFs ומשתמשים בשינויים קונפורמיים עקב המחזור המכנוכימי שלהם כדי לנוע באופן קולקטיבי לעבר הקצה התיל של החוטים המיושרים 17,18,19,20,21.
פיתוח מבחני תנועתיות כמותיים במבחנה ברמת ה-SM תוך שימוש בטכניקות כגון השמנה אופטית הקל על איסוף פרטים חסרי תקדים על האופן שבו מנועי מיוזין בודדים מתפקדים, כולל מדידת ייצור כוח SM וגדלי צעדים 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. פיתחו את בדיקת הלכידה האופטית "שלושה חרוזים" או "משקולת" כדי לחקור את מכניקת ייצור הכוח של מנועי מיוזין II בודדים23,31. מכיוון שמיוזין שריר II עובד בצוותים כדי לכווץ AFs אך אינו מעובד ברמת SM, היה צורך לארגן מחדש את כיוון בדיקת הלכידה האופטית מהגישה הקלאסית של חרוזים הקשורים למנוע32. כדי ליצור את בדיקת המשקולת, שתי מלכודות אופטיות שימשו להחזקת AF מעל מנוע מיוזין הקשור לחרוז המחובר לכיסוי, ותפוקת הכוח על ידי המנוע היחיד נמדדה באמצעות תנועות של המיקוד האוטומטי בתוך מלכודת23.
עם זאת, כוחות SM ושימוש בכיוון בדיקה של מנוע יחיד/נימה בודדת אינם נותנים תמונה מלאה על יצירת כוח ברמת המערכת מכיוון שחלבונים מוטוריים רבים, כולל מיוזין II, אינם פועלים בבידוד ולעתים קרובות אינם מתפקדים כסכום חלקיהם 15,16,17,32,33,34,35,36 . מבנים מורכבים יותר הכוללים יותר ממנוע אחד המקיים אינטראקציה עם יותר מחוט אחד נחוצים כדי להבין טוב יותר את הסינרגיה של רשתות המיוזין וחוטי האקטין15,32. כיוון בדיקת המשקולת נוצל כדי לחקור יצירת כוח אנסמבל קטן על ידי חיבור מיוזינים מרובים לחרוז או שימוש בחוט עבה מיוזין המחובר למשטח ומאפשר למנועים לקיים אינטראקציה עם המיקוד האוטומטיהתלוי 4,23,34,37,38,39,40.
מבחני אנסמבל קטנים אחרים כוללים בדיקת גלישה של נימה במבחנה שבה מנועי מיוזין מצופים על משטח כיסוי, וחרוז הקשור ל- AF משמש כדי לחקור את הכוח שנוצר על ידי צוות המנועים 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . בשני המקרים הללו, המיוזינים קשורים למשטח קשיח - חרוז או כיסוי - ומשתמשים במיקוד אוטומטי אחד. במקרים אלה, המנועים אינם מסוגלים לנוע בחופשיות או לתקשר זה עם זה, וגם קיום מיוסינים הקשורים באופן נוקשה אינו משקף את הסביבה התואמת, ההיררכית, שבה המנועים יעבדו יחד בסרקומר32. מחקרים קודמים הציעו כי מיוזין II יכול לחוש את סביבתו ולהסתגל בהתאם לשינויים בתנאי ריכוז ויסקואלסטיים או מוטוריים על ידי שינוי מאפיינים כגון ייצור כוח ויחס חובה41,44,45. לפיכך, יש צורך לפתח מבחן לכידה אופטי המטפח ולוכד תקשורת מוטורית ותאימות מערכת כדי לצייר תמונה מציאותית יותר של היסודות המכניסטיים של יצירת כוח הרכב מיוזין II.
כאן, פיתחנו שיטה לשילוב מבנה היררכי במבחנה עם לכידה אופטית על ידי יצירת צרורות אקטומיוזין או סנדוויצ'ים המורכבים ממנועי מיוזין מרובים המקיימים אינטראקציה בין שני חוטי אקטין. לגיאומטריה מודולרית זו יש את היכולת לחקור ישירות כיצד גורמים מולקולריים וסביבתיים משפיעים על יצירת כוח מיוזין בהרכב. יתר על כן, לחקר מנגנוני יצירת הכוח באמצעות הרכבי אקטין-מיוזין אלה יש פוטנציאל לסייע במידול ובהבנת האופן שבו משימות תאיות בקנה מידה גדול, כגון התכווצות שרירים, מתפשטות מהרמה המולקולרית 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>חלבון אקטין (ביוטין): שריר</td><td>השלד שלד</td><td>AB07-A</td><td>חלבון אקטין ביוטיניל</td></tr><tr><td>חלבון אקטין, שריר שלד ארנב</td><td>שלד</td><td>AKL99-A</td><td>חלבון אקטין</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>מייצב אקטין וצבע Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP413-25</td><td>נדרש לאקטין הרכבה ותנועתיות מיוזין</td></tr><tr><td>בטא-D-גלוקוז</td><td>פישר מדעי</td><td>MP218069110</td><td>חלק ממערכת ניקוי חמצן המשמשת להפחתת פוטוהלבנה במהלך הדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>חוסם דרגת ספיגה (קזאין)</td> <td>Biorad</td><td>1706404</td><td>משמש לחסימת פני השטח מקשירה לא ספציפית</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>סידן כלורי, מספק את השליטה הדרושה על הדינמיקה של רשת מיוזין אקטין</td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>פישר מדעי</td><td>ICN10040280</td><td>חלק ממערכת ניקוי חמצן המשמשת להפחתת פוטוהלבנה במהלך הדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>משמש לייצור תאי זרימה</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher מדעי</td><td>AC327190010</td><td>משמש להכנת חיץ</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A4094</td><td>Regent המשמש לניקוי כיסויים</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>פישר מדעי</td><td>34-538-610KU</td><td>חלק ממערכת ניקוי חמצן המשמשת להפחתת פוטוהלבנה במהלך הדמיית פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>משמש להכנת חיץ</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>משמש לחרוט כיסויים ולהתאים חוצץ pH</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>משמש להכנת חיץ</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר מדעי</td><td>12-544-2</td><td>משמש לייצור תאי זרימה</td></tr><tr><td>חלבון מיוזין II: שריר שלד ארנב</td><td>שלד</td><td>MY02</td><td>חלבון מוטורי מיוזין באורך מלא מבודד משריר השלד של ארנב</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>מכשיר לכידה אופטי</td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td>מתקנים הידבקות של חוטי אקטין על משטח הזכוכית של הכיסוי</td></tr><tr><td>רודמין פלואידין</td><td>שלד ציטולוגי</td><td>PHDR1</td><td>מייצב אקטין וכתם פלואורסצנטי רודמין</td></tr><tr><td>חרוזי סטרפטווידין, 1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>ידית לכידה אופטית</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher מדעי</td><td>PR H5121</td><td>משמש להכנת מאגר</td></tr></tbody></table>

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

מיוסינים הם חלבונים מוטוריים המבצעים הידרוליזה של ATP כדי לצעוד לאורך מסלולי נימה אקטין (AF) והם חיוניים בתהליכים תאיים כגון תנועתיות והתכווצות שרירים. כדי להבין את מנגנוני ייצור הכוח שלהם, מיוזין II נחקר הן ברמת המולקולה הבודדת (SM) והן כצוותים של מנועים במבחנה באמצעות שיטות ביופיזיות כגון לכידה אופטית.
מחקרים אלה הראו שהתנהגות של יצירת כוח מיוזין יכולה להיות שונה מאוד כאשר עוברים מרמת המולקולה הבודדת בסידור של שלושה חרוזים לקבוצות של מנועים העובדים יחד על משטח חרוז קשיח או כיסוי בסידור גלישה. עם זאת, מבני בדיקה אלה אינם מאפשרים להעריך את הדינמיקה הקבוצתית של מיוזין בתוך היררכיה מבנית ויסקו-אלסטית כפי שהיו עושים בתוך תא. פיתחנו שיטה המשתמשת בפינצטה אופטית כדי לחקור את המכניקה של יצירת כוח על ידי הרכבי מיוזין המקיימים אינטראקציה עם חוטי אקטין מרובים.
צרורות אקטומיוזין אלה מאפשרים חקירה בסביבה היררכית ותואמת, הלוכדת תקשורת מוטורית ותפוקת כוח אנסמבל. האופי הניתן להתאמה אישית של הבדיקה מאפשר לשנות את תנאי הניסוי כדי להבין כיצד שינויים בהרכב המיוזין, בצרור חוטי האקטין או בסביבה הסובבת גורמים לתפוקות כוח שונות.

תאי זרימה המכילים את מערכות צרור האקטומיוזין הם בעלי עיצוב סטנדרטי, המורכב משקופית מיקרוסקופ וכיסוי חרוט המופרדים על ידי תעלה העשויה מסרט דביק דו-צדדי (איור 1). לאחר מכן, הבדיקה נבנית מהכיסוי באמצעות מבואות מבוימים כמתואר בפרוטוקול. הבדיקה הסופית מורכבת מחוטים של אקטין המסומנים ברודמין; ריכוז המיוזין הרצוי (1 μM שימש לתוצאות המייצגות באיור 2 ובאיור 3); ביוטינילציה, אלקסה פלואור 488 עם תווית חוטי אקטין; 1 מיקרומטר חרוזי סטרפטאווידין;...

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

חקירת התנהגות אקטין באמצעות פרוטוקול זה היא משמעותית מכיוון שהיא מאפשרת למשתמש לחקור את הדינמיקה של אנסמבל החלבון המוטורי באמצעות הדיוק של השמנה אופטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת למדוד מכניקת מיוזין בתוך היררכיה מבנית של אקטין, בניגוד לכיוון החד-מנועי המסורתי של נימה בודדת המשמש בניסויי השמנה אופטיים רבים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא אופיו המודולרי, המאפשר למשתמש להתאים אישית את הבדיקה למערכת השלד ההיררכית לפי בחירתם.כדי להתחיל, להחיל שתי חתיכות של סרט דביק דו צדדי על אמצע מיקרוסקופ להחליק שלושה עד ארבעה מילימטרים זה מזה. לאחר מכן קרעו או חתכו את הסרט העודף שתלוי מקצה השקופית. לאחר מכן, הוסף את הכיסוי המצופה PLL על גבי הקלטת בניצב לציר הארוך של שקופית המיקרוסקופ כדי ליצור ערוץ.באמצעות צינור קטן כדי לדחוס את הכיסוי להחליק על הקלטת והמיקרוסקופ, להחליק ביסודיות עד שהקלטת היא שקופה, להבטיח כי אין בועות בסרט כמו זה יכול לגרום דליפה מערוץ הזרימה. הוסיפו 15 מיקרוליטרים של הרודמין אקטין המדולל לתא הזרימה PLL ותפתילו את התמיסה העודפת דרך תא הזרימה, אך אל תאפשרו לתעלת הזרימה להתייבש. לאחר מכן, לדגור במשך 10 דקות בתא לחות.לאחר מכן, הכינו תמיסת קזאין של מיליגרם אחד למיליליטר במאגר פילמור אקטין והוסיפו 15 מיקרוליטרים של התמיסה כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הרכיבים הבאים. לאחר מכן, לדגור במשך חמש דקות בתא לחות. לאחר מכן, הוסיפו את הריכוז הרצוי של מיוזין לתרחיף האקטין והחרוזים המוכנים לשימוש ביוטינילי וערבבו בעדינות עם קצה פיפטה.לאחר מכן, מיד להוסיף 15 microliters של ההשעיה יחד עם ריכוז מיוזין הרצוי לתא הזרימה דגירה במשך 20 דקות. לאחר מכן, אטמו את הקצוות הפתוחים של תא הזרימה עם לק כדי למנוע אידוי במהלך ניסויי הדמיה ולכידה אופטית. לאחר שהמערכת מוכנה, הפעל את הלייזר באמצעות לחצן הפעלת הלייזר בפינה השמאלית התחתונה של המסך ל -50 מילי-וואט ותן לו להתייצב במשך 30 דקות.לחץ ברצף על כפתורי התאורה, המצלמה, המטרה והתנועה הבימתית בתוך התוכנה כדי להעלות חלונות אלה לצפייה ומניפולציה במהלך הניסוי. הפעל את תאורת המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה/כיבוי והגדרתו לעוצמה מרבית על-ידי לחיצה וגרירה של הסרגל כל הדרך ימינה. פתח את אזור הדגימה והסר את מחזיק הדגימה משלב המיקרוסקופ.לאחר מכן הוסף את תא הזרימה ואבטח אותו באמצעות מחזיקי דגימת המתכת, כדי להבטיח כי החלקת הכיסוי נמצאת בתחתית. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של מי RO למרכז המטרה התחתונה והכניסו מחדש את שלב הדגימה. לאחר מכן הרם את המטרה התחתונה באמצעות L2 בשלט הרחוק עד שחרוז המים ייגע במחליק הכיסוי.לאחר מכן, הורד את המטרה העליונה עד שתגיע לכמחצית המרחק לתא הזרימה באמצעות R2 בשלט הרחוק. לאחר מכן, הוסיפו 170 מיקרוליטרים של מי RO לחלק העליון של תא הזרימה ישירות מתחת למטרה העליונה והורידו את המטרה העליונה עד שהיא שוברת את מתח הפנים של המים ויוצרת מניסקוס. לאחר מכן, הזז את שלב המיקרוסקופ באמצעות כרית החצים בשלט הרחוק עד להגעה לקצה הקלטת הסמוכה לערוץ הזרימה ולאחר מכן סגור את דלת הדגימה.באמצעות חלון המטרה במסך, הבא את קצה הקלטת ואת המיקוד על-ידי העלאת המטרה התחתונה בשם מטרת לייזר על-ידי לחיצה על החץ העליון והמטרה העליונה על-ידי לחיצה על חץ תחתון באמצעות הפקדים שעל המסך. מצא חרוז צף ולכוד אותו על ידי לחיצה על כפתור תריס המלכודת, אשר יפתח את התריס ויאפשר ללייזר ההשמנה לפגוע בדגימה. לאחר מכן, לחץ על סמן המלכודת על המסך וגרור אותו כדי להזיז את מיקום לייזר ההשמנה.לאחר ההשמנה, כייל את החרוז על ידי לחיצה על כפתור הכיול. לאחר מכן, לחץ על הגדרות והקלד את קוטר החרוז והטמפרטורה של השלב שנמצא בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנה. לאחר מכן, לחץ על מלכודת 1, ולאחר מכן על אות X ובצע את התאמת תדר הפינה על ידי לחיצה על הפעלה.לאחר מכן לחץ וגרור בתוך החלון כדי לייעל את התאמת הפונקציה. לאחר מכן, לחץ על השתמש בו עבור ערכי רגישות ונוקשות ולאחר מכן קבל ערכים. לאחר מכן, סגור את החלון.מצא צרור אקטומיוזין על-ידי חיפוש חרוזים הקשורים ל-AFs על פני השטח של החלקת הכיסוי ועל-ידי חיפוש שני ה-AFs הפלואורסצנטיים המותאמים לשפות אחרות. הפעל את מקור האור הלבן והשתמש בקוביית הסינון המתאימה כדי לדמות כל נימה של אקטין על ידי סיבוב הצריח. לאחר האימות, לכוד את החרוז המחובר לחוט הלהט העליון של החבילה על ידי לחיצה על כפתור תריס המלכודת.לאחר מכן, הקלט את הנתונים על ידי לחיצה על כפתור אוסצילוסקופ באמצעות הפקדים שעל המסך. כדי להציג באופן חזותי מדידות מבלי להקליט את הנתונים, לחץ על התחל ולאחר מכן לחץ על שמירה אוטומטית כדי לשמור את כל הנתונים. כדי להקליט מדידות, לחץ על התחל להקליט ובחר אילו נתונים יוצגו באופן חזותי בזמן אמת על ידי בחירה מהתפריט הנפתח X Signal או Y Signal.עקבות הכוח של מנועי מיוזין שלדיים המייצרים כוח בתוך ההיררכיה המבנית של אקטין במבחנה הבנויה מפגינים רמפה יציבה בכוח עד שמגיעים לרמה של יותר משתיים עד חמש דקות. עם זאת, הוא ציין גם כי כמה צרורות actomyosin שאינם מייצרים כל כוח נטו עקבות הכוח מופיעים כרעש בסיסי או לא מציגים עלייה משמעותית נטו בכוח מעל 90 שניות עקב ריכוז נמוך של מנוע או כיוון מקביל שלילי של החוטים. פיתוח פרוטוקול זה יסלול את הדרך לבניית מבחנים ציטוסקטליים מורכבים יותר במבחנה, שיסייעו עוד יותר במודלים של משימות תאיות בקנה מידה גדול, כגון חלוקת תאים והתכווצות שרירים מלמטה למעלה.

probing-myosin-ensemble-mechanics-actin-filament-bundles-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

חקור מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של כוחות מנוע חלבוניים בהקשר היררכי של ציטוסקלטון תאי.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

גלה סרטונים נוספים